蘆薈素對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的作用機(jī)制

齊平平， 徐祖清， 金 華

(1.天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192；2.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518000；3.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000)

隨著移植手術(shù)的開(kāi)展，缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)導(dǎo)致的危害越來(lái)越嚴(yán)重，逐漸受到人們的關(guān)注[1]。腎缺血再灌注損傷是指腎臟在短時(shí)間缺血后重新獲得血液灌注，腎臟組織和細(xì)胞損傷沒(méi)有得到緩解反而進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，為腎移植過(guò)程中的主要病理生理過(guò)程[2]，炎癥反應(yīng)及凋亡在其發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，抑制腎缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)與凋亡是減輕該病的重要手段[3]。蘆薈素是蘆薈主要有效成分，具有抗炎、抗衰老、抗菌、抗氧化等多種作用[4]，對(duì)心、腦缺血再灌注損傷均具有保護(hù)作用[5-6]。本研究觀察蘆薈素對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討它與炎癥反應(yīng)及凋亡的關(guān)系，以期為相關(guān)臨床防治提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠60只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量280～320 g，購(gòu)于上海菲諾克生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2018-0005，自由飲水進(jìn)食，相對(duì)濕度50%～60%，溫度20～25 ℃，置于通風(fēng)良好的環(huán)境中飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)延邊大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(YBU-2017-045)。

1.2 試劑與藥物 蘆薈素(批號(hào)2020031601)，純度99%，購(gòu)自湖北實(shí)順生物科技有限公司。尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，Scr)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào)JN5173、JN5522)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇江萊生物技術(shù)有限公司(批號(hào)JL45594、JL20884、JL20896)；TUNEL組織凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào)C1091)；Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司(批號(hào)10296010)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司(批號(hào)K1691、4432346)；兔源B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X，Bax)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)多克隆抗體(一抗)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(批號(hào)ab196495、ab53154、ab182651、ab8805、ab38449、ab8227)；羊抗兔IgG抗體(二抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(批號(hào)ZB-2306)。

1.3 儀器 7600全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；RM2126切片機(jī)、JB-L5包埋機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；CX21顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Mithras LB943酶標(biāo)儀(北京科瑞恩特科技有限公司)；CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)；DYC-SCZ7蛋白電泳儀、DYC-ZY2蛋白轉(zhuǎn)印儀(北京東方瑞利科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥 60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，蘆薈素低、中、高劑量組，假手術(shù)組、模型組大鼠腹腔注射生理鹽水，蘆薈素各劑量組大鼠腹腔注射25、50、100 mg/kg蘆薈素，連續(xù)7 d。

2.2 模型建立 采用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂法制備[7]。各組大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，在大鼠腹正中處用手術(shù)剪刀剪2 cm切口，使雙側(cè)腎蒂完全暴露，無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉30 min，可見(jiàn)大鼠腎臟顏色從鮮紅逐漸變?yōu)樽虾?，隨后松開(kāi)無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾使腎臟血流恢復(fù)灌注，可見(jiàn)大鼠腎臟顏色從紫黑逐漸變?yōu)轷r紅。腹正中處切口用絲線縫合；假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行夾閉及再灌注操作，其余操作相同。術(shù)后各組大鼠自由飲水進(jìn)食，不再給予蘆薈素處理。

2.3 大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測(cè)

手術(shù)后24 h，大鼠腹主動(dòng)脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，其中BUN水平檢測(cè)采用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法，Scr水平檢測(cè)采用肌氨酸氧化酶法，TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測(cè)采用ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.4 HE染色 腹主動(dòng)脈取血后處死大鼠，無(wú)菌操作剖取雙側(cè)腎臟組織，置于4%多聚甲醛中固定72 h，石蠟包埋，切片機(jī)切成4 μm薄片，行常規(guī)HE染色，檢測(cè)蘆薈素對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟病理?yè)p傷的影響。參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法分析蘆薈素對(duì)大鼠腎臟病理?yè)p傷的影響，其中重度損傷(炎性細(xì)胞大片浸潤(rùn)，>75%的腎小管損傷)計(jì)為4分，中度損傷(炎性細(xì)胞中度浸潤(rùn)，50%～75%的腎小管損傷)計(jì)為3分，輕度損傷(炎性細(xì)胞輕度浸潤(rùn)，25%～50%的腎小管損傷)計(jì)為2分，輕微損傷(炎性細(xì)胞輕微浸潤(rùn)，<25%的腎小管損傷)計(jì)為1分，無(wú)損傷(無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常)計(jì)為0分。

2.5 TUNEL染色 大鼠腎臟組織進(jìn)行固定、包埋、切片后二甲苯醇脫羧，加入蛋白酶K(20 μg/mL)，在37 ℃下放置15 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，按照TUNEL組織凋亡檢測(cè)試劑盒方法操作，隨后在熒光顯微鏡下分析蘆薈素對(duì)大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響。

