響應(yīng)面法優(yōu)化牛初乳免疫球蛋白熱保護(hù)劑的配方

楊 紅，劉愛國, ，劉立增，強(qiáng) 鋒，楊 毅

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品與生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.天津天獅學(xué)院，天津 301700；3.彼特銳斯（天津）商貿(mào)有限公司，天津 300300）

隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，功能性保健食品越來越受到大眾的青睞，牛初乳作為一種富含免疫活性物質(zhì)的功能性食品原料，在食品市場受到廣泛關(guān)注。牛初乳是健康奶牛正常產(chǎn)犢三天內(nèi)從乳腺分泌出來的乳汁，含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、生物活性成分以及20多種病原體特異性抗體[1]，因其具有增強(qiáng)人體免疫力[2]、促進(jìn)組織生長[3]、預(yù)防上呼吸道感染[4]、修復(fù)受損組織[5]和調(diào)節(jié)腸道菌群[6]的功效，已成為近年來國內(nèi)外研究熱點。

IgG是牛初乳中最重要的生物活性蛋白之一，其是以二硫鍵連接兩條重鏈和兩條輕鏈，由四個多肽亞單位組成的“Y”型四肽鏈分子。新鮮的牛初乳中IgG的質(zhì)量濃度是30～87 mg/mL[7]，大約是常乳的50倍，具有極高的營養(yǎng)價值，因此，開發(fā)以牛初乳為原料的新型功能性食品具有一定的實際意義。但是IgG易受外界受熱、酸、堿等不良環(huán)境因素影響而變性[8]，牛初乳在實際食品加工過程中要經(jīng)過巴氏殺菌和噴霧干燥等熱處理工藝，IgG活性損失極為嚴(yán)重，其營養(yǎng)功效不能充分展現(xiàn)，因此，提高IgG的穩(wěn)定性從而有效發(fā)揮其生理活性尤為重要。

目前對牛初乳IgG活性保護(hù)的相關(guān)研究已有報道，在牛初乳中加入糖、多元醇和氨基酸等物質(zhì)具有的保護(hù)作用，可以有效提高牛初乳IgG的穩(wěn)定性[9]，研究表明，可能是由于這些物質(zhì)增強(qiáng)了IgG分子中疏水相互作用，也可能是添加保護(hù)劑后的溶液中蛋白質(zhì)分子優(yōu)先溶劑化進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面張力和溶液黏度的增加[10]，在一定程度上，氨基酸對IgG的保護(hù)作用可能是由氨基酸的羧基引起的，不同種類的氨基酸因其羧基基團(tuán)的數(shù)量和位置不同，其保護(hù)效果也存在明顯差異[11]。Chao等[10]以蔗糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖和麥芽糖等物質(zhì)作為IgG熱保護(hù)劑，研究發(fā)現(xiàn)，添加5%的果糖或麥芽糖保護(hù)效果最好，可以將殘留IgG含量提高到31%，添加量大于30%會導(dǎo)致殘留IgG含量下降。雷昌貴等[12]選取常用食品添加劑等對牛初乳IgG的熱穩(wěn)定性的影響進(jìn)行探討，研究發(fā)現(xiàn)磷酸氫二鈉、蔗糖、乳酸鈣、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉等食品添加劑對IgG有一定的保護(hù)作用。但以上相關(guān)報道主要集中在探究單一種類的物質(zhì)對其活性的影響，且添加的物質(zhì)缺乏功能性，關(guān)于IgG復(fù)合熱保護(hù)劑的研究鮮有報道。

因此，本研究以牛初乳IgG作為研究對象，采用菊粉、甘氨酸、麥芽糖醇制備成復(fù)合熱保護(hù)劑，以IgG活性保留率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法對IgG復(fù)合熱保護(hù)劑配方進(jìn)行優(yōu)化，并通過傅里葉變換紅外光譜和內(nèi)源性熒光光譜表征不同方式處理的牛初乳IgG結(jié)構(gòu)。旨在為IgG在實際生產(chǎn)加工過程中的活性保持技術(shù)提供新思路，為牛初乳這一優(yōu)質(zhì)功能性食品原料的高值利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳（產(chǎn)犢48 h內(nèi)） 天津嘉立荷牧業(yè)有限公司第五牧場；凝乳酶（890 U） 山東悠樂滋生物科技有限公司進(jìn)口分裝；IgG標(biāo)準(zhǔn)品（36 μg/mL） 廈門慧嘉生物科技有限公司；麥芽糖醇、甘氨酸 食品級，河南萬邦實業(yè)有限公司；菊粉 食品級，重慶驕王天然產(chǎn)物股份有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸銨分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；ELISA試劑盒 廈門慧嘉生物科技有限公司。

