焦糖化與美拉德反應(yīng)中DDMP、HMF及糠醛的生成研究

王 丹，況丹妮，劉若陽，張志軍，侯天宇，李 河

（中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西太原 030051）

食品在貯藏、熱加工及發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些有苦味或?qū)θ梭w存在健康威脅的化合物，如2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮（DDMP）、5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF）及糠醛。它們主要來源于食品加工貯藏過程中的焦糖化反應(yīng)（Caramelization）和美拉德反應(yīng)（Maillard Reaction，MR）[1-2]。在沒有氨基存在時，糖類尤其是單糖，加熱會發(fā)生脫水與降解，當(dāng)溫度高達(dá)熔點(diǎn)以上會發(fā)生褐變，即發(fā)生焦糖化反應(yīng)。當(dāng)有氨基（源于銨根離子、氨基酸、多肽或者蛋白質(zhì)）參與時，還原糖的羰基還會與氨基經(jīng)縮合、聚合而最終生成類黑精，即發(fā)生MR[2]。由于焦糖化和美拉德反應(yīng)在食品中的廣泛存在，DDMP、HMF及糠醛在蜂蜜[3-4]、蔬菜[5]、水果[6]、調(diào)味品[7]、烤面包[8]、飲料[9]等多種食品中被發(fā)現(xiàn)。

作為焦糖化或美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，DDMP、HMF和糠醛可以繼續(xù)反應(yīng)生成棕色及香味物質(zhì)，具有增香調(diào)色功能[10]，但對人體是否有害，目前尚存在爭議。HMF和DDMP被認(rèn)為是中草藥中的有效活性分子[11-12]，如HMF 在體外具有抗酪氨酸酶活性的作用[13]，DDMP具有強(qiáng)抗氧化性[14-15]，可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[16]。然而，研究表明，糠醛或HMF被機(jī)體吸收后，會對肝臟、腎臟、心臟等器官產(chǎn)生不良影響[17]；HMF能損害老鼠的DNA，誘發(fā)大鼠的結(jié)腸癌和引起中毒性腎損害[18]，對眼黏膜、上呼吸道黏膜等產(chǎn)生刺激作用[19-20]。DDMP會在體外誘導(dǎo)DNA鏈發(fā)生斷鏈和突變[21]，也會刺激大鼠體內(nèi)自主神經(jīng)活動[22]。此外，糠醛、HMF和DDMP帶有苦味，會影響食品的可接受度[8,23]。因此，DMP、HMF和糠醛仍然被認(rèn)為是許多食品中嚴(yán)格控制的成分，進(jìn)一步了解它們在不同MR體系中的形成途徑，對于在實(shí)際應(yīng)用中合理管理食品加工和貯藏具有重要意義[24]。目前，糠醛被允許作為香料使用，但在不同食品中有明確限量[1]；歐洲食品安全委員會推薦HMF的最大限量為1.6 mg/人/d；Janzowski等[25]認(rèn)為攝入HMF 0.5～1.0 mg/kg沒有健康威脅。

目前大部分研究著重關(guān)注HMF的生成。盧鍵媚等[26]建立了糖-酸模型體系，研究了反應(yīng)條件對3-DG和HMF生成的影響，結(jié)果表明，果糖和蔗糖反應(yīng)體系中3-DG和5-HMF生成量遠(yuǎn)高于葡萄糖反應(yīng)體系。歐雋瀅等[24]研究了5種添加物對模型體系中HMF的生成影響，證實(shí)碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽在模擬體系和餅干中可以顯著減少 HMF 形成；硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨則大幅增加HMF生成量。Gükmen等[6]基于水果貯藏過程中二羰基化合物與HMF的存在情況，討論了美拉德反應(yīng)在水果中的新角色。關(guān)于DDMP、HMF和糠醛在焦糖化和美拉德反應(yīng)體系共同生成規(guī)律的研究不多，本文通過建立3種焦糖化體系、3種美拉德體系，探究不同反應(yīng)體系，不同單糖種類以及賴氨酸的引入對DDMP、HMF和糠醛生成的影響，以期為食品貯藏、熱加工提供有效的安全引導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-果糖（純度≥99.0%）、D-木糖（純度≥98.0%）、L-賴氨酸（純度≥99.0%）、5-羥甲基糠醛（HMF）、糠醛、鄰苯二胺（OPD，純度≥99.0%） 上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司；D-葡萄糖 純度≥99.5%，天津市化學(xué)試劑三廠；3-脫氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone, 3-DG） 上海紫霞生物科技有限公司；磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O） 純度≥99.0%，天津市風(fēng)船化學(xué)化學(xué)試劑有限公司；DDMP 由實(shí)驗(yàn)室自行制備分離得到，其詳細(xì)信息見已發(fā)表的文獻(xiàn)[27]。