2.6 RT-qPCR法檢測(cè)大鼠腎臟組織凋亡相關(guān)基因表達(dá) 取大鼠腎臟組織適量，采用Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)Oligo軟件設(shè)計(jì)PCR引物，由金唯智(天津)生物公司合成。取cDNA模板2 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各 0.5 μL，SYBR實(shí)時(shí)定量PCR Mix試劑12.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足25 μL，石蠟油封存后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)40次，反應(yīng)結(jié)束后讀取CT值，分析溶解曲線特征，采用2-△△CT法進(jìn)行定量分析，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot檢測(cè)大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá) 取大鼠腎臟組織適量，通過(guò)RIPA組織裂解液裂解，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，分離上清，蛋白濃度采用二喹啉甲酸法檢測(cè)，通過(guò)SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，10%脫脂奶粉封閉后漂洗，加入一抗(1∶2 000)，在4 ℃冰箱中放置過(guò)夜，漂洗后再加入二抗(1∶5 000)，常溫孵育1 h，在膜上滴加超敏化學(xué)發(fā)光液，成像后拍照。

3 結(jié)果

3.1 蘆薈素減輕大鼠腎功能損傷 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BUN、Scr水平升高(P<0.01)，表明造模成功；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠血清BUN、Scr水平降低(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 蘆薈素對(duì)大鼠血清BUN、Scr水平的影響

3.2 蘆薈素改善大鼠腎臟組織病理?yè)p傷 如圖1A所示，假手術(shù)組大鼠腎小管排列緊密，腎臟結(jié)構(gòu)基本正常；模型組大鼠細(xì)胞變扁，輪廓結(jié)構(gòu)不清，擴(kuò)張呈囊狀，核固縮呈空泡性變樣、胞質(zhì)疏松，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎小管輕度擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)基本正常，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，以中、高劑量組更明顯。如圖1B所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟病理?yè)p傷評(píng)分升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠損傷評(píng)分降低(P<0.05)。

3.3 蘆薈素抑制大鼠炎癥反應(yīng) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 蘆薈素對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

3.4 蘆薈素抗大鼠腎臟細(xì)胞凋亡 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 各組大鼠腎臟組織病理?yè)p傷(×200)

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 各組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡(×200)

3.5 蘆薈素調(diào)節(jié)大鼠腎臟凋亡相關(guān)基因表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟組織Bcl-2 mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)，而B(niǎo)axmRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織Bcl-2 mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值升高(P<0.01)，而B(niǎo)axmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 蘆薈素對(duì)大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響

3.6 蘆薈素對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟組織Bcl-2、PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織Bcl-2、PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)呈劑量依賴性升高(P<0.01)，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，見(jiàn)圖3、表5。

表5 蘆薈素對(duì)大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的影響

4 討論

當(dāng)腎功能受到損傷時(shí)，腎小球?yàn)V過(guò)功能會(huì)下降，引起Scr水平增加；損傷進(jìn)一步加重時(shí)，BUN水平會(huì)增加[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈素可以降低大鼠血清BUN、Scr水平；同時(shí)，腎臟病理?yè)p傷評(píng)分結(jié)果顯示，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠損傷評(píng)分降低。蘆薈素對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)是腎缺血再灌注損傷重要的發(fā)病機(jī)制之一，TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎癥因子均參與了這一過(guò)程[10]。在炎癥反應(yīng)的發(fā)生和維持過(guò)程中，TNF-α發(fā)揮關(guān)鍵作用，增加內(nèi)皮素合成，使腎血流量和腎小球?yàn)V過(guò)率降低，導(dǎo)致腎功能衰竭、腎小球內(nèi)皮損傷和腎細(xì)胞凋亡[11]。TNF-α也能刺激單核-巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6等促炎因子，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，IL-1β和IL-6的高表達(dá)是腎缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志[12]。Birari等[13]發(fā)現(xiàn)，在阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心臟毒性模型中，蘆薈素降低促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，推測(cè)蘆薈素對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是由多種基因參與調(diào)控的細(xì)胞自主性程序死亡進(jìn)程，在腎缺血再灌注損傷的發(fā)生中占有重要地位[14]。Bcl-2基因家族主要由于Bcl-2和Bax基因構(gòu)成，其中Bcl-2為抗凋亡基因，Bax為促凋亡基因，二者共同參與細(xì)胞凋亡調(diào)控[15]。Bcl-2/Bax比值對(duì)調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程具有更為重要的意義，Bcl-2/Bax比值越低，意味著凋亡現(xiàn)象越嚴(yán)重[16]。Xu等[17]發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝炎模型中，不同劑量的蘆薈素均可以促進(jìn)Bcl-2表達(dá)上調(diào)和Bax、cleaved caspase-3表達(dá)下調(diào)，從而抑制肝細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈素可以降低腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟細(xì)胞凋亡；蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax比值增加，而B(niǎo)ax mRNA及蛋白表達(dá)降低，提示抗腎臟組織細(xì)胞凋亡是蘆薈素具有保護(hù)腎缺血再灌注損傷作用的潛在原因。

多種信號(hào)通路參與腎缺血再灌注損傷過(guò)程，通路異常引起細(xì)胞凋亡，使腎功能降低，無(wú)法行使正常功能[18]。PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控下游凋亡基因和蛋白的表達(dá)[19]。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，在保護(hù)腎缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20-21]。Dong等[22]發(fā)現(xiàn)，在小鼠外傷性腦損傷模型中，蘆薈素通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制凋亡的發(fā)生，促進(jìn)模型小鼠腦功能的恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)增加，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抗腎臟組織細(xì)胞凋亡。

總之，本研究證實(shí)蘆薈素預(yù)處理對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)及抗PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。