宏基因組二代測(cè)序?qū)χ匕Y監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)膿毒癥患者治療及預(yù)后的影響研究

張 綿，曾 東，鄭 華

鄭州市第七人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000

膿毒癥是由于感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是宿主對(duì)感染的免疫失調(diào)反應(yīng)，膿毒癥能夠?qū)е禄颊叨嗥鞴俟δ苷系K，膿毒癥和膿毒癥休克是重大的醫(yī)療問(wèn)題，對(duì)患者生命安全造成嚴(yán)重威脅，死亡率極高［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在患者確認(rèn)膿毒癥之后越早應(yīng)用抗菌藥物患者獲益越大，目前規(guī)定在留取微生物標(biāo)本后，最好1 h 內(nèi)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)性的感染部位啟動(dòng)靜脈抗菌藥物治療，并在微生物學(xué)確認(rèn)之后，基于患者的感染細(xì)菌、藥敏結(jié)果、臨床癥狀體征來(lái)調(diào)整抗菌藥物。利用宏基因二代測(cè)序技術(shù)更優(yōu)于微生物培養(yǎng)，它能更快速的檢測(cè)出微生物，包括細(xì)菌、病毒、真菌，且陽(yáng)性率相對(duì)較高，因此對(duì)于常規(guī)培養(yǎng)難以查出病原體的患者進(jìn)行檢測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)目標(biāo)致病菌，更利于對(duì)患者后續(xù)調(diào)整治療產(chǎn)生影響［2-3］。隨著下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，其中的宏基因組具有病原菌檢出陽(yáng)性率高、范圍廣、檢出速度快、甚至耐藥基因檢查等特點(diǎn)，并且無(wú)需培養(yǎng)，鑒別致病菌（尤其是病毒和真菌），在對(duì)于重癥監(jiān)護(hù)病房中膿毒癥患者進(jìn)行感染源篩查檢查、抗感染治療等方面的指導(dǎo)具有顯著優(yōu)勢(shì)，但是在當(dāng)前關(guān)于該方面的研究相對(duì)較少［4］。本研究對(duì)于2019 年10 月—2020 年4 月鄭州市第七人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的20例膿毒癥患者送檢的宏基因組二代測(cè)序的資料進(jìn)行回顧性分析，探討基于宏基因組二代測(cè)序技術(shù)在膿毒癥患者中的治療優(yōu)勢(shì)和對(duì)預(yù)后影響的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年10 月—2020 年4 月鄭州市第七人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的20例膿毒癥患者作為研究對(duì)象，其中男13 例，女7 例，所有患者的診斷與治療原則符合國(guó)際膿毒癥診療指南的要求和標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

收集所有符合入組標(biāo)準(zhǔn)患者的資料，入重癥監(jiān)護(hù)病房時(shí)的急性生理與慢性健康評(píng)分、感染部位、實(shí)驗(yàn)室檢查如C-反應(yīng)蛋白、中性粒細(xì)胞比例以及血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血總膽紅素、降鈣素原以及凝血酶原時(shí)間，序貫器官衰竭評(píng)分、送檢前臨床生命體征參數(shù)，如心率、體溫、平均動(dòng)脈壓、機(jī)械通氣、血管活性藥物使用、腎臟替代治療等，而預(yù)后評(píng)估指標(biāo)中包含如重癥病房病死率、住院7 d 及28 d 病死率等。在病原學(xué)治療方面，獲取患者宏基因組二代測(cè)序報(bào)告，將宏基因組二代測(cè)序前后的微生物學(xué)報(bào)告送檢，如病毒定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、微生物培養(yǎng)等，評(píng)估宏基因組二代測(cè)序報(bào)告和送檢前后任意一份微生物學(xué)報(bào)告的臨床一致性，宏基因組二代測(cè)序結(jié)果往往會(huì)是多種病原體，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及感染部位等分析判斷可能的致病菌。宏基因組二代測(cè)序報(bào)告和送檢前后任一微生物學(xué)報(bào)告存在重疊致病菌的話，那么則意味著病原體一致。宏基因組二代測(cè)序回報(bào)之后調(diào)整抗感染藥物治療方案，如果臨床癥狀改善則為有效。

1.3 宏基因組二代測(cè)序標(biāo)本和送檢流程

送檢標(biāo)本必須要符合華大基因的相關(guān)要求，如腦脊液、痰液、血液、腹水以及支氣管肺泡灌洗液等。分析樣本中的微生物，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中原來(lái)的微生物核酸序列之間進(jìn)行比較，鑒定微生物。檢測(cè)過(guò)程為：提取核酸、RNA逆轉(zhuǎn)錄、構(gòu)建文庫(kù)、測(cè)序、信息分析與報(bào)告解讀等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征與預(yù)后

送檢宏基因組二代測(cè)序選取的20例重癥監(jiān)護(hù)病房的膿毒癥患者，入重癥病房前的急性生理與慢性健康評(píng)分為（23.00±9.54）分。其中，11例患者可疑多部位感染，其中血流感染是最為常見(jiàn)的感染部位，其次為肺部感染。送檢之前，化驗(yàn)感染指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，血白細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高，降鈣素原低水平升高。在20 例患者中，預(yù)后方面共有9 例出現(xiàn)死亡，住院28 d死亡10例患者，見(jiàn)表1。

