CRISPR-Cas技術(shù)在病毒性傳染病診斷中的應(yīng)用

戰(zhàn)佳興，文雪霞，張 瑩

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院/東北畜禽疫病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110161)

病毒性傳染病尤其是新發(fā)和再發(fā)病毒性傳染病一直是人類(lèi)和動(dòng)物健康的重大威脅[1]。2019年末出現(xiàn)的新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019，Covid-19)迅速席卷全球，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康和正常生活，對(duì)全球經(jīng)濟(jì)造成重大沖擊[2]。2018年8月在我國(guó)首次暴發(fā)的非洲豬瘟(African swine fever，ASF)疫情也對(duì)生豬產(chǎn)業(yè)造成不可估量的損失[3]，至今，ASF仍在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，影響生豬生產(chǎn)和全球貿(mào)易。對(duì)病毒性傳染病的及時(shí)診斷有利于控制疫情擴(kuò)散，降低感染風(fēng)險(xiǎn)，保障人類(lèi)和動(dòng)物健康。目前，最常用的核酸檢測(cè)方法是熒光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)[4]。該方法特異性好、靈敏度高，應(yīng)用最為廣泛。然而，該方法需要專(zhuān)業(yè)人員操作和較為昂貴的機(jī)器，且耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，因而限制了其在現(xiàn)場(chǎng)的應(yīng)用。病毒性傳染病理想的診斷方法應(yīng)滿(mǎn)足以下條件：敏感、特異、快速、成本低、操作簡(jiǎn)單、不需或需要最簡(jiǎn)單的儀器。迄今為止，沒(méi)有任何一種方法符合所有要求。因此，需要不斷開(kāi)發(fā)新的、更有效的分子診斷方法。

規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)最早由日本分子生物學(xué)家石野良純于1987年在大腸埃希氏菌中偶然發(fā)現(xiàn)[5]，后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)CRISPR是廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列,為細(xì)菌和古生菌抵御病毒和質(zhì)粒入侵不斷進(jìn)化的產(chǎn)物。CRISPR由眾多短而保守的重復(fù)序列區(qū)(repeats)和間隔區(qū)(spacers)組成。repeats含有回文序列，可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，而spacers比較特殊，是被細(xì)菌俘獲的外源DNA序列。位于序列上游的前導(dǎo)區(qū)(leader)是CRISPR的啟動(dòng)子。另外，在上游還有一個(gè)多態(tài)性的家族基因Cas(CRISPR associated)，其編碼的蛋白為CRISPR系統(tǒng)中的一類(lèi)核酸酶，對(duì)CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮獲得性免疫功能具有重要作用[6]。不同類(lèi)型的Cas蛋白在CRISPR系統(tǒng)適應(yīng)、表達(dá)、干擾等作用階段發(fā)揮不同的作用。Cas蛋白與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用、共同進(jìn)化，在細(xì)菌中形成CRISPR-Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)可作為一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)使細(xì)菌免受病毒侵害。根據(jù)效應(yīng)蛋白的數(shù)量將不同的CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類(lèi)，并進(jìn)一步細(xì)分為6個(gè)主要類(lèi)型(Ⅰ-Ⅵ型)和19個(gè)亞型[7]：第1類(lèi)CRISPR系統(tǒng)利用多個(gè)Cas蛋白和crRNA(CRISPR-derived RNA)形成一個(gè)效應(yīng)復(fù)合物[8]；第2類(lèi)CRISPR系統(tǒng)利用一個(gè)大的單組分Cas效應(yīng)蛋白與crRNA結(jié)合來(lái)發(fā)揮干擾等作用[9]。目前，基于第2類(lèi)的Cas9(Ⅱ型)、Cas12(Ⅴ型)和Cas13(Ⅵ型)的CRISPR-Cas系統(tǒng)應(yīng)用較為廣泛。與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)相比，它們步驟簡(jiǎn)單、操作方便、編輯效率高且耗時(shí)短，有著潛在、巨大的應(yīng)用價(jià)值。論文主要闡釋CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13在現(xiàn)有病毒性傳染病診斷中的應(yīng)用。

