基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討托法替布聯(lián)合甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

趙妍，趙晶晶，劉愛芬，郭雪梅，康莉，陳兵

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津 300211；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科，天津 300211；3.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院麻醉科，天津 300211；4.天津醫(yī)科大學(xué)圖書館，天津 300070；5.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300211）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫疾病。它的病理生理機(jī)制主要為關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)的炎癥因子刺激免疫細(xì)胞釋放大量炎性和細(xì)胞因子，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和關(guān)節(jié)外血管炎等損害[1]。RA 病程長，病死率高，嚴(yán)重影響患者身心健康和生活質(zhì)量[2-3]。目前，甲氨蝶呤已成為治療RA 的基礎(chǔ)用藥，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與葉酸相似。其通過抑制二氫葉酸還原酶和?；D(zhuǎn)移酶的活性，抑制嘌呤和嘧啶核苷酸的合成，抑制淋巴細(xì)胞活化，減輕炎癥和關(guān)節(jié)疼痛。但長時(shí)間大劑量的應(yīng)用會(huì)增加藥物不良反應(yīng)，限制了其臨床的廣泛應(yīng)用[4]。

托法替布是一種小分子Janus 激酶（JAK）抑制劑，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其通過抑制JAK-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號(hào)通路，降低STAT 的磷酸化水平，從而降低下游炎性細(xì)胞因子的合成，達(dá)到調(diào)控炎癥的目的[5-7]，從而引起了人們的廣泛關(guān)注。研究報(bào)道，托法替布不但可以明顯緩解RA 患者的癥狀，而且聯(lián)用甲氨蝶呤可達(dá)到更優(yōu)的治療效果[8-9]。

目前，托法替布聯(lián)用甲氨蝶呤治療RA 的分子機(jī)制尚未完全闡明。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，針對托法替布和甲氨蝶呤的預(yù)測藥效團(tuán)、靶蛋白/基因和分子藥理機(jī)制進(jìn)行深入探討，從而確定兩者的適應(yīng)證和不良反應(yīng)，更好的指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

1 材料和方法

1.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫和平臺(tái) 化學(xué)模組pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、藥效團(tuán)匹配與潛在識(shí)別靶標(biāo)PharmMapper 在線平臺(tái)（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、STRING 平臺(tái)（https://string-db.org）及網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape（v 3.7.2）。

1.2 化合物結(jié)構(gòu)的篩選和藥效團(tuán)模型靶點(diǎn)的預(yù)測 以“Tofacitinib”和“Methotrexate”為關(guān)鍵詞，通過pubchem 數(shù)據(jù)庫獲取化合物的活性成分，并下載它們的2D 和3D 結(jié)構(gòu)。PharmMapper 平臺(tái)上導(dǎo)入化合物的3D 結(jié)構(gòu)文件，得到預(yù)測藥效團(tuán)模型的元素（蛋白結(jié)構(gòu)、特征數(shù)目、分值、校正分值、靶點(diǎn)基因等）和可能靶蛋白/基因。

1.3 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和可視化分析 利用STRING 平臺(tái)獲得靶蛋白/基因之間的關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。將托法替布和甲氨蝶呤的靶蛋白/基因?qū)刖W(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape（v 3.7.2），其中“節(jié)點(diǎn)（node）”代表靶蛋白/基因，“線（edge）”代表靶點(diǎn)之間的關(guān)系，對其網(wǎng)絡(luò)特征進(jìn)行可視化分析。

1.4 富集通路分析 通過統(tǒng)計(jì)R 軟件（R x64 3.5.2）對上述靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析和信號(hào)通路分析。同一種顏色的節(jié)點(diǎn)代表同一類型的信號(hào)通路，節(jié)點(diǎn)的大小代表信號(hào)通路的顯著程度。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 托法替布和甲氨蝶呤的化合物結(jié)構(gòu)篩選和藥效團(tuán)模型靶點(diǎn)預(yù)測 通過pubchem 平臺(tái)分析得到托法替布和甲氨蝶呤化合物的活性成分和其2D 和3D 結(jié)構(gòu)（圖1）。利用PharmMapper 數(shù)據(jù)庫得到托法替布預(yù)測藥效團(tuán)模型的特征元素：如表1A 所示，托法替布預(yù)測藥效團(tuán)模型的主要蛋白結(jié)構(gòu)分別為2ecd_A_cavity_2、2qq5_A_cavity_2、2cfv_A_cavity_2等，其支持靶點(diǎn)蛋白的特征數(shù)目均大于3，校正分值均大于0.8，靶點(diǎn)基因分別為ABL2、DHRS1、PTPRJ等；如表1B 所示，甲氨蝶呤藥效團(tuán)模型的主要蛋白結(jié) 構(gòu) 分 別 為 3cki_B_cavity_3、1hi5_A_cavity_1、1n46_B_cavity_1 等，其支持靶點(diǎn)蛋白的特征數(shù)目均大于4，校正分值均大于0.6，靶點(diǎn)基因分別為ADAM17、RNASE2、THRB 等。最終鑒定出托法替布71 個(gè)和甲氨蝶呤66 個(gè)潛在的靶蛋白/基因，且兩種藥物的所有蛋白/基因均用于進(jìn)一步研究。