SB25-12DTD超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；CTL550低速離心機(jī) 湖南湘立儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器 上海馳唐電子有限公司；ZYCGF-III-20T超純水制備系統(tǒng) 四川卓越水處理設(shè)備有限公司；BCD-576WDPU冰箱海爾公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國熱電公司；pH計 上海美普達(dá)儀器有限公司；DF-II數(shù)顯集熱式油浴磁力攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LC-DCY-12G氮吹儀 上海力辰儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 焦糖化反應(yīng)體系的制備 準(zhǔn)確稱取1.0 mol木糖（Xyl）、葡萄糖（Glc）和果糖（Fru），分別溶解于適量的磷酸鹽緩沖液（0.2 moL/L，pH5.8）中，并用該緩沖液定容至1000 mL，得到濃度為1.0 mol/L的單糖溶液。利用移液槍準(zhǔn)確移取5.0 mL上述溶液至耐高溫消解管中，螺旋蓋密封，置于120 ℃油浴鍋中分別加熱10、30、60、90、120 min，每組做兩個平行。所有樣品溶液反應(yīng)完成后，立即取出置于冰水中以終止反應(yīng)。冷卻后的樣品溶液移入10 mL離心管，置于4 ℃冰箱中待測。

1.2.2 美拉德反應(yīng)體系的制備 準(zhǔn)確稱取1.0 mol Xyl和賴氨酸（Lys）、Glc和Lys，以及Fru和Lys，分別溶解于適量的磷酸鹽緩沖液（0.2 moL/L，pH5.8）中，并用該緩沖液定容至1.0L，分別得到濃度為1.0 mol/L，摩爾比1:1的Xyl-Lys、Glc-Lys、Fru-Lys三種體系的溶液。準(zhǔn)確吸取5.0 mL上述溶液到耐高溫消解管中，旋緊瓶蓋，置于120 ℃油浴鍋中分別加熱10、30、60、90、120 min，每組做兩個平行。所有樣品溶液反應(yīng)完成后，立即取出置于冰水中以終止反應(yīng)。冷卻后的樣品溶液移入10 mL離心管，置于4 ℃冰箱中待測。

1.2.3 DDMP、HMF及糠醛的測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 準(zhǔn)確稱取DDMP、HMF和糠醛標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別用超純水溶解并定容到10 mL容量瓶中，得到每種標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別用甲醇水溶液（甲醇:水=1:4，v/v）進(jìn)行梯度稀釋，得到濃度為1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后，上機(jī)測定。

1.2.3.2 樣品溶液的處理 所有反應(yīng)溶液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后，HPLC檢測，其中木糖-賴氨酸、葡萄糖-賴氨酸體系分別稀釋10倍和5倍后檢測。

1.2.3.3 色譜分析條件 參考課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[28]，采用高效液相色譜法（HPLC）對3種物質(zhì)進(jìn)行測定，其中單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性分析，混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量分析。色譜條件如下：色譜柱：Hypersil GOLDTMC18（5 μm，250×4.6 mm）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速1.0 mL/min；檢測波長284 nm；流動相：A相為甲醇，B相為水，梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 DDMP、HMF和糠醛的HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution procedure for the analysis of DDMP,HMF and furfural by HPLC

1.2.4 3-DG的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品衍生化 準(zhǔn)確稱取3-DG標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用去離子水溶解并定容到10 mL容量瓶中，得到3-DG標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。參考課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[28]，取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液與800 μL鄰苯二胺（1.0mg/mL于pH7.0的磷酸緩沖液中）混合均勻，37 ℃水浴衍生化12 h，得到濃度分別為1、2、5、10、20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品衍生化溶液，相同條件下，取200 μL反應(yīng)溶液與800 μL鄰苯二胺衍生化，過0.22 μm水系膜，待測。

