雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的種類鑒定及其寄主范圍測(cè)定*

黃奕蔓，白津銘，朱文倩，李 峰，黃桂香，廖詠梅

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004)

雞蛋花Plumeriarubra是一種落葉灌木，樹冠茂盛、花朵清香，是世界上多個(gè)國家的重要園林樹種，我國廣東、廣西、海南等省區(qū)均有種植[1]。雞蛋花銹病(Plumeria rust)是雞蛋花的一種重要病害，病原菌為雞蛋花鞘銹菌Coleosporiumplumeriae，感病葉片表面出現(xiàn)淡黃色病斑，葉片背面的病斑有大量橙黃色的夏孢子堆，發(fā)病后期葉片壞死，提前脫落，影響樹勢(shì)[2]。目前，印度[3]、美國、馬來西亞[4]、越南和中國[5]均有雞蛋花銹病的報(bào)道。

利用重寄生真菌防治植物銹病已有一些報(bào)道。李靖等[6]報(bào)道一種子囊菌門Ascomycota擬盤多毛孢屬真菌Pestalotiopsiskenyana是茶麃生柱銹菌Cronartiumribicola的重寄生真菌，將P.kenyana的孢子懸浮液接種于茶麃生柱銹菌的銹孢子堆上5 d，P.kenyana的菌絲完全覆蓋茶麃生柱銹菌的銹孢子堆，在電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，茶麃生柱銹菌的銹孢子內(nèi)含物濃縮，銹孢子壁變形。沈闊程[7]研究發(fā)現(xiàn)枝孢樣枝孢霉Cladosporiumcladosporioides是落葉松-楊柵銹菌Melampsoralarici-populina的重寄生真菌，將枝孢霉的孢子懸浮液噴于落葉松楊柵銹菌的夏孢子堆上10 d，在電子顯微鏡下觀察到夏孢子有菌絲穿透，原生質(zhì)退化，在光照16 h/黑暗8 h、25℃的條件下，夏孢子萌發(fā)率從69.92%下降至36.74%。隋國強(qiáng)等[8]報(bào)道2種擬盤多毛孢菌P.kenyana和P.oryza均為石楠銹孢銹菌Aecidiumpourthiaea的重寄生真菌，將P.kenyana和P.oryza的孢子懸浮液分別接種于石楠銹孢銹菌的銹孢子堆后，在光學(xué)顯微鏡下觀察到銹孢子均變成空殼。有關(guān)雞蛋花鞘銹菌的重寄生真菌，僅見Baiswar等[9]報(bào)道鞘柄銹柱隔孢菌Ramulariacoleosporii為雞蛋花鞘銹菌的重寄生真菌，但僅鑒定了重寄生真菌的種類，未見其對(duì)雞蛋花鞘銹菌的重寄生作用的研究。

本研究在廣西南寧市上林縣萬古茶園采集有重寄生現(xiàn)象的雞蛋花銹病葉片，通過分離和純化病葉背面病原菌夏孢子堆上的白色霉?fàn)钗?，結(jié)合形態(tài)特征觀察和ITS、SSU、LSU的序列分析，鑒定重寄生真菌的種類，并測(cè)定其寄主范圍，為豐富植物銹菌重寄生真菌的資源及開展雞蛋花銹病及其他植物銹病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