FA2004A電子天平 上海精天儀器有限公司；HW-S24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；EL20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；TG16-WS臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；F-4600熒光分光光度計 日立高新技術(shù)公司；Nicolet傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器有限公司；Spark-10M酶標(biāo)儀 帝肯上海貿(mào)易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫球蛋白的提取 參照徐欽[13]的方法，并稍作修改，牛初乳于4 ℃，1000 r·min-1離心20 min除去上層脂肪，在脫脂后的牛初乳中，加入0.02%的凝乳酶反應(yīng)30 min后，于4 ℃，8000 r·min-1離心30 min得到去除酪蛋白的乳清液。按1:1比例向乳清液中加入PBS緩沖液（pH7.4，0.01 mol/L），再緩慢滴加2倍于乳清體積的飽和（NH4）2SO4至終濃度為50%，4 ℃靜置24 h后，于4 ℃，8000 r·min-1離心30 min，將沉淀用5%原乳清體積的PBS緩沖液（pH7.4，0.01 mol/L）溶解后裝入透析袋，4 ℃透析48 h，中間更換溶液2～3次。以1% BaCl2或納氏試劑檢測透析液，直至無SO42-或NH4+出現(xiàn)為止，將透析所得產(chǎn)物冷凍干燥后即得IgG粗提物，-20 ℃儲存待用。

1.2.2 IgG活性保留率計算 準(zhǔn)確稱取IgG粗提物5 g溶于PBS緩沖液（pH7.4，0.01 mol/L）中制成5 g/L的免疫球蛋白稀溶液備用，在室溫條件下，用渦旋混合器充分混勻，在不同質(zhì)量濃度下將熱保護(hù)劑添加至IgG粗提物的稀釋溶液中，待熱保護(hù)劑充分溶解后，于75 ℃水浴5 min后立即用冰水水浴[14]，空白對照組不添加任何熱保護(hù)劑在同樣條件下進(jìn)行熱處理。采用IgG酶聯(lián)免疫試劑盒測定IgG質(zhì)量濃度，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在450 nm處測得樣品的吸光度，用下式計算IgG活性保留率[15]。

式中：a表示IgG加熱后質(zhì)量濃度，μg/mL；b表示IgG加熱前質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.2.3 單因素實驗 以IgG活性保留率為指標(biāo)，分別選取甘氨酸添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、菊粉添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、麥芽糖醇添加量（5%、10%、15%、20%、25%）進(jìn)行單因素實驗，考察不同因素對牛初乳中IgG活性保留率的影響（每組因素添加量的中間值為固定添加量）。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合Box-Behnken設(shè)計原理，以IgG活性保留率為響應(yīng)值，選取甘氨酸、菊粉和麥芽糖醇作為響應(yīng)因子，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗設(shè)計，確定IgG的最優(yōu)復(fù)合熱保護(hù)劑配方，試驗因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 傅里葉紅外變換光譜分析 根據(jù)曲金萍等[16]的方法用紅外光譜測定樣品的二級結(jié)構(gòu)，將光譜純KBr研磨成細(xì)粉，將待測樣品與干燥的KBr按質(zhì)量比50:1充分混合，制成均勻的圓形透明薄片，用紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜掃描，得到紅外光譜掃描圖，用KBr制作空白壓片。紅外光譜分析條件為：透射模式，掃描波數(shù)4000～400 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1，每個樣品做三次平行實驗。采用ONMIC軟件對數(shù)據(jù)圖像進(jìn)行處理，并對樣品的紅外圖譜進(jìn)行基線校正、對酰胺I帶區(qū)域進(jìn)行傅里葉自去卷積計算，分開重疊在一起的不同峰，在二階導(dǎo)數(shù)譜圖基礎(chǔ)上進(jìn)行高斯擬合，根據(jù)分開峰的位置確定子峰的歸屬，通過計算子峰的峰面積，求出擬合后的樣品二級結(jié)構(gòu)含量（用百分?jǐn)?shù)表示）。

