松花粉功能成分及馬尾松花粉抗氧化性

何小平 ，戴承恩*，李海龍，鄭芬芬，杜偉，竺畫(huà)柳

1.浙江亞林生物科技股份有限公司（杭州 311400）；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所（杭州 311400）；3.杭州萬(wàn)向職業(yè)技術(shù)學(xué)院（杭州 311023）

松花粉，又名松花、松黃，是指松科植物馬尾松、油松或同屬植物的干燥花粉，是中醫(yī)藥古籍中收載的2種花粉之一，是祖國(guó)醫(yī)藥學(xué)寶庫(kù)中僅有的食藥兼用花粉品種。研究表明，松花粉營(yíng)養(yǎng)豐富，含蛋白質(zhì)、多糖、黃酮、植物甾醇、不飽和脂肪、膽堿、輔酶等多種營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)揮增強(qiáng)免疫功能、延緩衰老、調(diào)節(jié)代謝、改善腸胃功能、抗炎鎮(zhèn)痛、抗疲勞等眾多的保健作用[1]。松花粉因其營(yíng)養(yǎng)豐富、安全有效、功能顯著，具有多種藥用和保健功效，有較大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值，被廣泛用于保健品、藥品、化妝品和添加劑等領(lǐng)域。

雖然松花粉的理論研究較多，但基礎(chǔ)性研究薄弱，特別是對(duì)不同品種的松花粉功能成分缺乏系統(tǒng)性的研究，導(dǎo)致產(chǎn)品成分和功能描述的精確性欠佳。而且基礎(chǔ)研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的滯后，不僅影響產(chǎn)品的質(zhì)量和保健效果，也達(dá)不到市場(chǎng)的要求，會(huì)對(duì)其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生巨大沖擊。隨著國(guó)家保健食品注冊(cè)法規(guī)調(diào)整，對(duì)保健食品申報(bào)前期研究材料的嚴(yán)格控制，松花粉亟需開(kāi)展大量基礎(chǔ)研究工作，以更好地推動(dòng)松花粉類保健產(chǎn)業(yè)發(fā)展。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同品種松花粉功能成分及馬尾松花粉抗氧化性的研究，完善松花粉品質(zhì)評(píng)價(jià)體系，以期為松花粉資源開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

松花粉為破壁松花粉，采自不同地區(qū)和不同品種，見(jiàn)表1。

表1 不同品種及產(chǎn)地的松花粉樣品

1.2 試劑與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）；甲醇、乙腈、無(wú)水乙醇（色譜純，美國(guó)天地有限公司）；石油醚（沸程30～60 ℃）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙酸乙酯、氯化膽堿、三氯甲烷、雷納克銨鹽、苯酚和濃硫酸等（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

AL104電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；LC-20A HPLC儀（日本島津公司）；KDN-04C蛋白質(zhì)測(cè)定儀（浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司）；DK-S26電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ-800B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；754PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TD25-WS低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 松花粉中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量采用自動(dòng)蛋白質(zhì)測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 松花粉中多糖提取及含量的測(cè)定

松花粉多糖的提取參照袁桂香等[2]報(bào)道的超聲輔助提取方法，其中松花粉的質(zhì)量增加到1.0 g，提取溫度減低到65 ℃，提取時(shí)間增加到3 h。多糖含量的測(cè)定參照劉敏等[3]的苯酚-硫酸法。

1.3.3 松花粉中總黃酮提取及含量的測(cè)定

松花粉中總黃酮的提取和含量測(cè)定參照李雪梅等[4]報(bào)道的方法，其中提取采用溶劑浸提法并作了適當(dāng)改進(jìn)，破壁松花粉以料液比1∶25 g/mL添加95%乙醇，超聲30 min，在提取溫度70 ℃下浸提2 h。含量的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法。

1.3.4 松花粉中膽堿提取及含量的測(cè)定

松花粉中膽堿的提取和含量測(cè)定參照丁明等[5]報(bào)道的SPE-分光光度法。

1.3.5 松花粉中β-谷甾醇提取及含量的測(cè)定

松花粉中β-谷甾醇的提取參照高愛(ài)新等[6]的超臨界CO2萃取方法，含量的測(cè)定采用余江南等[7]的高效液相色譜法。

1.3.6 馬尾松花粉水提物（PS）和醇提物（PP）制備

馬尾松花粉水提物的制備：稱取20 g馬尾松花粉，加入400 mL去離子水，于80 ℃提取3.5 h，離心取上清液，離心2次合并上清液，濃縮，噴霧干燥即得馬尾松花粉水提物。