1 CRISPR-Cas技術(shù)原理

1.1 CRISPR-Cas9技術(shù)原理

Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)Cas9蛋白通過(guò)crRNA和反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)靶向特定DNA位點(diǎn)[10]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)發(fā)揮功能分為三個(gè)步驟：第一步，CRISPR-Cas9系統(tǒng)通過(guò)PAM(protospacer adjacent motif，序列富含G，為5′-NGG-3′)位點(diǎn)找到原間隔序列，并將間隔序列導(dǎo)入CRISPR 序列。第二步，前導(dǎo)區(qū)轉(zhuǎn)錄出由整個(gè)CRISPR序列轉(zhuǎn)錄而成的pre-crRNA(pre-CRISPR-derived RNA)和由重復(fù)序列區(qū)轉(zhuǎn)錄而成的具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的tracrRNA。pre-crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白組裝，靶向相應(yīng)的間隔序列 RNA，并在核糖核酸酶(RNase)Ⅲ的協(xié)助下對(duì)這段間隔序列進(jìn)行切割，最終形成一段短小的crRNA。crRNA、Cas9、tracrRNA組成的復(fù)合物即為發(fā)揮切割作用的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。第三步，CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)DNA進(jìn)行精準(zhǔn)切割。CRISPR-Cas9從外源DNA序列中識(shí)別出與crRNA互補(bǔ)的原間隔序列，并定位到PAM序列區(qū)域。此時(shí)，DNA雙鏈解開(kāi)形成R-Loop結(jié)構(gòu)，crRNA與互補(bǔ)鏈雜交，而另一條鏈則保持游離狀態(tài)。隨后，Cas9蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域HNH剪切與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，而其另一核酸酶結(jié)構(gòu)域RuvC則剪切非互補(bǔ)鏈，引起DNA雙鏈斷裂(double stranded break，DSB)[11]。

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)不僅可改造病毒DNA，還可編輯所有DNA。理解該系統(tǒng)具體作用機(jī)制后，將crRNA和tracrRNA兩種RNA融合為單一的導(dǎo)向RNA(single guide RNA，sgRNA)對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)化。CRISPR-Cas9系統(tǒng)一端包含需要切割的目標(biāo)序列，另一端與Cas9結(jié)合。通過(guò)sgRNA識(shí)別并結(jié)合靶標(biāo)序列(靶標(biāo)序列周?chē)蠵AM位點(diǎn))，Cas9蛋白即可對(duì)靶標(biāo)序列進(jìn)行切割。因此，理論上來(lái)講，CRISPR-Cas9系統(tǒng)可通過(guò)改變sgRNA序列編輯任何感興趣的靶標(biāo)序列[10]。

1.2 CRISPR-Cas12技術(shù)原理

CRISPR-Cas12包括Cas12a和Cas12b，它們識(shí)別靶序列需要依賴(lài)于富含T的PAM序列(5′-TTN-3′)，在切割目標(biāo)序列后形成黏性末端[12]。CRISPR-Cas12具有雙重切割活性，可切割DNA和RNA。與CRISPR-Cas9不同的是，Cas12只有一個(gè)RuvC樣結(jié)構(gòu)域切割DNA雙鏈。而且，Cas12可單獨(dú)對(duì)pre-crRNA進(jìn)行加工，并利用加工后產(chǎn)生的crRNA特異性地靶向和切割DNA，因而不需宿主細(xì)胞的RNase和tracrRNA，是一種簡(jiǎn)單的CRISPR免疫系統(tǒng)[13]。與Cas9相比，Cas12具有分子質(zhì)量小、對(duì)錯(cuò)配的耐受性較低等優(yōu)點(diǎn)[14]。更為重要的是，Cas12還具有旁切活性，即靶DNA序列激活的非靶標(biāo)DNA切割活性[12]。目前，發(fā)現(xiàn)具有旁切活性的Cas12蛋白酶包括來(lái)自毛螺菌科(Lachnospiraceae)細(xì)菌ND2006的LbCas12a、Acidaminococcussp.的AsCas12a、Franciellanovicida的FnCas12a和Alycyclobacillusacidoterrestri的AaCas12b[12]。