1.2.6 內(nèi)源性熒光光譜分析 采用1.2.2的方法制備5 g/L免疫球蛋白溶液，采用F-4600熒光分光光度計在280 nm下的激發(fā)波長下，測定溶液的熒光強(qiáng)度。熒光分光光度計分析條件為：激發(fā)波長為280 nm，掃描記錄區(qū)間為300～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度設(shè)置為10 nm，數(shù)據(jù)采集速度為60 nm/min，光電倍增管電壓為400 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 9.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，采用SPSS（P＜0.05）軟件中ANOVA方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗分析，所有試驗均平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 IgG的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.2方法進(jìn)行檢測，用ELISA試劑盒于450 nm波長處測定不同質(zhì)量濃度IgG標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，以IgG標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)。所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.151x+0.0483（R2=0.9992），說明測定的濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性良好，后續(xù)IgG含量測定均使用此方程進(jìn)行計算。

2.2 IgG粗提物紅外光譜分析

蛋白質(zhì)或多肽在1700～1200 cm-1紅外光譜區(qū)有明顯的特征吸收帶，其中酰胺I帶和II帶為強(qiáng)吸收帶，酰胺III帶為弱吸收帶，這些吸收帶能反映蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化[17]。酰胺I帶的譜峰歸屬是目前研究相對較為成熟的[18]：1610～1640 cm-1為β-折疊；1640～1650 cm-1為無規(guī)卷曲；1650～1658 cm-1為α-螺旋；1660～1695 cm-1為β-轉(zhuǎn)角。采用1.2.1的方法將牛初乳中IgG進(jìn)行提取得到其粗提物，將IgG標(biāo)準(zhǔn)品和IgG粗提物在4000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。圖1顯示了IgG標(biāo)準(zhǔn)品和IgG粗提物的紅外圖譜，與IgG標(biāo)準(zhǔn)品相比，牛初乳中的IgG經(jīng)過提取后，粗提物中均保留了特征峰，說明提取過程對IgG的結(jié)構(gòu)性質(zhì)方面的影響不大，基本保持了IgG原有的結(jié)構(gòu)。

圖 1 IgG標(biāo)準(zhǔn)品與粗提物的紅外光譜對比Fig.1 FT-IR spectra comparison of IgG standard sample and crude extract

2.3 單因素實驗結(jié)果

2.3.1 不同添加量甘氨酸對IgG活性保留率的影響

不同添加量甘氨酸對IgG活性保留率的影響結(jié)果如圖2所示，據(jù)文獻(xiàn)研究報道，甘氨酸對于牛初乳IgG的熱保護(hù)效果較好[19]。不添加任何熱保護(hù)劑時，在75 ℃條件下處理5 min，IgG活性保留率僅為20.34%。由圖2可以看出，當(dāng)甘氨酸添加量從0.1%提高到0.3%時，IgG活性保留率32.64%提高到36.56%。當(dāng)甘氨酸的添加量達(dá)0.5%時，IgG活性保留率與添加量為0.3%時無顯著差異，當(dāng)添加量達(dá)到0.7%時，IgG活性保留率顯著下降（P＜0.05），這可能是由于IgG分子的結(jié)合部位全部被占用后，繼續(xù)添加甘氨酸反而抑制了對IgG的熱保護(hù)作用[20]，因此，選取適當(dāng)?shù)母拾彼崽砑恿坑葹橹匾?，適當(dāng)添加甘氨酸可以提高牛初乳IgG的活性保留率，添加量過多則會帶來負(fù)面效果，終選定甘氨酸添加量0.5%為響應(yīng)面設(shè)計中心點。

圖 2 不同添加量甘氨酸對IgG活性保留率的影響Fig.2 Effect of different additions of glycine on the retention rate of IgG

2.3.2 不同添加量菊粉對IgG活性保留率的影響不同添加量菊粉對IgG活性保留率的影響結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，隨著菊粉添加量的增加，樣品中IgG活性保留率呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，當(dāng)菊粉量超過10%以后，只能使IgG活性保留率輕微上升，可能的原因是當(dāng)菊粉添加量達(dá)到一定的濃度后，IgG能夠與羥基結(jié)合的部位基本上被全部占用，無法增強(qiáng)IgG分子中疏水相互作用[20-21]，當(dāng)菊粉添加量超過15%（m/V）以后，IgG活性保留率開始顯著下降（P＜0.05）。由單因素方差分析可知，不同添加量的菊粉對IgG活性保留率的影響存在顯著差異（P＜0.05），最終選定菊粉添加量15%為響應(yīng)面設(shè)計中心點。

