江蘇省大豆上一種新粉虱傳病毒的分子鑒定及系統(tǒng)進化分析

吉穎 吳淑華 崔曉艷 涂麗琴 高丹娜 程兆榜 周益軍 陳新 季英華 郭青云

摘要：2019年在對江蘇大豆上病毒病進行調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)徐州和淮安大豆田間出現(xiàn)一種表現(xiàn)葉片黃化、花葉癥狀的病毒病，為明確其伴隨病毒種類，對田間采集的70份疑似病樣進行分子檢測和鑒定，結(jié)果在利用香石竹潛隱病毒屬（Carlavirus）通用引物檢測時發(fā)現(xiàn)，70份疑似病樣中有15份樣品擴增到800 bp左右的目的片段，序列測定后BLAST分析結(jié)果顯示，其與一種粉虱傳病毒——豇豆輕斑駁病毒CpMMV（cowpea mild mottle virus，CpMMV）的同源性最高，暗示了其可能是CpMMV的一個分離物。針對CpMMV編碼的CP基因設(shè)計特異性引物，檢測結(jié)果顯示15份陽性樣品均擴增到目的片段，對獲得的CP基因片段進行克隆測序，發(fā)現(xiàn)其序列全長867 bp，編碼分子量約為32ku的蛋白;序列聚類分析結(jié)果顯示，其與已報道的CpMMV分離物有較高的同源性，并聚類到同一個大的分支，其中與安徽、海南等地分離物相對近緣，聚在同一個小分支。這些結(jié)果表明江蘇大豆存在豇豆輕斑駁病毒的侵染危害，生產(chǎn)上需要密切關(guān)注。

關(guān)鍵詞：大豆;豇豆輕斑駁病毒;分子鑒定;聚類分析;進化樹構(gòu)建

中圖分類號： S435.651? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）10-0030-07

大豆（Glycine max L.）作為一種重要的經(jīng)濟作物，既是最常見油料作物，也是食品、飼料等行業(yè)的主要植物蛋白來源，在世界各地均有種植[1]。隨著種植區(qū)域的擴張，大豆上病毒病的發(fā)生呈現(xiàn)多發(fā)常發(fā)態(tài)勢。據(jù)報道，在美國可侵染大豆的病毒有110種，在中國也有50多種[2]，例如大豆花葉病毒（soybean mosaic virus，SMV）、花生輕型斑駁病毒（peanut mild mottle virus，PMMV）、大豆矮縮病毒（soybean dwarf virus，SbDV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、苜?；ㄈ~病毒（alfalfa mosaic virus，AMV）、豇豆輕斑駁病毒（cowpea mild mottle virus，CpMMV）等[3-5]。

豇豆輕斑駁病毒（cowpea mild mottle virus，CpMMV）是一種煙粉虱傳播的植物病毒[6]，有相關(guān)報道亦可種傳[7-8]，可侵染豆科、茄科、藜科和葫蘆科等多種植物。CpMMV侵染寄主植物常引起葉片斑駁癥狀，有些作物葉片會伴有系統(tǒng)性斑點、畸形、褪綠甚至壞死等癥狀[8]，嚴重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)。1973年，Brunt 等首次報道加納豇豆上出現(xiàn)CpMMV的危害[8]，隨后該病毒迅速蔓延，在巴西[9]、尼日利亞[10]、約旦[11]、泰國[12]、印度[13]、坦桑尼亞[14]、以色列[15]、蘇丹[16]、阿根廷[17]、伊朗[18]、波多黎各[19]、委內(nèi)瑞拉[20]、美國[21]、貝寧[22]、烏干達[23]、墨西哥[24]、肯尼亞[25]等多個國家和地區(qū)均有該病毒的報道。在中國，2013年Chang等首次報道臺灣豇豆和四季豆上存在CpMMV的侵染危害[26];2015年劉雪建利用小RNA深度測序及RT-PCR技術(shù)在江西四季豆上檢測到CpMMV[27];2019年，楊曉等報道海南豇豆上也出現(xiàn)CpMMV的危害[5];但目前CpMMV在大豆上僅安徽有危害報道[28]。

CpMMV隸屬于蕪菁黃花葉病毒目（Tymovirales）乙型線狀病毒科（Betaflexiviridae）香石竹潛隱病毒屬（Carlavirus）[29]，其基因組是正單鏈RNA，長度約為8 200 bp，病毒粒子為彎曲的絲狀顆粒（約650 nm×15 nm），具有5′末端帽子結(jié)構(gòu)和3′末端Poly（A）尾，編碼6個蛋白：ORF1編碼復(fù)制酶蛋白，含4個保守的基序，即甲基轉(zhuǎn)移酶、C23肽酶、解旋酶和RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）[30-33];ORF2、ORF3和ORF4編碼病毒運動所必需的三重基因模塊（TGB1-3，大小分別為250、11.6、7.5 ku）;ORF5編碼外殼蛋白（coat protein，CP，32 ku）;ORF6編碼一個核酸結(jié)合蛋白（nucleic acid binding protein，NBP，15.2 ku）[34]。其中外殼蛋白是CpMMV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，且能結(jié)合TGB1-3參與病毒胞間運動[35-36]，在病毒分類上也是該屬一個重要的參考指標[37]。

