河南省和湖北省部分地區(qū)雞球蟲分離株對(duì)地克珠利耐藥性調(diào)查

耿天天,葉 成,雷振宇,申 邦,,方 瑞,胡 敏,,趙俊龍,,周艷琴,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070)

雞球蟲病是一種或者多種艾美耳球蟲共感染于禽類腸道的禽病，當(dāng)前控制雞球蟲病主要是通過在飼料里添加抗球蟲藥[1]，隨之而來的雞球蟲耐藥性問題始終困擾著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[2]。河南省和湖北省是禽類養(yǎng)殖大省，其中河南省2018年禽蛋產(chǎn)量為413.61萬噸，湖北省為171.53萬噸，2016年河南省家禽出欄量為93 420萬只，湖北省為52 105.9萬只。面對(duì)規(guī)模如此之大的養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)，保證產(chǎn)蛋率和出肉率的穩(wěn)定是一項(xiàng)巨大工程，因此把好雞球蟲病的防控關(guān)，其重要性不言而喻。地克珠利作為一種目前較為常用的抗球蟲藥[3]，監(jiān)測(cè)其在該地區(qū)的耐藥現(xiàn)狀具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究中，河南11個(gè)地區(qū)和湖北11個(gè)地區(qū)的雞球蟲地方分離株作為研究對(duì)象，以最適抗球蟲活性(percent of optimum anticoccidial activity，POAA)、病變積分減少率(reduction of lesion scores，RLS)、相對(duì)卵囊產(chǎn)量(relative oocyst production，ROP)和抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index，ACI)4項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)[4]各蟲株對(duì)地克珠利的耐藥性，以對(duì)該地區(qū)的用藥提供重要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 所用的動(dòng)物均為白羽肉雞，雛雞于1日齡購(gòu)自湖北省荊州市正康飼料有限公司，后轉(zhuǎn)飼于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)野芷湖雞房。

1.1.2 蟲株 所用的蟲株保存于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室，具體蟲種見表1和表2。

1.1.3 藥物和主要試劑 所用的地克珠利，由上海獸醫(yī)研究所提供。重鉻酸鉀(分析純)，天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 HITACHI高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 球蟲蟲種的擴(kuò)繁 將每株球蟲分離株分別作為一組，每組5只雞進(jìn)行口服感染孢子化卵囊，收集感染后7 d和8 d的糞便，采用飽和食鹽水漂浮法進(jìn)行分離保種，而后于28.6 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行孢子化培養(yǎng)，待其80%完成孢子化后將蟲株保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雞體籠養(yǎng)試驗(yàn)分組 將1日齡的白羽肉雞飼養(yǎng)至13日齡，稱重后淘汰體重過輕或者過重的雞，而后對(duì)每只雞進(jìn)行編號(hào)分組，耐藥性試驗(yàn)共分為3組：感染用藥組，感染不用藥組以及不感染不用藥組(即為空白對(duì)照組)，并于13日齡開始于感染用藥組給藥0.2 g/kg，14日齡稱重作為初始體重，并于當(dāng)日進(jìn)行攻蟲，攻蟲劑量為每只雞0.5×104個(gè)卵囊，21日齡稱重作為終末體重，并收集感染后6 d～7 d的糞便，進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)；在21日齡將雞只處死取雞腸道，觀察并記錄腸道病變計(jì)分。

1.2.3 耐藥性評(píng)價(jià) 以最適抗球蟲活性(POAA)、病變積分減少率(RLS)、相對(duì)卵囊產(chǎn)量(ROP)以及抗球蟲指數(shù)(ACI)對(duì)地克珠利進(jìn)行耐藥性評(píng)價(jià)，在4項(xiàng)指標(biāo)中，1項(xiàng)指標(biāo)為陽性，則表明其為輕度耐藥，2項(xiàng)指標(biāo)為陽性時(shí)，則表明其為中度耐藥，3項(xiàng)和4項(xiàng)指標(biāo)為陽性時(shí)，則表明其為高度耐藥。

最適抗球蟲活性(percent of optimum anticoccidial activity，POAA)% =(感染用藥組增重-感染不用藥組增重/不感染不用藥組增重-感染不用藥組增重)×100%

最適抗球蟲活性(percent of optimum anticoccidial activity，POAA)≥50%為敏感，<50%為耐藥。

病變積分減少率(reduction of lesion scores，RLS)=(感染不給藥組的平均病變值-感染給藥組的平均病變值)/感染不給藥組的平均病變值 ×100%

病變積分減少率(reduction of lesion scores，RLS)≥ 50%為敏感，<50%為耐藥。

相對(duì)卵囊產(chǎn)量(relative oocyst production，ROP)= 感染給藥組卵囊總數(shù)/感染不給藥組卵囊總數(shù)×100%

相對(duì)卵囊產(chǎn)量(relative oocyst production，ROP)<15%為敏感，≥15%為耐藥。

抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index，ACI)=(相對(duì)增重率+存活率)-(病變分值+卵囊值)