1.2.4.2 色譜分析條件 采用高效液相色譜法（HPLC）對3-DG進(jìn)行測定，色譜條件如下：色譜柱：Hypersil GOLDTMC18（5 μm，250×4.6 mm）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速0.6 mL/min；檢測波長315 nm；流動相：A相為甲醇，B相為水，梯度洗脫，洗脫條件見表2。

表2 3-DG測定的HPLC梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions for 3-DG determination by HPLC

1.2.5 中間和終末產(chǎn)物分析 參照文獻(xiàn)[27]，采用紫外分光光度法測定反應(yīng)體系樣品的中間產(chǎn)物和褐變產(chǎn)物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室分光光度計準(zhǔn)確度，所有樣品稀釋后吸光度為0.2～0.8時，記錄數(shù)據(jù)，以記錄數(shù)據(jù)乘以稀釋倍數(shù)為最終結(jié)果作為中間產(chǎn)物和終末產(chǎn)物的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為兩次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)先采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一和初始分析處理。運(yùn)用Origin 2018進(jìn)行作圖和擬合處理，運(yùn)用SPSS18.0進(jìn)行方差分析，不同字母表示在兩組之間有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測DDMP、HMF和糠醛

一般美拉德反應(yīng)體系常由等摩爾的羰基和氨基構(gòu)成[27]，作為人體必需氨基酸之一，賴氨酸在食品原料中廣泛存在[29]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇賴氨酸參與的美拉德模型作為研究對象。采用HPLC對焦糖化和美拉德反應(yīng)體系中的DDMP、HMF和糠醛進(jìn)行檢測，圖1為三種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、焦糖化樣品和美拉德樣品的液相色譜圖。三種物質(zhì)的保留時間、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3。如圖1所示，在1.2.3.3的色譜條件下，三種物質(zhì)在10 min實(shí)現(xiàn)完全分離，峰型和分離度均較理想。不同反應(yīng)樣品的基質(zhì)簡單，色譜圖未見明顯干擾，可以準(zhǔn)確對三種化合物進(jìn)行積分和定量分析。圖1C中美拉德反應(yīng)樣品DDMP生成量較大，定量時需稀釋后分析，為便于比較，使用了稀釋前的樣品。

表3 三種物質(zhì)的保留時間、線性方程及決定系數(shù)Table 3 Retention time, linear equation and correlation coefficient of three compounds

2.2 不同體系中DDMP、HMF和糠醛的生成規(guī)律

2.2.1 DDMP的生成 不同焦糖化及美拉德反應(yīng)體系中DDMP的生成規(guī)律見圖2，由圖2可知，隨著加熱時間的延長，焦糖化體系中的DDMP含量逐漸升高，其DDMP含量順序?yàn)楣牵灸咎牵酒咸烟牵咸烟羌訜釙r沒有DDMP檢出；而美拉德體系中DDMP呈先增加后降低的趨勢，這是因?yàn)镈DMP不穩(wěn)定，在反應(yīng)中會發(fā)生降解[30]，在反應(yīng)前期，DDMP急劇累積，后期隨著底物消耗，降解速度大于生成速度，DDMP含量下降。DDMP在美拉德體系中的生成量（最大為125.11±1.54 mg/L）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于焦糖化體系（最大為3.21±0.18 mg/L），其順序?yàn)槟咎?賴氨酸＞葡萄糖-賴氨酸＞果糖-賴氨酸，與焦糖化體系差異較大。這表明賴氨酸的參與促進(jìn)了DDMP的生成。

2.2.2 HMF的生成 不同焦糖化及美拉德反應(yīng)體系中HMF的生成規(guī)律見圖3，由圖3可知，隨著加熱時間的延長，兩種體系中的HMF含量逐漸升高（P＜0.05），經(jīng)過方差和多重比較分析發(fā)現(xiàn)，焦糖化體系中HMF含量順序?yàn)楣亲罡撸咸烟谴沃?，木糖最少；而美拉德體系中葡萄糖-賴氨酸中的含量與果糖-賴氨酸沒有顯著性差異，木糖-賴氨酸體系中沒有HMF檢出；由圖3可知，對比果糖和果糖-賴氨酸體系，賴氨酸的參與反而抑制了HMF的生成。