圖 3 不同添加量菊粉對IgG活性保留率的影響Fig.3 Effect of different addition amount of inulin on the retention rate of IgG

2.3.3 不同添加量麥芽糖醇對IgG活性保留率的影響 不同添加量麥芽糖醇對IgG活性保留率的影響結(jié)果如圖4所示，由圖4可知，隨著麥芽糖醇添加量的增加，樣品中IgG活性保留率呈現(xiàn)先上升后平緩的變化趨勢，這與羅磊等[21]研究結(jié)果一致，當(dāng)麥芽糖醇添加量達(dá)到10%以后，添加更多的麥芽糖醇只能使IgG活性保留率些許上升，最后趨于平緩，且15%、20%、25%添加量的活性保留率并無顯著性差異（P＞0.05），推測其原因與菊粉相似，因為麥芽糖醇和菊粉同為多羥基化合物。由單因素方差分析可知，不同添加量的麥芽糖醇對IgG活性保留率的影響存在顯著性差異（P＜0.05），但10%、15%、20%和25%的麥芽糖醇添加量的活性保留率均無顯著差別，考慮到食品中糖醇類物質(zhì)不能添加過多[22]，因此最終選定麥芽糖醇添加量10%為響應(yīng)面設(shè)計中心點。

圖 4 不同添加量麥芽糖醇對IgG活性保留率的影響Fig.4 Effect of different addition amounts of maltitol on the retention rate of IgG

圖 5 甘氨酸添加量和菊粉添加量的交互作用對IgG活性保留率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of the interaction between glycine supplemental level and inulin supplemental level on IgG retention

2.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合Box-Behnken設(shè)計原理進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，隨機(jī)進(jìn)行17組試驗，試驗方案及結(jié)果如表2所示。

2.4.2 模型建立及擬合分析 采用Design Expert 8.0.6軟件對表2的試驗結(jié)果進(jìn)行多元非線性回歸擬合，得到IgG保留率（Y）對甘氨酸添加量（A）、菊粉添加量（B）、麥芽糖醇添加量（C）的二次回歸方程：Y=36.34-0.37A-0.24B+1.15C+1.65AB-0.88AC+0.90BC-4.30A2-1.57B2-1.49C2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment

為檢驗該二次回歸方程的有效性，對IgG保留率的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行模型系數(shù)顯著性檢驗和方差分析，結(jié)果見表3，該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），這兩種結(jié)果均表明多元回歸模型擬合方程在回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好，理論誤差值較小，可用該回歸模型對牛初乳IgG熱保護(hù)劑的最優(yōu)配方進(jìn)行預(yù)測。模型多元決定系數(shù)R2=94.51%，校正決定系數(shù)R2adj=87.46%，說明響應(yīng)值（IgG活性保留率）的變化有94.51%來自于所選的變量（甘氨酸、菊粉和麥芽糖醇的添加量）。各因素的F值可以反映各因素對試驗指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對響應(yīng)值IgG活性保留率的影響越大。由表3可知，各因素對IgG活性保留率的影響順序為：C（麥芽糖醇添加量）＞A（甘氨酸添加量）＞B（菊粉添加量）。從表3中還可以看出，二次項A2對結(jié)果有極高顯著的影響（P＜0.001），一次項C、交互項AC、二次項B2和二次項C2對結(jié)果的影響為顯著（P＜0.05），這表明各因素對響應(yīng)值（IgG活性保留率）不是簡單的線性關(guān)系。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.4.3 兩因子間交互作用分析 通過Design Expert 8.0.6軟件對回歸方程進(jìn)行分析，得到兩個交互項之間的響應(yīng)面圖及等高線圖，如圖5～圖7所示。響應(yīng)面圖曲面的坡度和等高線的形狀可以較為直觀地反映出各因素的交互作用影響的大小[23]。曲面坡度越陡峭，表明兩個變量交互作用越顯著，反之則不顯著；等高線的形狀為橢圓形表示交互作用對響應(yīng)值的影響顯著，而圓形則表示交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著。由圖5、圖6、圖7可知，菊粉和甘氨酸添加量的響應(yīng)面曲面坡度較為陡峭，等高線圖越接近橢圓，說明這兩個變量的交互作用對響應(yīng)值具有顯著性影響，菊粉和麥芽糖醇添加量交互作用的響應(yīng)面曲面坡度較為平緩，等高線圖越平緩近似圓形，說明彼此之間的交互作用越弱。