在廣西南寧市上林縣萬古茶園采集雞蛋花鞘銹菌夏孢子堆上覆蓋著白色霉?fàn)钗锏碾u蛋花銹病葉片；在廣西大學(xué)學(xué)生宿舍區(qū)采集未施用農(nóng)藥的雞蛋花鞘銹菌夏孢子堆上覆蓋著白色霉?fàn)钗锏碾u蛋花銹病葉片；在廣西大學(xué)常規(guī)噴灑農(nóng)藥的綠化區(qū)采集雞蛋花鞘銹菌夏孢子堆呈橙黃色、無白色霉?fàn)钗锔采w的雞蛋花銹病葉片；在廣西大學(xué)多功能標(biāo)本園采集無花果Ficuscarica銹病(Ceroteliumfici，無花果蠟銹菌)葉片；在廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)科新城(扶綏)采集甘蔗銹病(Pucciniakuehnii，屈恩柄銹菌)葉片；在廣西藥用植物園采集雞矢藤Paederiafoetida銹病(C.paederiae，雞矢藤鞘銹菌)、楊樹Populussimonii銹病(M.larici-populina，落葉松-楊柵銹菌)、虎杖Polygonumcuspidatum銹病(Pucciniapolygoni-amphibii，兩棲蓼柄銹菌)、美人蕉Cannaindica銹病(P.thaliae，美人蕉柄銹菌)和紫蘇Perillafrutescens銹病(C.plectranthi，香茶菜鞘銹菌)葉片；在廣西玉米研究所采集玉米銹病(P.sorghi，玉米柄銹菌)葉片。

1.1.2 儀器與試劑

SU5000發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，VHX-6000超景深三維顯微系統(tǒng)(日本基恩士公司)，80i光學(xué)顯微鏡(日本Nikon株式會(huì)社)，F(xiàn)ire reader XS D-55-26凝膠成像系統(tǒng)(英國UVItec公司)，EMS150R噴金儀(美國Electron Microscopy Sciences公司)，DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，LRH-300-G恒溫光照培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)，XW-80A渦旋混合器(上海青浦滬西儀器廠)，移液器(德國Eppendorf公司)，血球計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)。

Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技股份有限公司)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)，Dream Taq Green PCR Master Mix (2×)、雙蒸水(Double distilled water，dd H2O)(南寧國拓生物科技有限公司)，引物ITS1、ITS4、NS1、NS4、NL1、NL4 [生工生物技術(shù)(上海)股份有限公司合成]，pH值6.8磷酸鹽緩沖液(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的分離與純化

用無菌接種針挑取雞蛋花銹病葉片背面夏孢子堆上的白色菌絲體，移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)平板上，置于恒溫光照培養(yǎng)箱，在光照16 h/黑暗8 h、28℃的條件下培養(yǎng)。待長(zhǎng)出的白色菌落直徑達(dá)1 cm左右時(shí)，用無菌接種針挑取邊緣菌絲體，移到新的PDA平板上純化，純化操作重復(fù)3次。在光學(xué)顯微鏡下觀察到產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢純化。用滅菌牙簽在PDA平板上刮取菌絲體，收集于2 mL的滅菌離心管中，加入1.5 mL滅菌去離子水和2個(gè)直徑2 mm的滅菌玻璃珠，置于渦旋混合器振蕩，用4層紗布過濾后，得到分生孢子懸浮液。將分生孢子懸浮液稀釋1 000倍后，涂布于新的PDA平板上，在光學(xué)顯微鏡下挑取單個(gè)分生孢子，再將單個(gè)分生孢子移至新的PDA平板上，置于光照16 h/黑暗8 h、28℃的條件下培養(yǎng)，當(dāng)單個(gè)菌落直徑達(dá)0.5 cm左右時(shí)，用無菌接種針將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到PDA斜面上，28℃培養(yǎng)至菌絲體長(zhǎng)滿斜面，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)雞蛋花銹病、雞蛋花鞘銹菌和重寄生現(xiàn)象(Hyperparasitism)的英文名或?qū)W名的首字母組合PR-CPH標(biāo)記單孢純化的菌株。

1.2.2 雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的重寄生性驗(yàn)證

將單孢純化的菌株置于PDA平板上活化，當(dāng)菌落直徑達(dá)3 cm時(shí)，用牙簽刮取菌絲體，按照1.2.1節(jié)的方法制作分生孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板將分生孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至108個(gè)/mL。將分生孢子懸浮液噴灑于雞蛋花銹病葉片背面的夏孢子堆上，以噴灑無菌水為對(duì)照，每處理3張雞蛋花銹病葉片，重復(fù)3次。將接種后的雞蛋花銹病葉片放在底部墊有濕棉花的泡沫盒中保濕，置于28℃下培養(yǎng)，每日觀察雞蛋花銹病葉片上夏孢子堆表面的變化，用光學(xué)顯微鏡觀察拍攝夏孢子的形態(tài)特征。