圖 1 3種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standards and samples

2.2.3 糠醛的生成 不同焦糖化及美拉德反應(yīng)體系中糠醛的生成規(guī)律見圖4，由圖4可知，糠醛主要在焦糖化體系中生成，并且木糖體系中糠醛的生成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他體系，木糖是五碳糖，五碳糖降解易生成糠醛，這與前人報道的結(jié)果一致[1]。三種美拉德體系中均沒有糠醛檢出。這說明賴氨酸的參與也抑制了糠醛的生成。

圖 2 焦糖化和美拉德反應(yīng)中DDMP的生成Fig.2 Formation of DDMP in caramelization and Maillard reaction

圖 3 焦糖化和美拉德反應(yīng)中HMF的生成Fig.3 Formation of HMF in caramelization and Maillard reaction

2.3 3-DG的生成

1-DG和3-DG分別是焦糖化和美拉德反應(yīng)體系中DDMP和3-DG的前體物質(zhì)，由于目前缺乏1-DG標(biāo)品，本實(shí)驗(yàn)只測定了不同體系中3-DG中的含量。如圖5所示，在焦糖化體系中，3-DG的生成規(guī)律與HMF一致，這說明果糖焦糖化體系中HMF生成量的增加主要取決于果糖降解生成較多的3-DG。然而在美拉德體系中，3-DG在木糖/果糖-賴氨酸體系中沒有檢出，在葡萄糖-賴氨酸體系加熱初期生成較多，30 min之后逐漸降解，直至無法檢出。下文將結(jié)合反應(yīng)強(qiáng)度綜合討論DDMP、HMF及糠醛的生成途徑。

圖 4 焦糖化和美拉德反應(yīng)中糠醛的生成Fig.4 Formation of furfural in caramelization and Maillard reaction

圖 5 焦糖化和美拉德反應(yīng)中3-DG的生成Fig.5 Formation of 3-DG in caramelization and Maillard reaction

2.4 DDMP、HMF及糠醛生成途徑分析

一般認(rèn)為，在焦糖化反應(yīng)中，戊糖脫水反應(yīng)后生成糠醛[1]，己糖經(jīng)脫水后生成 HMF和DDMP，而反應(yīng)劇烈時，HMF會裂解為糠醛[23]。在MR中，氨基和羰基先形成席夫堿，席夫堿重排生成阿馬道里重排產(chǎn)物（Amadori rearrangement products，ARPs）或者海因斯重排產(chǎn)物（Heyenes rearrangement products，HRPs）。當(dāng)反應(yīng)體系pH≤7時，ARPs或者HRPs主要發(fā)生1,2-烯醇化形成二羰基化合物 3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG），后環(huán)化形成糠醛及HMF等[26]；當(dāng)反應(yīng)體系pH＞7 時，ARPs或者HRPs則發(fā)生2,3-烯醇化反應(yīng)、產(chǎn)生1-脫氧葡萄糖醛酮（1-DG），之后環(huán)化形成DDMP[31]。HMF和DDMP既在焦糖化反應(yīng)中生成，也在MR中生成，兩者隨著反應(yīng)體系及條件的變化存在競爭關(guān)系。三種物質(zhì)在焦糖化和美拉德體系下的生成路徑見圖6[28,32]。

最近的研究表明干熱或低水分時，葡萄糖-脯氨酸體系易發(fā)生2,3烯醇化，更多地生成DDMP[28]，由此可見，除pH以外，水分含量及氨基酸活性也會影響DDMP和HMF的生成。反應(yīng)產(chǎn)物的生成含量與底物濃度、反應(yīng)溫度、時間、體系pH等因素有關(guān)，而這些因素都會直接影響反應(yīng)強(qiáng)度[28]。一般通常用反應(yīng)物消耗、初級、中間及終末成色產(chǎn)物（brown products，BPs）的生成來表征美拉德反應(yīng)進(jìn)程。Li等[27]證實(shí)無色中間產(chǎn)物（uncolored intermediate products，UIPs）是美拉德反應(yīng)中BPs的主要前體物質(zhì)，一般用294 nm處的紫外吸收值（A294）來表征，標(biāo)志著顏色變化的開始。UIPs主要包括糖基化產(chǎn)生的醛類、酮類等物質(zhì)[33]。一般用420 nm處的吸光值來表征BPs的生成，表示美拉德反應(yīng)的褐變程度[34]。本文采用A294和A420表征反應(yīng)強(qiáng)度。