CpMMV在我國首次報道是2013年（中國臺灣地區(qū)）[26]，隨后江西、海南也出現(xiàn)該病毒發(fā)生危害的報道[5，27]，而對于大豆，只在安徽有侵染危害報道[28]。2019年筆者在江蘇徐州和淮安的田間發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)疑似病毒感染的大豆病株，大豆病樣采集后經(jīng)分子檢測與鑒定，結(jié)果在大豆病樣中檢測到CpMMV，之后的序列分析結(jié)果也證實了這一結(jié)果，說明CpMMV在江蘇大豆上已存在危害。

1 材料與方法

1.1 供試病樣

病樣為2019年采自江蘇省徐州市和淮安市疑似感染病毒病的大豆樣本，共70份，對照為網(wǎng)室內(nèi)培養(yǎng)的健康大豆苗，樣本采集后用液氮處理，于 -80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病樣總RNA提取

取在超低溫冰箱中的大豆樣品，液氮處理后置于研磨機中研磨至粉末，采取Trizol法[38]提取樣品總RNA，保存于-80℃冰箱備用。

1.3 病樣RT-PCR檢測

以病樣總RNA為模板，用PrimeScriptTM RT Master Mix進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反應(yīng)體系（20 μL）：病樣總RNA 1 μL，5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL，用RNase-Free H2O補足至總體積20 μL。反應(yīng)程序：37 ℃恒溫15 min，85 ℃變性 5 s，4 ℃保存，獲得cDNA。對其進行PCR檢測，PCR反應(yīng)體系（10 μL）：2×Taq Master Mix 5 μL，ddH2O 3 μL，Car_F2b和Car_R（表1）各0.5 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性 15 s，47 ℃退火15 s，72 ℃延伸55 s，32個循環(huán);72 ℃ 延伸6 min，4 ℃保存。取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物在0.5 × TAE電泳緩沖液中，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物并拍照，將擴增出的與目的片段一致的產(chǎn)物送通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司測序。

1.4 CpMMV CP基因克隆

依據(jù)CpMMV外殼蛋白序列設(shè)計一對特異引物CpMMCP_F和CpMMCP_R（表1），以檢測結(jié)果為陽性的cDNA為模板進行RT-PCR擴增。擴增體系（20 μL）：2×Rapid Taq Master Mix 10 μL，CpMMCP_F和CpMMCP_R各 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL;PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s，51 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循環(huán) 34 次;72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物于經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的片段，將其與pMD-18T載體在16 ℃下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞后涂布到含有氨芐青霉素的LB平板上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。挑LB平板上的單克隆進行菌落PCR和酶切驗證，鑒定無誤后將菌液送通用生物系統(tǒng)（安徽）公司進行測序。

1.5 序列測定及分析

委托通用生物系統(tǒng)（安徽）公司完成測序。使用ClustalX、BioEdit、DNAstar、MEGA6等軟件及NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）完成聚類分析及進化樹構(gòu)建，進化樹的可信度使用1 000次自導(dǎo)復(fù)制實現(xiàn)評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀

2019年，筆者在對江蘇大豆上病害進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)徐州和淮安大豆上存在疑似病毒侵染的病株，發(fā)病大豆植株田間主要表現(xiàn)葉片黃化、花葉等癥狀（圖1），病害田間多呈零星發(fā)生，個別田塊局部區(qū)域發(fā)病較重。

2.2 香石竹潛隱病毒屬（Carlavirus）病毒檢測

大豆上發(fā)生的病毒病多種多樣，對大豆病樣的RNA進行RT-PCR檢測能明確其感染的病毒種類，在利用Carlavirus通用引物Car_F2b和Car_R對大豆樣品進行檢測時發(fā)現(xiàn)， 70份疑似病樣中有15份（徐州14份，淮安1份）擴增到與目的條帶（800 bp）大小相近的片段，而健康對照中沒有擴增到條帶（圖2），說明大豆病樣中可能有香石竹潛隱病毒屬病毒的感染。為明確病毒的種類，抽選5份樣品進行序列測定，序列BLAST分析結(jié)果顯示其與豇豆輕斑駁病毒（MN908944）同源性最高（9891%），說明在徐州和淮安采集的大豆樣品中可能存在著豇豆輕斑駁病毒的侵染。

2.3 豇豆輕斑駁病毒的分子檢測

為進一步驗證檢測到的病毒是CpMMV，筆者針對CpMMV的CP基因設(shè)計一對特異性擴增引物CPMMCP_F和CPMMCP_R，RT-PCR結(jié)果顯示，15份陽性樣品均擴增到了與目的條帶大?。?67 bp）相近的特異性條帶（圖3），即CpMMV的CP基因條帶，這進一步說明樣品中確有可能存在CpMMV的感染。