馬尾松花粉醇提物的制備：依上述方法得到的上清液，濃縮后加入5倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀10 h，離心取上清液并噴干即得馬尾松花粉醇提物。

1.3.7 馬尾松花粉抗氧化作用的評(píng)價(jià)

抗氧化作用的評(píng)價(jià)參照Lee等[8]報(bào)道的水楊酸法測(cè)定·OH自由基的清除率和Xie等[9]報(bào)道的超氧陰離子自由基清除法。

2 結(jié)果和分析

2.1 松花粉中蛋白質(zhì)的含量

所測(cè)的12種不同品種松花粉中蛋白質(zhì)含量介于10.75%～16.69%之間，各松花粉蛋白質(zhì)平均含量為13.65%，其中以火炬松（16.31%）的花粉蛋白含量最高，樟子松（14.45%）和馬尾松（14.10%）的花粉蛋白質(zhì)含量次之，而油松（13.52%）和黃山松（12.75%）花粉中蛋白質(zhì)含量較低，云南松（10.81%）花粉中蛋白質(zhì)含量最低（見(jiàn)表2）。但與蜂花粉（14.3%～29.0%）相比松花粉中蛋白質(zhì)含量普遍較低[10-11]。研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)破壁的松花粉提取物中蛋白質(zhì)含量得到顯著提高[12]。

2.2 松花粉中多糖的含量

從表2可得出，不同松花粉的多糖含量不一，各松花粉的平均含量為12.58%，其中以油松花粉中多糖含量（14.04%）最高，其余依次為樟子松（13.55%）、馬尾松（13.06%）、火炬松（12.75%）、云南松（11.84%）和黃山松（10.61%）。采用不同的提取方法，獲得的松花粉多糖的得率不同。松花粉多糖是產(chǎn)生保健效果的主要活性成分，其在提高免疫力、抗氧化和抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用[13]，深入研究意義重大。

2.3 松花粉中總黃酮的含量

有研究發(fā)現(xiàn)松花粉中總黃酮含量為1.2～2.3 g/100 g，其中馬尾松中黃酮類化合物含量較高[14]。從表2可以得出，各松花粉總黃酮平均含量為1.66 g/100 g，不同地區(qū)的馬尾松樣品總黃酮含量較高，平均可達(dá)2.09 g/100 g，油松的總黃酮含量較低，只有1.24 g/100 g，這和吳曉琴等[14]研究的結(jié)果相似。樟子松（1.99 g/100 g）和火炬松（1.86 g/100 g）的總黃酮含量也高于平均值，而黃山松（1.48 g/100 g）和云南松（1.33 g/100 g）的總黃酮含量低于平均值。黃酮類化合物作為松花粉中的主要活性成分，具有廣泛的藥理作用。因此，以馬尾松花粉作為原料來(lái)開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品具有一定理論依據(jù)。

表2 松花粉主要營(yíng)養(yǎng)成分的含量（x±s，n=3）

2.4 松花粉中總膽堿含量

松花粉中含有豐富的膽堿，每100 g中含202.94～267.79 mg膽堿[15]。不同品種間膽堿的含量存在明顯的差異，各松花粉膽堿平均含量為229.98 mg/100 g。以油松花粉中膽堿含量最豐富，達(dá)253.80 mg/100 g，其余依次是馬尾松花粉248.34 mg/100 g，樟子松花粉237.20 mg/100 g，火炬松花粉228.65 mg/100 g，黃山松花粉222.13 mg/100 g，云南松花粉210.29 mg/100 g。研究表明通過(guò)合理的攝入膽堿，可防止記憶力衰退，有助于治療唐氏綜合征和阿爾茨海默病[16]。說(shuō)明膽堿含量豐富的油松和馬尾松花粉適合于開(kāi)發(fā)功能產(chǎn)品。