圖 6 甘氨酸添加量和麥芽糖醇添加量的相互作用對IgG活性保留率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of the interaction between glycine and maltitol supplemental levels on IgG retention

圖 7 菊粉添加量和麥芽糖醇添加量的相互作用對IgG活性保留率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of the interaction between inulin and maltitol supplemental levels on IgG retention

圖 8 不同處理方式下IgG的FT-IR譜圖Fig.8 FT-IR spectra of IgG under different ways

通過Design Expert 8.0.6軟件對方程求極大值，得到牛初乳IgG復(fù)合熱保護(hù)劑最優(yōu)配方：甘氨酸添加量0.48%，麥芽糖醇添加量12.50%，菊粉添加量14.98%，此時IgG活性保留率36.59%?？紤]到試驗過程實際操作的可行性，將最佳配方調(diào)整為甘氨酸添加量0.50%，麥芽糖醇添加量12.50%，菊粉添加量15.00%，按此條件下，進(jìn)行3次重復(fù)驗證試驗，結(jié)果取平均值，得到牛初乳IgG保留率38.11%±0.84%，驗證值與預(yù)測值的誤差在允許范圍5%內(nèi)，說明該模型合理可靠。

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變紅外換光譜可快速有效地測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的傅里葉紅外圖譜一般有3組特征吸收帶，分別是酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶，對應(yīng)的波數(shù)分別為1700～1600 cm-1、1550～1530 cm-1、1330～1260 cm-1[24]。酰胺I帶對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)較為敏感，因此，紅外圖譜的酰胺I帶（1700～1600 cm-1）是研究蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)最有價值的區(qū)域，其紅外吸收峰主要是由C=O的伸縮震動引起的，且吸收最強(qiáng)。利用傅里葉變換紅外光譜儀對不同方式處理的IgG樣品進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，IgG紅外光譜圖中于3300 cm-1左右呈現(xiàn)強(qiáng)而寬的吸收峰，表明IgG分子多聚體中可能存在許多分子內(nèi)或分子間氫鍵，不同條件下處理的IgG樣品紅外圖譜形狀趨勢相似，對比未經(jīng)熱處理的IgG樣品的紅外圖譜，加熱處理后的蛋白樣品紅外光圖譜的特征峰強(qiáng)度明顯減弱，表明熱處理可以造成IgG樣品二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化和改變。

熱處理會破壞分子內(nèi)的氫鍵作用，影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)單元比例，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分分解折疊，導(dǎo)致無序結(jié)構(gòu)增加，表現(xiàn)為β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加[25]。由表4可以看出，三種樣品的二級結(jié)構(gòu)均以β構(gòu)象為主，但是未熱處理樣品（A）占比相對較高。經(jīng)過75 ℃，5 min條件下熱處理后ɑ-螺旋顯著降低（P＜0.05），可能是因為熱處理后IgG的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，其熱變性導(dǎo)致ɑ-螺旋中的氫鍵逐漸斷裂，進(jìn)而發(fā)生解旋現(xiàn)象，導(dǎo)致ɑ-螺旋比例降低；無規(guī)則卷曲顯著增加（P＜0.05），表明IgG樣品的結(jié)構(gòu)從有序向無序轉(zhuǎn)變；β構(gòu)象是蛋白聚集體的特征構(gòu)象，熱處理可引起樣品熱變性并促進(jìn)分子間的聚集，進(jìn)而導(dǎo)致熱聚集體增加，表現(xiàn)為β-折疊含量增加，熱處理后IgG的β-折疊含量增加表明熱聚集體增加，但顯著（P＜0.05）低于未熱處理樣品，初步推測這可能與添加復(fù)合熱保護(hù)劑的IgG在熱處理后形成的內(nèi)環(huán)境有關(guān)。添加復(fù)合熱保護(hù)劑后的熱處理IgG樣品（C）與空白對照組（B）相比，β-折疊含量顯著下降（P＜0.05），無規(guī)則卷曲含量顯著下降（P＜0.05），表明熱聚集體減少[26]，二級結(jié)構(gòu)較為有序，β-轉(zhuǎn)角含量顯著上升（P＜0.05），可能由于熱處理過程中行成熱聚集體，IgG分子結(jié)構(gòu)部分解折疊誘導(dǎo)無序結(jié)構(gòu)的增加，添加的復(fù)合熱保護(hù)劑與IgG分子發(fā)生一定的反應(yīng)，使分子間的β-折疊結(jié)構(gòu)易轉(zhuǎn)變成β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致其含量增加。綜上，該復(fù)合熱保護(hù)劑對維持牛初乳IgG結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氫鍵具有一定的保護(hù)作用。