1.2.3 光學(xué)顯微鏡下雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的形態(tài)特征觀察

選擇雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的代表菌株，將其菌絲塊置于PDA平板中部，在菌絲塊附近呈45°斜插一塊滅菌蓋玻片(20 mm×20 mm)，置于光照16 h/黑暗8 h、28℃的恒溫培養(yǎng)箱中。當(dāng)菌絲體長(zhǎng)滿蓋玻片時(shí)，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 掃描電子顯微鏡下雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的形態(tài)特征觀察

首先將有重寄生現(xiàn)象的雞蛋花銹病葉片切為3 mm×3 mm的小塊，浸入2.5%的戊二醛中，在4℃下固定12 h；然后在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值6.8)中漂洗3次，每次10 min，室溫下用乙醇系列濃度(30%、50%、70%、80%、90%和95%)分別脫水15 min；最后用100%乙醇脫水3次，每次30 min。脫水后的樣品置于干燥箱中，28℃干燥1 d。用噴金儀在干燥后的葉片小塊上噴一層鉑鈀合金，置于掃描電子顯微鏡下觀察，加速電壓為10 kV。

1.2.5 雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的ITS、SSU和LSU基因測(cè)序與分析

將雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的單孢菌株置于PDA平板上，28℃培養(yǎng)至菌落直徑3 cm，用滅菌牙簽收集菌絲體，置于1.5 mL離心管中，使用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒，按照說明書提取總DNA，并置于-20℃冰箱保存。用引物對(duì)ITS1/ITS4擴(kuò)增ITS區(qū)域，NS1/NS4擴(kuò)增SSU基因，NL1/NL4擴(kuò)增LSU基因。引物序列見表1。

表1 引物對(duì)的核酸序列Table 1 Nucleotide sequence of primer pair

PCR反應(yīng)體系20 μL：模板DNA 1 μL(20 ng/μL)、上下游引物各1 μL(1 mmol/L)、Dream Taq Green PCR Master Mix (2×)10 μL、ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。將擴(kuò)增獲得清晰單一條帶的PCR產(chǎn)物送至生工生物技術(shù)(上海)股份有限公司測(cè)序。將獲得的核酸序列上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，同時(shí)用BLAST比對(duì)序列的一致性。將3個(gè)序列聯(lián)合(ITS-SSU-LSU)后，選擇MEGA 6.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining method，NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12]。系統(tǒng)發(fā)育樹的每個(gè)分支以自展法(Bootstrap)檢驗(yàn)，重復(fù)值設(shè)定為1 000次。

1.2.6 雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌寄主范圍的測(cè)定

將雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的分生孢子懸浮液噴灑到無花果銹病、雞矢藤銹病、甘蔗銹病、玉米銹病、楊樹銹病、虎杖銹病、美人蕉銹病和紫蘇銹病葉片背面的夏孢子堆上，按照1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行重寄生性測(cè)定。每日觀察夏孢子堆表面的變化，當(dāng)觀察到夏孢子堆上出現(xiàn)白色菌絲體時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下觀察夏孢子的形態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞蛋花鞘銹菌重寄生現(xiàn)象

雞蛋花銹病葉片背面的夏孢子堆呈橙黃色[圖1(b)]，在超景深三維顯微系統(tǒng)下，可見夏孢子呈橙黃色、卵圓形，聚集成堆[圖1(c)]。有重寄生現(xiàn)象的雞蛋花銹病葉片背面的夏孢子堆表面呈白色[圖1(a)]，在超景深三維顯微系統(tǒng)下發(fā)現(xiàn)有大量白色菌絲體覆蓋橙黃色夏孢子堆[圖1(d)]，撥開表面的白色菌絲體，發(fā)現(xiàn)夏孢子堆變成白色[圖1(e)]。