2.4 豇豆輕斑駁病毒CP基因克隆及其序列分析

隨機抽選3個樣品進行CP基因PCR擴增（圖4-a），經(jīng)單菌落PCR和酶切驗證（圖4-b）后送通用生物系統(tǒng)（安徽）公司進行測序。

對獲取的6個CP基因克隆進行測序，結(jié)果顯示，序列全長都為867 bp，編碼一個由289個氨基酸組成的分子量約32 ku的蛋白。序列之間有很高的同源性，BLAST分析結(jié)果表明，它們與CpMMV（MT232837）同源性最高（99%），暗示了其屬于CpMMV的一個分離物。

2.5 豇豆輕斑駁病毒CP基因系統(tǒng)進化分析

使用ClustalX等軟件將本研究測定的CpMMV CP序列與已公開的其他CpMMV分離物CP基因序列（表2）進行比對，同時利用MEGA 6軟件，使用臨近法（neighbor-joining，NJ）、Kimura 2-parameter模型重建了系統(tǒng)進化樹（圖5），各個分枝的Bootstrap置信度用1 000次自導(dǎo)復(fù)制來評價。

基于CP核苷酸序列重建的系統(tǒng)進化分析結(jié)果（圖5、表2）顯示，本研究測定的分離物在進化樹中全部聚類到CpMMV大分支中，說明檢測到的病毒為CpMMV的一個分離物;同時結(jié)果還顯示，江蘇分離物與我國的安徽大豆分離物、海南豇豆分離物、臺灣菜豆分離物（JX020701）、印尼大豆分離物及印度黑吉豆分離物（KJ534277）相對近緣共同聚類到一個分支，其中與安徽大豆分離物最為近緣，而與中國臺灣豇豆分離物（JX070669）及其他國外分離物相對遠緣，分別處在不同的分支上。這些分析結(jié)果進一步說明本研究在江蘇大豆上檢測到的病毒為CpMMV的一個分離物。

3 討論

江蘇省大豆栽植面積在25萬hm2左右，是我國重要的大豆產(chǎn)區(qū)之一[40]。近年來隨著各地經(jīng)貿(mào)往來（種苗調(diào)運）的頻繁和農(nóng)業(yè)種植模式的改變，加之傳播介體的大發(fā)生，大豆病毒病呈多發(fā)態(tài)勢，而大豆病毒病危害通常會導(dǎo)致10%～15%的產(chǎn)量損失，復(fù)合侵染往往會加重產(chǎn)量損失[21]。本研究對2019年采集于江蘇省徐州和淮安地區(qū)的大豆病樣進行檢測時，發(fā)現(xiàn)其中伴隨有病毒侵染，進一步通過基因克隆及序列分析等方法對其進行了鑒定，結(jié)果顯示，它屬于CpMMV的一個分離物，該病毒之前在我國臺灣（菜豆、四季豆）[26]、江西（四季豆）[27]、海南（豇豆）[5]和安徽（大豆）[28]有發(fā)生危害的報道，但江蘇尚未有發(fā)生危害的報道，因此本研究是CpMMV侵染江蘇大豆的第1個報道，同時CpMMV也是第1個侵染危害江蘇省大豆的粉虱傳病毒。

CpMMV是我國近幾年來新發(fā)生的一種重要的粉虱傳播的植物病毒，能夠侵染豆科和茄科多種作物，目前已廣泛分布于亞洲、美洲和非洲[7-8，21]，對包括大豆在內(nèi)的多種作物造成了嚴重的經(jīng)濟損失[8]。目前我國安徽、海南等地已經(jīng)出現(xiàn)CpMMV發(fā)生危害，本研究報道江蘇也有該病毒發(fā)生危害，但目前我國大豆對該病毒的抗性尚不明確，而該病毒可由煙粉虱傳播，且近幾年來病毒傳播介體煙粉虱的大發(fā)生，極有可能導(dǎo)致該病毒在更大范圍流行危害，因此生產(chǎn)上應(yīng)當(dāng)高度重視，密切關(guān)注該病毒的危害動態(tài)，早發(fā)現(xiàn)、早防控，避免擴散蔓延至全國范圍造成更大的危害和損失。

由于大豆上的病毒種類繁多，本研究中除了對CpMMV進行檢測外，同時也對其他大豆常見病毒如黃瓜花葉病毒、菜豆普通花葉病毒、大豆花葉病毒等進行了檢測，結(jié)果在這批樣品中也檢測到了菜豆普通花葉病毒等病毒，說明江蘇大豆上病毒種類相對比較復(fù)雜，要摸清江蘇大豆上的病毒種類還需后續(xù)更廣泛的樣品采集和更為系統(tǒng)的病毒種類調(diào)查。

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