表1 膿毒癥患者的臨床特征和預(yù)后情況

2.2 測(cè)序結(jié)果及治療調(diào)整

送檢22 例基于二代測(cè)序的宏基因組樣本，其中，血液標(biāo)本12 例、痰液標(biāo)本3 例、共有4 例支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本、腹水標(biāo)本1 例、腦脊液標(biāo)本2 例。22 例標(biāo)本中，檢出陽(yáng)性為21 例，陽(yáng)性率95.45%。其中，共有11 例檢出病毒，3 例檢出革蘭氏陽(yáng)性菌，1 例結(jié)核分枝桿菌，6例檢出巨細(xì)胞病毒，9 例檢出革蘭氏陰性菌，6 例檢出真菌。共有8 例傳統(tǒng)微生物學(xué)培養(yǎng)報(bào)告呈現(xiàn)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為36.4%，明顯低于二代測(cè)序結(jié)果。二代測(cè)序結(jié)果與臨床診斷比較，2 例不符，但是比較臨床與傳統(tǒng)微生物學(xué)報(bào)告的話，共有7 例符合，要比宏基因組二代測(cè)序低?；诙鷾y(cè)序技術(shù)的宏基因組結(jié)果，來(lái)對(duì)于14 例患者調(diào)整抗菌藥物治療，其中患者臨床癥狀得到改善的共有8例。見(jiàn)表2。

表2 傳統(tǒng)微生物學(xué)報(bào)告和二代測(cè)序情況 （例）

3 討論

膿毒癥是臨床上急危重癥患者出現(xiàn)死亡后果的一項(xiàng)關(guān)鍵因素?；颊咴诨疾≈?，將會(huì)引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)以及廣泛性的組織損傷，機(jī)體對(duì)感染的免疫反應(yīng)失調(diào)，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝腎功能衰竭、呼吸功能衰竭及凝血系統(tǒng)問(wèn)題等嚴(yán)重的多器官功能障礙，甚至導(dǎo)致患者出現(xiàn)死亡。所以，盡早明確患者的感染部位、感染病原體及疾病的嚴(yán)重程度，并基于此實(shí)施針對(duì)性的治療措施，是治療膿毒癥成敗的關(guān)鍵所在。當(dāng)前，對(duì)于膿毒癥患者的嚴(yán)重程度進(jìn)行判斷和預(yù)后預(yù)測(cè)時(shí)，其主要方式還是采取急性生理與慢性健康評(píng)分為主［5-6］。

傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)主要是通過(guò)免疫、生化以及培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)方式檢測(cè)樣本中的微生物種類與定量信息，臨床上常用的檢測(cè)方法有PCR擴(kuò)增法、微生物培養(yǎng)法以及涂片鏡檢法，而微生物檢出率常常會(huì)被抗生素治療所影響，并且所需要的時(shí)間較長(zhǎng)。提高檢測(cè)精準(zhǔn)度和效率才是病原微生物檢測(cè)的目標(biāo)［7］。基于宏基因組二代測(cè)序技術(shù)中的微生物檢測(cè)方式，對(duì)于宏基因組樣本進(jìn)行完全測(cè)序，從而得到宏基因組的核酸序列，并通過(guò)生物信息學(xué)工具核酸序列數(shù)據(jù)，并獲取微生物基因信息，該方式具有無(wú)需培養(yǎng)樣本，可以檢測(cè)未知微生物甚至包括病毒、真菌等，靈敏度非常高等眾多優(yōu)勢(shì)，完善了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)上的不足，為臨床診斷及治療提供了更可靠的決策依據(jù)［8］。

臨床常用的一種檢測(cè)方式中，基于已知病原體的特點(diǎn)非常常見(jiàn)。但以二代測(cè)序進(jìn)行宏基因組檢測(cè)，可以更快得到未知病原體，從而對(duì)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序、分析，能夠使臨床醫(yī)師及早根據(jù)患者的實(shí)際癥狀、臨床表現(xiàn)，快速確定病原體，從而更及時(shí)做出治療的預(yù)判。截止目前，臨床上已有超過(guò)38 000 個(gè)細(xì)菌基因組和超過(guò)5 000 個(gè)病原基因組的序列已經(jīng)被測(cè)定，基于二代測(cè)序技術(shù)的宏基因組技術(shù)能夠規(guī)避細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果相似而發(fā)生的區(qū)分困難。所以，在臨床醫(yī)療中二代測(cè)序具有著非常重要的作用。因此，宏基因組二代測(cè)序技術(shù)由于其自身的眾多特點(diǎn)已經(jīng)成為了診斷疑難危重癥感染疾病的關(guān)鍵核心所在。在重癥監(jiān)護(hù)病房的膿毒癥患者中應(yīng)用二代測(cè)序，協(xié)助醫(yī)生盡快診斷病原學(xué)甚至微生物的耐藥基因，醫(yī)師可以更及時(shí)、準(zhǔn)確的基于此實(shí)施針對(duì)性的治療，更利于患者盡早康復(fù)［9］。