相對(duì)增重率(%)=感染用藥組的品均增重/不感染不用藥的平均增重×100%

存活率(%)=試驗(yàn)結(jié)束時(shí)雞只數(shù)/試驗(yàn)開始時(shí)雞只數(shù)×100%

卵囊值，按角田清[5]克糞便卵囊數(shù)(oocysts per gramme，OPG)值的方法進(jìn)行

病變分值 = 平均盲腸病變積分(0～4)×10

卵囊比數(shù)(%)=不感染對(duì)照組或感染用藥組卵囊數(shù)/感染不給藥組卵囊數(shù)×100%

抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index，ACI)≥160，判為陰性；抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index，ACI)≤160，判為陽性[6]。

2 結(jié)果

通過以上4項(xiàng)指標(biāo)對(duì)每一株分離蟲株的綜合評(píng)價(jià)，從表1和表2的結(jié)果可以看出，在河南省34株分離蟲株中，有1株對(duì)地克珠利輕度耐藥，4株對(duì)地克珠利中度耐藥，29株高度耐藥；湖北省35株分離蟲株中，有1株中度耐藥，34株高度耐藥。

表1 河南省雞球蟲分離株對(duì)地克珠利耐藥性判別結(jié)果

表2 湖北省雞球蟲分離株對(duì)地克珠利耐藥性判別結(jié)果

3 討論

耐藥性在雞球蟲中廣泛存在，這目前是制約養(yǎng)禽業(yè)快速發(fā)展的最大難題之一。在幾種常見的抗雞球蟲藥中，地克珠利近些年來的普及使得對(duì)其耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，因此對(duì)于地克珠利耐藥機(jī)制的研究逐漸提上了日程。有研究顯示，地克珠利可以在很低的藥物濃度下，使雞球蟲體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并空泡化[7]，而且對(duì)宿主本身不產(chǎn)生任何影響，除此之外還可抑制球蟲磷酸合成中心PSⅡ的重要組成成分D1蛋白質(zhì)的功能。而D1蛋白質(zhì)與低氧狀態(tài)的電子傳遞有關(guān)系，有可能提供蟲體氧自由基，使其更容易侵入宿主細(xì)胞[8]。但是目前監(jiān)測(cè)一個(gè)地區(qū)抗球蟲藥的耐藥性仍舊依賴傳統(tǒng)的雞體籠養(yǎng)試驗(yàn)，雞體籠養(yǎng)試驗(yàn)?zāi)壳澳軌蜃畲蟪潭鹊姆从吵鲈摰貐^(qū)試驗(yàn)用藥的耐藥現(xiàn)狀。本研究中，發(fā)現(xiàn)河南省和湖北省兩省雞球蟲分離株對(duì)地克珠利耐藥現(xiàn)象十分普遍，僅有1株蟲株為輕度耐藥，共計(jì)5株蟲株中等程度耐藥，其余蟲株全部高度耐藥，這反映出兩省地克珠利的防控雞球蟲壓力較大。該研究結(jié)果對(duì)于該地區(qū)雞球蟲病的防治提出了更高的要求，需要針對(duì)該地雞球蟲的情況制定相應(yīng)的防治方法，穿梭用藥和聯(lián)合用藥是最易實(shí)施的方法，另外適當(dāng)?shù)妮啌Q用藥對(duì)防治也有幫助，但不論是穿梭用藥、聯(lián)合用藥或是輪換用藥都應(yīng)當(dāng)嘗試一些新藥或者本地區(qū)不常用的抗球蟲藥。有一些新型雞球蟲藥的問世比如新型三嗪類藥物[9]往往在一段時(shí)間內(nèi)能實(shí)現(xiàn)對(duì)雞球蟲的有效防控，另外混合傳統(tǒng)中草藥[10]的相關(guān)研究對(duì)于雞球蟲防控方式提出了新的思路，但不論是中藥還是新型藥物長(zhǎng)時(shí)間施用后難免產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。當(dāng)然，除了用藥，傳統(tǒng)的疫苗防控法確為有效，隨著對(duì)雞球蟲的抗原方面的進(jìn)一步研究，頂膜抗原(apical membrane antigen，AMA)-1[11]和免疫定位蛋白(immunolocalization protein，IMP)-1已引入重組疫苗作為對(duì)抗雞球蟲病的替代控制措施。目前正在探索通過穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲作為艾美耳球蟲疫苗抗原的新型遞送載體，該方法使得多種疫苗抗原同時(shí)刺激機(jī)體進(jìn)而提高了保護(hù)功效，以轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲作為載體的方法可以填補(bǔ)作為抗球蟲疫苗，用于雞球蟲病控制的空白[12]。此外，能夠?qū)⒁呙缃臃N法和聯(lián)合穿梭用藥并行的方法對(duì)雞球蟲病進(jìn)行防控也是近些年來的防控新策略，不過該方法對(duì)于養(yǎng)雞場(chǎng)的用藥監(jiān)控和成本條件的要求較高，未來還有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>