1.3 CRISPR-Cas13技術(shù)原理

CRISPR-Cas13技術(shù)特異性更強(qiáng)，且與前兩者不同的是，該系統(tǒng)可識(shí)別單鏈RNA分子，該過(guò)程只需Cas13蛋白和crRNA分子。在結(jié)構(gòu)上，Cas13蛋白與Cas9及Cas12蛋白也不同，Cas13蛋白不含有HNH或RuvC樣結(jié)構(gòu)域，而是具有兩個(gè)高級(jí)真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding，HEPN)內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，通過(guò)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域精確介導(dǎo)含有PFS(protospacer flanking sites)位點(diǎn)的RNA的切割[15]。在切割靶標(biāo)RNA后，Cas13還可切割任意相鄰的單鏈RNA[16]。目前已被鑒定的Cas13蛋白包括Cas13a(之前稱(chēng)為C2c2)、Cas13b和Cas13c[9]。

2 CRISPR-Cas技術(shù)在病毒性傳染病診斷中的應(yīng)用

2.1 CRISPR-Cas9技術(shù)在病毒性傳染病診斷中的應(yīng)用

CRISPR-Cas9技術(shù)是CRISPR-Cas系統(tǒng)最早受到關(guān)注的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。尤其在控制病毒感染方面已取得許多進(jìn)展，如建立動(dòng)物研究模型、動(dòng)物的抗病育種等。在病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用雖不如其在控制病毒感染方面廣泛，但也有不少成功的嘗試。寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是一種通過(guò)蚊蟲(chóng)進(jìn)行傳播的蟲(chóng)媒病毒，孕婦感染后可能引起新生兒小頭癥[17]。Pardee K等[18]基于toehold switch傳感器采用比色法建立了在紙基無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中檢測(cè)ZIKV的方法，進(jìn)一步將該方法與CRISPR-Cas9技術(shù)結(jié)合，提高了檢測(cè)的特異性，可區(qū)分只有單核苷酸變異的毒株。

研究人員將CRISPR-Cas9核酸內(nèi)切酶特性與等溫指數(shù)核酸擴(kuò)增相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出一種新的檢測(cè)方法，稱(chēng)為CRISPR-Cas9觸發(fā)等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction，CAS-EXPAR)。該方法所需“引物”由CRISPR-Cas9特異性切割目標(biāo)DNA序列產(chǎn)生，通過(guò)產(chǎn)生的引物引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行產(chǎn)生大量DNA。通過(guò)實(shí)時(shí)分析熒光強(qiáng)度，可在1 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)DNA檢測(cè)。CAS-EXPAR為有效的核酸擴(kuò)增提供了新的選擇，并具有分子診斷應(yīng)用的潛力[19]。

東南大學(xué)王進(jìn)科團(tuán)隊(duì)將CRISPR-Cas9核酸內(nèi)切酶特性與核酸擴(kuò)增相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出一種稱(chēng)為ctPCR(CRISPR-typing PCR)的檢測(cè)方法，并陸續(xù)開(kāi)發(fā)出1.0[20]、2.0(又稱(chēng)為Cas9/sgRNAs-associated reverse PCR，CARP)[21]和3.0版本[22]。ctPCR1.0主要包括三個(gè)步驟：(1)利用通用引物擴(kuò)增靶標(biāo)DNA序列，以確定待檢物中是否含有病毒；(2)利用Cas9酶切割(1)中PCR產(chǎn)物；(3)利用特異性引物對(duì)(2)中切割產(chǎn)物進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，以確定病毒的基因型或者亞型。人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)已成為全球?qū)m頸癌的主要元兇，雖然HPV有228種基因型，但目前認(rèn)為只有持續(xù)感染高危型HPV(主要是HPV16和HPV18)才會(huì)導(dǎo)致宮頸惡性腫瘤的發(fā)展。因此，對(duì)HPV16和HPV18檢測(cè)尤為重要。該團(tuán)隊(duì)建立了HPV16和HPV18的ctPCR1.0檢測(cè)方法，并在宮頸癌細(xì)胞和臨床樣本中驗(yàn)證它的有效性[20]。ctPCR2.0更適合在臨床上使用，它首先利用Cas9酶進(jìn)行酶切，其次將酶切產(chǎn)物連接，最后以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[21]。ctPCR3.0只需一步即可檢測(cè)出靶標(biāo)DNA，它利用qPCR擴(kuò)增Cas9/sgRNA切割的DNA樣本。通過(guò)將Cas9和sgRNA直接添加到qPCR反應(yīng)中，并在qPCR反應(yīng)程序之前添加等溫孵育進(jìn)行Cas9酶切，該方法可在2 h內(nèi)檢測(cè)完畢。同樣地，該方法的有效性也已在HPV上驗(yàn)證[22]。