三種焦糖化體系的美拉德反應(yīng)均不劇烈，A420很小，幾乎沒有成色物質(zhì)生成。A294值也并沒有顯著性差異（數(shù)據(jù)未給出），這表明在反應(yīng)強(qiáng)度相近的情況下，單糖結(jié)構(gòu)是影響DDMP、HMF和糠醛的主要因素。焦糖化體系中3-DG的含量與HMF生成一致，均為果糖＞葡萄糖＞木糖。圖7為美拉德反應(yīng)體系中反應(yīng)強(qiáng)度的變化。由圖7可知，美拉德反應(yīng)的強(qiáng)度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于焦糖化體系。DDMP生成與A294的趨勢呈正相關(guān)，均為木糖-賴氨酸＞葡萄糖-賴氨酸＞果糖-賴氨酸。然而HMF和糠醛的生成卻呈現(xiàn)不同的趨勢。盡管木糖-賴氨酸體系的A294值最大，但該體系中卻沒有HMF和糠醛檢出。相反HMF更容易在葡萄糖/果糖-賴氨酸體系中生成。這主要是因?yàn)镠MF還有一個關(guān)鍵的不飽和前體物質(zhì)3,4-DGE（圖6），3,4-DGE存在Z和E兩個異構(gòu)體，只有Z能夠形成HMF[35-36]。無論是DDMP、HMF、糠醛，還是3-DG，在強(qiáng)度很大的美拉德反應(yīng)中，均屬于動態(tài)變化。隨著反應(yīng)物的消耗，DDMP會進(jìn)一步分解生成小分子酮類及其他裂解產(chǎn)物，而HMF會進(jìn)一步參與到褐變反應(yīng)，生成BPs。對比A420值發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時間的延長，三種美拉德體系的褐變值逐漸接近。在120 min時，木糖-賴氨酸體系有半固態(tài)樹脂化產(chǎn)物生成，導(dǎo)致A420測定值降低。這說明，木糖-賴氨酸中中間產(chǎn)物更快地參與到了褐變反應(yīng)中。3-DG除了脫水環(huán)化生成HMF之外，還會發(fā)生反縮醛化生成丙酮醛等小分子醛類[37]，進(jìn)一步參與到高級反應(yīng)階段。因此，在美拉德體系中監(jiān)測到的3-DG變化只是一個靜態(tài)值，并不能直接反映體系中3-DG是否產(chǎn)生（圖5B）。Kanzler等[36]報道發(fā)現(xiàn)在麥芽糖-脯氨酸和麥芽糖-丙氨酸體系中，沒有檢測到1-DG和3-DG，但DDMP濃度卻分別達(dá)到113和138 μmol/L。這意味著二羰基化合物真實(shí)產(chǎn)生過，但由于反應(yīng)過于劇烈沒有被追蹤到。

圖 6 己糖焦糖化和美拉德反應(yīng)中DDMP、HMF和糠醛的生成路徑Fig.6 Proposed formation pathway for DDMP, HMF and furfural from caramelization and Maillard reaction models

圖 7 美拉德反應(yīng)中中間產(chǎn)物（A294）和終末產(chǎn)物（A420）的變化Fig.7 Evolution of the absorbance at 294 nm (A) and 420 nm(B) as indicators of intermediate and advanced stages of MR, respectively

3 結(jié)論

本文基于120 ℃油浴加熱，建立了木糖、果糖、葡萄糖焦糖化體系及木糖/果糖/葡萄糖-賴氨酸美拉德體系來研究DDMP、HMF和糠醛的生成規(guī)律。結(jié)果表明，體系生成的三種物質(zhì)含量隨著加熱時間的延長而增加。果糖焦糖化體系中HMF的生成量最高，木糖焦糖化體系中糠醛的含量最高，賴氨酸通過競爭性抑制單糖降解的焦糖化途徑抑制HMF和糠醛的生成。DDMP在果糖和木糖焦糖化體系中均有生成，但含量不高。賴氨酸的參與促進(jìn)了美拉德體系中DDMP的大量生成，尤其在木糖-賴氨酸體系中，DDMP的含量達(dá)到了125.11±1.54 mg/L。結(jié)合A294和A420結(jié)果可知，單糖結(jié)構(gòu)差異與賴氨酸競爭性參與單糖降解是影響DDMP、HMF和糠醛生成的主要因素。