2.5 松花粉中β-谷甾醇的含量

花粉中植物甾醇含量豐富，主要由β-谷甾醇（β-sitosterol）、菜油甾醇（campesterol）、少量菜子甾醇（brassicasterol）和豆甾醇（stigmasterol）組成，其中β-谷甾醇約占總甾醇的78%[17]。不同品種的松花粉β-谷甾醇含量差異很大，其中以云南松β-谷甾醇的含量最高，為326.75 mg/100 g，其他依次是油松（307.36 mg/100 g）、樟子松（294.33 mg/100 g）、馬尾松（285.25 mg/100 g）、火炬松（274.51 mg/100 g），最低的是黃山松，僅為238.63 mg/100 g。同時(shí)，同一品種不同產(chǎn)地間存在很大差異。

2.6 松花粉的抗氧化作用

如圖1和圖2所示，馬尾松花粉水提物（PS）和醇提物（PP）對(duì)·OH自由基和超氧陰離子自由基清除效果與質(zhì)量濃度均呈量效關(guān)系，隨著質(zhì)量濃度增加，清除自由基活性增加。兩者對(duì)·OH自由基清除率的IC50值分別為0.996 2 mg/mL和0.102 1 mg/mL，對(duì)超氧陰離子自由基清除率的IC50值分別為0.502 7 mg/mL和0.069 8 mg/mL。

圖1 馬尾松花粉PS和PP的·OH自由基清除效果

圖2 馬尾松花粉PS和PP的超氧陰離子自由基清除效果

樣品質(zhì)量濃度約4 mg/mL時(shí)，PS、PP和VC對(duì)·OH自由基清除率可分別達(dá)到55.36%，75.29%和88.26%，對(duì)超氧陰離子自由基清除率可分別達(dá)到53.12%，80.54%和85.26%，其中PS與PP、VC對(duì)·OH自由基和超氧陰離子自由基最高清除率具有顯著性差異。PP和VC對(duì)·OH自由基清除率有顯著性差異，而對(duì)超氧陰離子自由基清除率無(wú)顯著性差異。

結(jié)果表明PP具有很強(qiáng)的氧化性，特別是在清除超氧陰離子自由基上具有良好的活性，而PS具有一定抗氧化作用，但與PP相比，都呈現(xiàn)顯著性差異。通過(guò)測(cè)定PS和PP的黃酮和多糖含量，結(jié)果表明黃酮含量PP（2.03 g/100 g）＞PS（0.86 g/100 g），多糖含量PS（13.05%）＞PP（5.63%）。由于PP中含有較多的黃酮，表現(xiàn)很強(qiáng)的抗氧化性，PS中雖黃酮含量較低，但其含有較高的多糖成分，含有多羥基結(jié)構(gòu)，具有一定抗氧化作用。

3 結(jié)論

試驗(yàn)檢測(cè)不同品種松花粉主要功能成分的含量。結(jié)果顯示，不同品種中的各功能成分差異較大，其中油松花粉中多糖（14.04%）和總膽堿（253.80 mg/100 g）的含量較為豐富，馬尾松花粉的黃酮（1.66 g/100 g）、火炬松花粉的蛋白質(zhì)（16.31%）和云南松花粉的β-谷甾醇（326.75 mg/100 g）含量較高。馬尾松花粉抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，PP中因含有豐富的黃酮類化合物，質(zhì)量濃度約4 mg/mL時(shí)，·OH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率分別達(dá)到88.26%和85.26%，而多糖成分較高的PS對(duì)兩者自由基清除率分別為55.36%和53.12%，都表現(xiàn)出一定的抗氧化效果，以PP更明顯。

除此之外，松花粉花源單一，品質(zhì)純凈，成分穩(wěn)定，無(wú)污染，無(wú)農(nóng)藥和動(dòng)物激素殘留，同時(shí)含有游離氨基酸、維生素與礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸、各類酶類及核酸，總量非常豐富，松花粉營(yíng)養(yǎng)成分種類齊全，有效成分含量高，其營(yíng)養(yǎng)均衡，配比合理。松花粉資源蘊(yùn)藏量極為豐富，開(kāi)發(fā)林特產(chǎn)品松花粉的潛力巨大。但是，目前市場(chǎng)中松花粉品種眾多，產(chǎn)品混亂，不利于松花粉品牌建設(shè)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定。該項(xiàng)目的開(kāi)展將完善松花粉品質(zhì)評(píng)價(jià)體系，為松花粉精深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。