表4 IgG的二級結(jié)構(gòu)含量分布Table 4 Secondary structural contents of IgG samples

2.6 內(nèi)源性熒光光譜分析

蛋白質(zhì)分子中的氨基酸殘基側(cè)鏈含有一定量的發(fā)色團(tuán)，如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[27]，其中色氨酸殘基是蛋白質(zhì)中最主要的內(nèi)源熒光來源，色氨酸殘基側(cè)鏈（吲哚基團(tuán)）的內(nèi)源性熒光信號對其微環(huán)境的極性非常敏感，因此可利用內(nèi)源性熒光作為監(jiān)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象和微環(huán)境的極性變化十分有效[28]。熱處理會使蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生改變，而蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化可通過色氨酸等氨基酸殘基的暴露程度來反映[29]，圖9為不同方式熱處理的IgG樣品在300～400 nm的內(nèi)源性熒光圖譜。由圖9可知，不同處理方式對其熒光光譜的形狀影響不明顯，即IgG構(gòu)象變化不明顯，而熒光強(qiáng)度有所改變。未添加復(fù)合熱保護(hù)劑熱處理后的樣品比未熱處理樣品相比，熱處理后IgG的三級結(jié)構(gòu)展開嚴(yán)重，其天然排列方式被破壞，色氨酸殘基的暴露程度增大，導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度增大。與未添加復(fù)合熱保護(hù)劑的熱處理樣品相比，在加熱條件下添加復(fù)合熱保護(hù)劑的IgG樣品的熒光強(qiáng)度明顯降低，張和平等[30]發(fā)現(xiàn)牛初乳IgG在超高壓條件下添加蔗糖時對其具有保護(hù)作用，使IgG樣品熒光強(qiáng)度降低，本文結(jié)果與其一致。該結(jié)果表明添加復(fù)合熱保護(hù)劑對IgG的三級結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，可能是因為復(fù)合熱保護(hù)劑添加到IgG中，減少了色氨酸等疏水性氨基酸殘基的暴露，降低了表面疏水性，使IgG分子堆積更加緊密，維持其天然狀態(tài)[31]。

圖 9 不同方式處理下IgG內(nèi)源性熒光光譜圖Fig.9 Fluorescence intensity of IgG tryptophan under different protective ways

3 結(jié)論

本研究通過單因素及響應(yīng)面法對牛初乳IgG復(fù)合熱保護(hù)劑進(jìn)行配方優(yōu)化，得到一種最優(yōu)的IgG復(fù)合熱保護(hù)劑：甘氨酸添加量0.48%、菊粉添加量14.98%、麥芽糖醇添加量12.50%，該復(fù)合熱保護(hù)劑對IgG結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定作用，可以效地減少熱處理時牛初乳中IgG的活性損失，熱處理（75℃，5 min）后IgG活性保留率可達(dá)36.59%，較空白對照組的IgG樣品提高了16.25%。結(jié)果表明：添加復(fù)合熱保護(hù)劑后熱處理的IgG樣品與空白對照組相比，β-折疊含量顯著下降（P＜0.05），無規(guī)則卷曲含量顯著下降（P＜0.05），二級構(gòu)象呈現(xiàn)較為有序的狀態(tài)；熒光強(qiáng)度降低，減少了色氨酸等疏水性氨基酸殘基的暴露，降低了表面疏水性，使IgG分子堆積更加緊密。該復(fù)合熱保護(hù)劑在牛初乳產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)具有較好的實際應(yīng)用價值，為牛初乳功能性食品的研發(fā)提供了一定的參考依據(jù)。本文未考察在酸堿條件下牛初乳IgG保護(hù)劑的最佳配方，目前國內(nèi)外學(xué)者對牛初乳IgG活性保留率的影響因素有較多研究，但對其活性保持的機(jī)理及其結(jié)構(gòu)變化的研究報道鮮少，并缺乏系統(tǒng)性研究，以后應(yīng)嘗試從分子層面研究保護(hù)劑對牛初乳IgG的作用機(jī)制。