(a)雞蛋花銹病葉背夏孢子堆上覆蓋白色菌絲體；(b)雞蛋花銹病葉背夏孢子堆橙黃色；(c)雞蛋花鞘銹菌的夏孢子堆；(d)被重寄生真菌覆蓋的夏孢子堆；(e)菌絲體下的夏孢子堆變白(a) The uredinia were covered by white mycelia on the reverse side of plumeria rust leaf；(b) The orange-yellow uredinia on the reverse side of plumeria rust leaf；(c) The uredinia of C.plumeriae；(d) The uredinia were covered by the hyperparasitic fungus；(e) The uredinia under the mycelia became white圖1 雞蛋花銹病及雞蛋花鞘銹菌的重寄生現(xiàn)象Fig.1 Plumeria rust and the hyperparasitism of Coleosporium plumeriae

2.2 雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的分離和純化及其重寄生性驗(yàn)證

挑取雞蛋花鞘銹菌夏孢子堆表面的白色菌絲體，經(jīng)分離和單孢純化，得到菌落形態(tài)相同、分生孢子特征一致的真菌菌株12個(gè)，標(biāo)記為PR-CPH1至PR-CPH12。選擇菌株P(guān)R-CPH1為代表菌株進(jìn)行重寄生性驗(yàn)證，在雞蛋花銹病葉片背面噴灑菌株P(guān)R-CPH1的分生孢子懸浮液后3 d，觀察到大量白色菌絲體覆蓋夏孢子堆表面[圖2(a)]，噴灑無菌水的對(duì)照葉片背面夏孢子堆保持橙黃色[圖2(b)]。噴灑分生孢子懸浮液后7 d，在光學(xué)顯微鏡下，可見被重寄生的夏孢子周圍長(zhǎng)有菌絲，夏孢子邊緣破碎，失去原有的形狀，顏色由橙黃色變?yōu)橥该鱗圖2(c)]。正常的夏孢子邊緣完整，近圓形，橙黃色[圖2(d)]。在掃描電子顯微鏡下，被重寄生的夏孢子畸形、皺縮，周圍可見許多菌絲體和分生孢子[圖2(e)]，正常的夏孢子飽滿、近球形[圖2(f)]。

2.3 雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌的形態(tài)特征

在PDA平板上，菌株P(guān)R-CPH1菌落近圓形，白色，凸起，表面有皺褶，邊緣光滑，氣生菌絲質(zhì)地緊密；菌落背面黃色，有皺褶；28℃培養(yǎng)7 d，菌落直徑26-27 mm。在光學(xué)顯微鏡下，菌株P(guān)R-CPH1的分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)，呈菌絲狀；分生孢子呈頭狀聚生在分生孢子梗頂端，近圓形或卵圓形，單胞，無色，大小(0.5-1.0) μm×(0.9-1.2) μm。在掃描電子顯微鏡下，分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)，呈菌絲狀，分生孢子分散，呈長(zhǎng)橢圓形(圖3)。

(a)噴灑菌株P(guān)R-CPH1的分生孢子懸浮液3 d的雞蛋花銹病葉片背面；(b)噴灑無菌水3 d的雞蛋花銹病葉片背面；(c)被重寄生的夏孢子周圍可見菌絲與分生孢子，(c1)菌絲，(c2)分生孢子；(d)橙黃色的正常夏孢子；(e)被重寄生的夏孢子邊緣皺縮；(f)近球形的正常夏孢子(a) The reverse of plumeria rust leaf was sprayed with conidia suspension of strain PR-CPH1 for 3 d；(b) The reverse of plumeria rust leaf were sprayed with sterile water for 3 d；(c) The mycelia and conidia appeared around urediniospore with hyperparasitized,(c1) Myceliumum,(c2) Conidium；(d) Normal orange-yellow urediniospore；(e) The edge of the urediniospore with hyperparasitized was shrunken；(f) Normal subglobose urediniospore圖2 菌株P(guān)R-CPH1的重寄生性驗(yàn)證Fig.2 Hyperparasitism assay of strain PR-CPH1