2.2 CRISPR-Cas12技術(shù)在病毒性傳染病診斷中的應(yīng)用

相比于CRISPR-Cas9，CRISPR-Cas12技術(shù)在體外病毒核酸檢測(cè)方面應(yīng)用更為廣泛。2018 年，Doudna等提出了DETECTR(DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter)分子診斷平臺(tái)[23]。該平臺(tái)依賴(lài)于Cas12蛋白酶被靶DNA序列激活后的非特異性DNA切割活性。特異性crRNA識(shí)別靶標(biāo)單鏈DNA序列后Cas12蛋白酶被激活，隨后Cas12蛋白酶可切割DNA分子探針(與TaqMan 探針類(lèi)似，一端連接熒光基團(tuán)，一端連接淬滅基團(tuán))，那么可通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)確定有無(wú)相應(yīng)病原。另外，DETECTR將CRISPR-Cas12和重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)相結(jié)合，在提高檢測(cè)靈敏性的同時(shí)也避免了對(duì)昂貴儀器設(shè)備的需求。DETECTR可用于區(qū)分HPV16和HPV18。針對(duì)L1基因的高變區(qū)設(shè)計(jì)crRNA(HPV16和HPV18只相差6個(gè)核苷酸)，在粗提DNA的情況下，1 h內(nèi)即可完成檢測(cè)[23]。

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病。該病在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，影響生豬養(yǎng)殖及其全球貿(mào)易[3]。通過(guò)靶向ASFV基因組的crRNA激活Cas12a蛋白，進(jìn)而使其切割DNA熒光探針，在2 h內(nèi)即可檢測(cè)出ASFV，且檢測(cè)限可達(dá)到1 pmol/L[24]。將CRISPR-Cas12進(jìn)一步與等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合，可將檢測(cè)限降至100 fmol/L。該方法操作簡(jiǎn)單、方便、不需要昂貴的儀器且成本低，特別適合動(dòng)物病毒核酸的檢測(cè)[24]。

此外，研究人員將DETECTR分子診斷平臺(tái)中的等溫?cái)U(kuò)增步驟替換為PCR開(kāi)發(fā)出HOLMES(one hour low-cost multipurpose highly efficient system)檢測(cè)平臺(tái)。利用該平臺(tái)可檢測(cè)DNA病毒(如偽狂犬病病毒)和RNA病毒(如日本腦炎病毒)，檢測(cè)限可達(dá)10-18mol/L～10-17mol/L[25]。但是，該檢測(cè)平臺(tái)需要PCR儀，且耗時(shí)比較長(zhǎng)。因而，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)與Cas12b識(shí)別靶標(biāo)雙鏈DNA或者單鏈DNA后激活的側(cè)切活性開(kāi)發(fā)出HOLMESv2[26]。該方法利用的Cas12b來(lái)源于Alicyclobacillusacidoterrestris(AacCas12b)，它識(shí)別切割帶有5′-TTN-3′PAM序列的雙鏈后側(cè)切活性被激活[27]。單鏈DNA序列激活Cas12b側(cè)切活性不依賴(lài)于PAM序列，只要濃度合適(最低濃度大約為1 nmol/L)即可激活。Cas12b識(shí)別靶標(biāo)單鏈DNA分子10 min后熒光值可達(dá)到高峰，識(shí)別雙鏈DNA分子后30 min達(dá)到高峰。Cas12b和LAMP結(jié)合檢測(cè)限可與Cas12a相當(dāng)。HOLMESv2檢測(cè)適用于RNA病毒和DNA病毒的檢測(cè)。