提高傳統(tǒng)病原微生物培養(yǎng)方式，診斷病原學(xué)發(fā)現(xiàn)，臨床最為常見(jiàn)的致病菌為革蘭氏陰性菌，其次為革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌、厭氧菌以及寄生蟲等。但隨著二代測(cè)序、PCR等不依賴培養(yǎng)的技術(shù)和方法的出現(xiàn)，膿毒癥病原學(xué)構(gòu)成也發(fā)生了一定變化，本研究結(jié)果顯示，二代測(cè)序技術(shù)的診斷具有較高的陽(yáng)性率，在送檢前后，病原學(xué)培養(yǎng)、病毒定量PCR中，陰性患者12例，僅一次未檢出病原體。而本次研究的病毒檢出率為55%。其實(shí)重癥監(jiān)護(hù)病房中，病毒感染十分常見(jiàn)，除了最開(kāi)始是病毒導(dǎo)致的膿毒癥以外，還包括潛伏病毒再激活，并且潛伏病毒再激活的比例和免疫抑制患者之間存在高度相仿。經(jīng)過(guò)專家學(xué)者調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)，正常免疫功能的患者感染CMV 率達(dá)到了27%，再激活率為3l%，如果患者一旦出現(xiàn)CMV 感染、CMV再激活等情況，卻并沒(méi)有對(duì)患者實(shí)施相應(yīng)的治療，將會(huì)直接導(dǎo)致患者死亡［10］。

經(jīng)過(guò)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥指數(shù)是由測(cè)序序列數(shù)計(jì)算得出，在膿毒癥患者中，其致病菌的膿毒癥指數(shù)豐度、絕對(duì)值均出現(xiàn)顯著性增高并且變化情況和臨床表現(xiàn)之間存在直接關(guān)系，對(duì)患者實(shí)施治療，患者的膿毒癥指數(shù)將會(huì)迅速下降。本研究中，膿毒癥患者基于宏基因組二代測(cè)序技術(shù)的結(jié)果來(lái)調(diào)整治療，其中，首先需要明確致病菌，并基于此目標(biāo)加強(qiáng)治療。其次，排除可疑致病菌，同時(shí)停用相應(yīng)的抗感染藥物，減少多種抗菌藥物的毒副作用及減少重癥患者二重感染的風(fēng)險(xiǎn)，減少營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)生［11］。本次研究中，膿毒癥患者在經(jīng)過(guò)治療調(diào)整之后，其臨床癥狀得以改善，并且調(diào)整有效率相對(duì)較高。但是，本次研究?jī)H是通過(guò)臨床癥狀改善結(jié)果對(duì)調(diào)整效果進(jìn)行判斷。如果可以對(duì)宏基因組二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)的話，可以有更高的依據(jù)。本次研究中，所送檢的標(biāo)本中具有非常多的類型，如痰液、血液、腹水、肺泡灌洗液、腦脊液標(biāo)本等，其中痰液標(biāo)本、腹水標(biāo)本中的檢出菌種相對(duì)較多，在區(qū)分致病菌和定植菌方面存在一定難度。所以，血液標(biāo)本、腦脊液標(biāo)本以及肺泡灌洗液標(biāo)本可能是重癥病房中膿毒癥患者檢測(cè)的最好選擇。但研究發(fā)現(xiàn)，血液標(biāo)本中也會(huì)存在非致病微生物序列，尤其是當(dāng)前根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果來(lái)判斷致病菌和污染菌等，還尚未有清晰明確的研究。所以，在測(cè)序結(jié)果為依據(jù)方面，還需要結(jié)合臨床實(shí)際情況甚至反復(fù)多次檢測(cè)來(lái)核實(shí)［12］。

在重癥監(jiān)護(hù)病房的膿毒癥患者中采用宏基因的二代測(cè)序技術(shù)，依舊還存在一定不足，例如宏基因組二代測(cè)序目前的費(fèi)用相對(duì)較高，并且不在醫(yī)保報(bào)銷范圍，增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而相關(guān)研究中，真菌、細(xì)菌測(cè)序的覆蓋率相對(duì)較低，藥敏處于未知狀態(tài)，僅能滿足種屬鑒定需求，但是能夠利用耐藥基因型的檢測(cè)適當(dāng)?shù)膹浹a(bǔ)，關(guān)于藥敏方面還要根據(jù)主管醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)來(lái)定。

綜上所述，在重癥監(jiān)護(hù)病房的膿毒癥患者中，應(yīng)用宏基因組二代測(cè)序技術(shù)能夠顯著提升病原體檢出陽(yáng)性率，檢出時(shí)間方面較常規(guī)培養(yǎng)方法也更提前，可以更加詳細(xì)、及時(shí)的指導(dǎo)臨床醫(yī)師治療方案，從而改善重癥膿毒癥患者的預(yù)后，建議在臨床推廣應(yīng)用。