(a),(b)在PDA上28℃培養(yǎng)7 d的菌落；(a)菌落正面白色；(b)菌落背面黃色；(c)分生孢子呈頭狀聚集在分生孢子梗頂端，(c1)分生孢子梗，(c2)分生孢子；(d)分生孢子；(e)菌絲體和分生孢子，(e1)菌絲體，(e2)分生孢子；(f)分生孢子梗和分生孢子，(f1)分生孢子梗，(f2)分生孢子(a),(b) The colony on PDA after incubated at 28°C for 7 d；(a) The obverse side of the colony was white；(b) The reverse side of the colony was yellow；(c) Conidia capitate aggregation at the apex of the conidiophore，(c1) Conidiophore，(c2) Conidia；(d) Conidia；(e) Mycelia and conidia，(e1) Mycelium，(e2) Conidia；(f) Conidiophore and conidium，(f1) Conidiophore，(f2) Conidium圖3 雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌菌株P(guān)R-CPH1的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain PR-CPH1 of hyperparasitic fungus of Coleosporium plumeriae

2.4 雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌ITS、SSU和LSU的序列分析

菌株P(guān)R-CPH1的總DNA經(jīng)PCR獲得的ITS序列(MW505984)、SSU序列(MW505988)和LSU序列(MW505987)均與Simplicilliumsubtropicum的相應(yīng)片段序列有98%以上的序列一致性，即與GenBank數(shù)據(jù)庫中S.subtropicum的ITS(AB603990)、SSU(LC496895)和LSU(LC496880)的序列一致性分別達(dá)99.00%、98.11%和98.11%。下載GenBank上發(fā)布的10種Simplicillium主要真菌種類的ITS、SSU和LSU序列，以Lecconicillium真菌L.acerosum(菌株號(hào)：CBS418.81)作為外種，在3個(gè)片段聯(lián)合序列(ITS-SSU-LSU)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株P(guān)R-CPH1與S.subtropicum(菌株號(hào)：JCM18180)的聯(lián)合序列(ITS-SSU-LSU)聚在同一分支(圖4)。

圖4 菌株P(guān)R-CPH1與Simplicillium屬的10種真菌基于ITS-SSU-LSU聯(lián)合序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain PR-CPH1 and 10 species fungi in Simplicillium based on the combined sequences (ITS-SSU-LSU)

根據(jù)Nonaka等[13]對(duì)S.subtropicum的形態(tài)特征描述及菌株P(guān)R-CPH1的ITS、SSU和LSU3個(gè)片段聯(lián)合序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株P(guān)R-CPH1為S.subtropicum。S.subtropicum的菌落正面凸起，白色氣生菌絲致密，菌落背面黃色或棕色，無色素分泌；在PDA上25℃培養(yǎng)7 d后，菌落直徑為22-25 mm[13]。S.subtropicum的分類地位為子囊菌門Ascomycota糞殼菌綱Sordariomycetes肉座菌目Hypocreales蟲草菌科Cordycipitaceae單梗霉屬Simplicillium。

2.5 雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌對(duì)其他植物銹病菌的重寄生測(cè)定

將菌株P(guān)R-CPH1的分生孢子懸浮液分別噴灑到8種銹病葉片背面的夏孢子堆上，第3天發(fā)現(xiàn)雞矢藤銹病和紫蘇銹病葉背的夏孢子堆表面長(zhǎng)出白色菌絲體，第10天發(fā)現(xiàn)楊樹銹病葉背的夏孢子堆長(zhǎng)出白色菌絲體，說明這3種植物銹病菌已被重寄生[圖5：(a)(e)(i)]，噴灑清水的對(duì)照銹病葉片背面夏孢子堆保持橙黃色[圖5：(b)(f)(j)]。在光學(xué)顯微鏡下，被重寄生的雞矢藤鞘銹菌和落葉松楊柵銹菌的夏孢子表面長(zhǎng)出菌絲體，菌絲體穿透夏孢子，落葉松-楊柵銹菌夏孢子表面除長(zhǎng)出大量的菌絲體外，還可見分生孢子梗及分生孢子，被重寄生的3種銹病菌的夏孢子均變形，呈透明無色[圖5:(c)(g)(k)]，而對(duì)照的夏孢子近圓形，呈橙黃色[圖5：(d)(h)(l)]?？梢?，菌株P(guān)R-CPH1可以寄生雞矢藤鞘銹菌、香茶菜鞘銹菌和落葉松-楊柵銹菌；而接種于無花果銹病、甘蔗銹病、玉米銹病、虎杖銹病和美人蕉銹病葉片背面的夏孢子堆上15 d后，夏孢子堆表面仍未觀察到白色菌絲體，即無重寄生現(xiàn)象。