以上的檢測(cè)方法大都需要多次移液，有污染樣品的風(fēng)險(xiǎn)。為解決該問(wèn)題，Sun Y等開(kāi)發(fā)了利用Cas12a在單管檢測(cè)Covid-19病原SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)的方法OR-DETECTR[28]。該方法直接將提取的RNA加入試管底部進(jìn)行RPA反應(yīng)，DETECTR混合物被物理隔離在同一試管管蓋內(nèi)。RPA擴(kuò)增后，RPA產(chǎn)物和Cas12a混合物通過(guò)瞬時(shí)離心混合，擴(kuò)增的產(chǎn)物即可被Cas12a識(shí)別產(chǎn)生熒光信號(hào)[28]。無(wú)獨(dú)有偶，另一團(tuán)隊(duì)也開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)便檢測(cè)SARS-CoV-2的方法——STOPCovid(specific high-sensitivity enzymatic reporter un-locking testing in one pot Covid)。該方法利用磁珠提取RNA，去除乙醇洗滌和洗脫的步驟，簡(jiǎn)化RNA提取過(guò)程。此外，該方法中LAMP和Cas12酶切在同一反應(yīng)體系和條件下進(jìn)行，由于LAMP擴(kuò)增需要55 ℃～65 ℃，因此選擇耐熱的AaCas12b酶[29]。STOPCovid 的靈敏性約為33 RNA copies/mL，優(yōu)于CDC推薦的qPCR方法[29]。

由于CRISPR-Cas系統(tǒng)本身不會(huì)誘發(fā)強(qiáng)大的、特異的與樣品中靶序列相關(guān)的信號(hào)，在利用CRISPR-Cas系統(tǒng)檢測(cè)之前通常需要對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增以增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度和特異性。但是，也有研究人員開(kāi)發(fā)出核酸擴(kuò)增的替代方法。Nguyen等證明在crRNA 3′端延伸7個(gè)核苷酸可提高Cas12a檢測(cè)的靈敏度，從而可在Cas12a檢測(cè)之前不必進(jìn)行核酸擴(kuò)增，即CRISPR-ENHANCE(enhanced analysis of nucleic acids with crRNA extensions)[30]。

2.3 CRISPR-Cas13技術(shù)在病毒性傳染病診斷中的應(yīng)用

2017 年，Gootenberg J S等[31]依賴(lài)來(lái)自Leptotrichiawadei的Cas13蛋白核酸內(nèi)切酶活性開(kāi)發(fā)出SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter un-locking)分子診斷平臺(tái)。與Cas12蛋白類(lèi)似，Cas13蛋白識(shí)別和切割特異性RNA分子后激活其側(cè)切活性切割RNA熒光探針。該診斷平臺(tái)利用RPA技術(shù)提升核酸檢測(cè)靈敏度。將目標(biāo)模板經(jīng)過(guò)RPA或逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增(reverse tranion-recombinasepolymerase amplication，RT-RPA)技術(shù)等溫?cái)U(kuò)增，再利用T7體外轉(zhuǎn)錄使DNA模板轉(zhuǎn)錄成可被Cas13a直接結(jié)合的靶標(biāo)RNA。在crRNA的引導(dǎo)下，Cas13a識(shí)別并結(jié)合靶標(biāo)RNA，激活其側(cè)切活性，使其切割反應(yīng)體系中帶有熒光基團(tuán)的報(bào)告RNA分子，從而釋放熒光信號(hào)，指示目標(biāo)核酸的存在[32]。SHERLOCK已驗(yàn)證可用于ZIKV、登革熱病毒(Dengue virus，DENV)的檢測(cè)。SHERLOCK診斷平臺(tái)的所有成分都可凍干且長(zhǎng)期儲(chǔ)存不影響檢測(cè)的敏感性和特異性[31]。隨后，該團(tuán)隊(duì)又利用4種不同來(lái)源的Cas13蛋白同時(shí)檢測(cè)4個(gè)病原，開(kāi)發(fā)出SHERLOCKv2[33]。除了SHERLOCK用到的LwaCas13a(偏好切割富含AU序列)、還有來(lái)自ApnocytophagacanimorsusCc5的CcaCas13b(偏好切割富含UC序列)、L.bacterium[strain NK4A179]的LbaCas13a(偏好切割富含AC序列)和Prevotellasp.MA2016的PsmCas13b(偏好切割富含GA序列)，設(shè)計(jì)富含不同核苷酸且標(biāo)記不同熒光基團(tuán)的探針即可同時(shí)檢測(cè)4種不同病原。SHERLOCKv2系統(tǒng)中還加入了CRISPR輔酶Csm6，使其檢測(cè)靈敏度提高了3.5倍。