3 討論

本研究從雞蛋花鞘銹菌夏孢子堆表面分離到1種重寄生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、重寄生性驗(yàn)證和代表菌株P(guān)R-CPH1的ITS、SSU和LSU3個(gè)序列聯(lián)合分析，鑒定雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌為一種單梗霉屬Simplicillium真菌：Simplicilliumsubtropicum。

在單梗霉屬真菌中，僅見報(bào)道兩種真菌S.obclavatum和S.lanosoniveum為植物銹菌的重寄生真菌。Wang等[14]報(bào)道S.obclavatum重寄生小麥條銹菌P.striiformis，其夏孢子的萌發(fā)率降低。Baiswar等[15]報(bào)道S.lanosoniveum重寄生寬葉胡頹子Elaeagnuslatifolia銹病的病原菌寬葉胡頹子內(nèi)銹菌Endophyllumelaeagni-latifoliae(原名：Aecidiumelaeagni-latifoliae)，被重寄生的夏孢子萎縮，萌發(fā)率降低。S.lanosoniveum不僅是植物銹菌的重寄生菌，還是昆蟲病原真菌和植物病原真菌。王妮等[16]報(bào)道S.lanosoniveum寄生白蠟樹Fraxinuschinensis害蟲桑白盾蚧Pseudaulacaspispentagona，噴灑濃度為108個(gè)/mL的孢子懸浮液36 h后，桑白盾蚧即被感染，144 h后桑白盾蚧雌成蟲的死亡率可達(dá)93.33%。Skaptsov等[17]報(bào)道S.lanosoniveum寄生鴨腳木Scheffleraoctophylla害蟲褐軟蠟蚧Coccushesperidum，噴灑濃度為105個(gè)/mL的孢子懸浮液7 d后，褐軟蠟蚧即被感染。Chen等[18]報(bào)道，在中國臺(tái)灣省，Simplicilliumlanosoniveum可引起耳葉槐葉萍Salviniaauriculata和人厭槐葉萍S.molesta的褐斑病。此外，Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)，Simplicilliumchinense可作為大豆胞囊線蟲Heteroderaglycines和大豆根結(jié)線蟲Meloidogyneincognita的生物防治劑，施用S.chinense48 h后，大豆胞囊線蟲和大豆根結(jié)線蟲幼蟲的死亡率均達(dá)到99%。本研究中雞蛋花鞘銹菌的重寄生真菌S.subtropicum，僅見在喀麥隆被報(bào)道為一種杜氏木屬藥用植物Duguetiastaudtii的內(nèi)生真菌[20],未見其為植物銹菌重寄生真菌的報(bào)道。

(a)，(e)，(i)噴灑菌株P(guān)R-CPH1分生孢子懸浮液，病葉背面的夏孢子堆被白色菌絲體覆蓋；(a)雞矢藤銹??；(e)紫蘇銹病；(i)楊樹銹??；(b)，(f)，(j)噴灑無菌水，病葉背面的夏孢子保持橙黃色；(b)雞矢藤銹??；(f)紫蘇銹??；(j)楊樹銹病；(c)，(g)，(k)被重寄生的夏孢子；(c)雞矢藤鞘銹菌夏孢子表面長(zhǎng)出菌絲體；(g)香茶菜鞘銹菌夏孢子變透明；(k)落葉松-楊柵銹菌夏孢子表面長(zhǎng)出菌絲體，(k1)分生孢子梗，(k2)頭狀聚生的分生孢子；(d)，(h)，(l)正常的橙黃色近圓形夏孢子；(d)雞矢藤鞘銹菌；(h)香茶菜鞘銹菌；(l)落葉松-楊柵銹菌(a)，(e)，(i) Sprayed with conidia suspension of strain PR-CPH1，the uredinia on the reverse of diseased leaf was covered by white mycelia；(a) Paederia rust；(e) Perilla rust；(i) Poplar rust；(b)，(f)，(j) Sprayed with sterile water，the uredinia on the reverse of diseased leaf was kept orange-yellow；(b) Paederia rust；(f) Perilla rust；(j) Poplar rust；(c)，(g)，(k) The urediniospores were hyperparasitized；(c) The mycelia were grown from the surface of C.paederiae；(g) The urediniospore of C.plectranthi became transparent；(k) The mycelia were grown from the surface of M.larici-populina，(k1) The conidiophore of isolate PR-CPH1，(k2) Conidia capitate aggregation at the apex of the conidiophore；(d)，(h)，(l) Normal urediniospores were orange-yellow and suborbicular；(d) C.paederiae；(h) C.plectranthi；(l) M.larici-populina圖5 菌株P(guān)R-CPH1對(duì)雞矢藤鞘銹菌、香茶菜鞘銹菌和落葉松-楊鞘銹菌的重寄生測(cè)定Fig.5 Hyperparasitism assay of strain PR-CPH1 to Coleosporium paederiae,C.plectranthi,and Melampsora larici-populina

廣西大學(xué)校園內(nèi)，在常規(guī)噴灑農(nóng)藥的綠化區(qū)域中，雞蛋花銹病發(fā)生比較嚴(yán)重，但未發(fā)現(xiàn)重寄生現(xiàn)象；在從未噴施農(nóng)藥的學(xué)生宿舍區(qū)中，雞蛋花鞘銹菌的重寄生現(xiàn)象較為普遍。因此，推測(cè)常規(guī)噴灑農(nóng)藥對(duì)雞蛋花鞘銹菌的重寄生有一定的抑制作用。研究雞蛋花鞘銹菌重寄生真菌S.subtropicum的重寄生條件，利用重寄生真菌生物防治雞蛋花銹病，從而減少雞蛋花銹病的發(fā)生和危害，減少農(nóng)藥的使用頻率，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，值得進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，重寄生真菌S.subtropicum可以重寄生雞矢藤鞘銹菌、香茶菜鞘銹菌和落葉松-楊柵銹菌。香茶菜鞘銹菌僅為害紫蘇，引起紫蘇銹病[21]，另外2種銹病菌可引起其他植物的銹病，其中雞矢藤鞘銹菌可引起雞矢藤、毛雞矢藤Paederiacavaleriei和紫皮石斛Dendrobiumdevoninum[22]的銹??；落葉松-楊柵銹菌可引起楊樹和松樹[23]的銹病。因此，進(jìn)一步開展重寄生真菌S.subtropicum對(duì)雞蛋花銹病的生物防治研究，其研究成果可應(yīng)用于由雞矢藤鞘銹菌、香茶菜鞘銹菌和落葉松-楊柵銹菌引起的其他植物銹病上，使應(yīng)用范圍更加廣泛。

4 結(jié)論

本研究在南寧市上林縣萬古茶園采集到有重寄生現(xiàn)象的雞蛋花銹病葉片，大量白色菌絲體覆蓋病葉背面的夏孢子堆。經(jīng)過重寄生性驗(yàn)證、形態(tài)特征觀察和ITS-SSU-LSU聯(lián)合序列分析，鑒定雞蛋花鞘銹菌的重寄生真菌為S.subtropicum。S.subtropicum還可以重寄生雞矢藤鞘銹菌、香茶菜鞘銹菌和落葉松-楊柵銹菌?？梢姡丶纳婢鶶.subtropicum在植物銹病的生物防治中具有潛在的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究。