為進(jìn)一步提高檢測(cè)方法在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的適用性，Myhrvold C等[22]將HUDSON(heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases)與SHERLOCK結(jié)合，直接對(duì)體液中的病毒進(jìn)行檢測(cè)。該平臺(tái)通過(guò)直接加熱失活核酸酶并裂解病毒即可進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。該平臺(tái)可同時(shí)檢測(cè)同一樣品中ZIKV和DENV，靈敏性可達(dá)1 copy/μL[22]。Arizti-Sanz C等[34]對(duì)HUDSON進(jìn)行了改進(jìn)，可在10 min內(nèi)快速滅活鼻咽拭子和唾液中的SARS-CoV-2，并將RPA擴(kuò)增和Cas13檢測(cè)在同一步驟完成，開(kāi)發(fā)了SHINE(streamlined highlighting of infections to navigate epidemics)檢測(cè)方法，大大提高了其在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)能力。

同CRISPR-Cas12類(lèi)似，研究人員也在嘗試代替核酸擴(kuò)增提高CRISPR-Cas13靈敏性的方法。Fozouni P等[35]報(bào)道了一種不需擴(kuò)增即可用Cas13檢測(cè)SARS-Cov-2的方法。通過(guò)聯(lián)合使用針對(duì)靶標(biāo)序列多個(gè)區(qū)域的crRNA激活Cas13酶活性，可使檢測(cè)的靈敏性和特異性大大提高。2個(gè)～3個(gè)crRNA組合使用可使檢測(cè)限達(dá)到30 copies/μL of SARS-CoV-2 RNA。另一種不需擴(kuò)增的檢測(cè)方法是將Cas13a酶切反應(yīng)置于細(xì)胞大小的反應(yīng)器中，提高局部反應(yīng)混合物的濃度以增加靈敏度[36]。

3 展望

綜上所述，CRISPR/Cas系統(tǒng)在病毒性傳染病診斷領(lǐng)域發(fā)揮至關(guān)重要的作用。其中，CRISPR-Cas9是最早受到關(guān)注的基因編輯技術(shù)，而CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13則展示了其在病毒性疾病診斷中的優(yōu)勢(shì)和潛力。當(dāng)然，從實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)到實(shí)際應(yīng)用還有很多問(wèn)題需要解決，比如CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)錯(cuò)配率的耐受度可能導(dǎo)致脫靶效應(yīng)或者假陽(yáng)性結(jié)果。但不可否認(rèn)，CRISPR-Cas系統(tǒng)是目前最有前景的診斷平臺(tái)之一。而且，CRISPR-Cas系統(tǒng)種類(lèi)多樣，其發(fā)揮作用的關(guān)鍵蛋白組成、結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制也各不相同。深入分析CRISPR-Cas系統(tǒng)的新類(lèi)型將有可能創(chuàng)建出更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速的診斷方法。