表1 托法替布和甲氨蝶呤的預(yù)測藥效團(tuán)模型的主要特征因素Tab1 The main characteristic factors of predictivepharmacophore models of tofacitinib and methotrexate

圖1 托法替布和甲氨蝶呤活性化合物的結(jié)構(gòu)Fig 1 The structures of active compounds of tofacitinib and methotrexate

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和可視化網(wǎng)絡(luò)分析 將托法替布和甲氨蝶呤的所有預(yù)測靶蛋白/基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建共同靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系圖。如圖2A 所示，在過濾值為0.96 條件下，得到托法替布和甲氨蝶呤共有206 對預(yù)測靶蛋白/基因。兩者的主要預(yù)測靶蛋白/基因?yàn)镴AK2、JAK3、STAT1、蛋白激酶B（AKT）1、白細(xì)胞介素（IL）-2、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）1、MAPK8、表皮生長因子受體（EGFR）等，靶蛋白/基因之間多通過融合（紅色連線）、鄰接（綠色連線）、同現(xiàn)（藍(lán)色連線）等進(jìn)行相互作用。進(jìn)而采用Cytoscape（v 3.7.2）軟件，將兩種藥物之間的相互調(diào)控關(guān)系進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。如圖2B 所示，此網(wǎng)絡(luò)共有105 個(gè)預(yù)測靶蛋白/基因和349 條連線，其交互關(guān)系與圖2A 一致。

圖2 托法替布和甲氨蝶呤的預(yù)測靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)可視化Fig 2 PPI network and network visualization for the predictive targets of tofacitinib and methotrexate

2.3 GO 功能富集分析 為進(jìn)一步研究托法替布和甲氨蝶呤的可能作用機(jī)制，采用R x64 3.5.2 軟件進(jìn)行了GO 功能富集分析，并將結(jié)果繪制成氣泡圖。如圖3A 所示，托法替布和甲氨蝶呤的預(yù)測靶蛋白/基因在影響受損DNA 結(jié)合、ATP 酶結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體活性、生長因子受體結(jié)合和內(nèi)肽酶活性等功能處顯著富集（均P＜0.05）。且據(jù)圖3B 所示，托法替布和甲氨蝶呤的預(yù)測靶蛋白/基因在影響ATP 酶結(jié)合（P=0.002）、受損DNA 結(jié)合（P=0.002）、核受體活性（P=0.002）、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)控序列特異性DNA 結(jié)合（P=0.002）功能上富集最顯著，而在影響類固醇激素受體活性（P=0.004）、生長因子受體結(jié)合（P=0.022）、內(nèi)肽酶活性（P=0.029）方面次之。提示托法替布和甲氨蝶呤可能通過調(diào)控以上多種生物功能治療RA。

圖3 托法替布和甲氨蝶呤的預(yù)測靶點(diǎn)的GO 功能富集分析Fig 3 GO enrichment analysis of the predictive targets of tofacitinib and methotrexate

2.4 KEGG 通路富集分析 對托法替布和甲氨蝶呤的可能循壞通路進(jìn)行KEGG 分析，如圖4A~C 所示，HER2/neu、E2F、Rac、JNK、Ral、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）s、HBEGF、ERBB2、HER2、Notch、雌激素受體（ER）等可能是托法替布和甲氨蝶呤的預(yù)測靶蛋白/基因，JAK-STAT 信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β 信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT 信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路、核因子（NF）-κB 信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路和癌癥通路等信號(hào)通路主要參與了托法替布和甲氨蝶呤共同作用的通路循壞。

圖4 托法替布和甲氨蝶呤治療多種疾病的KEGG 通路循環(huán)圖Fig 4 KEGG pathway circulation diagram of tofacitinib and methotrexate in the treatment of various diseases

3 討論

RA 是一種由大量的炎癥細(xì)胞浸潤、形成血管翳和滑膜炎、并侵犯鄰近關(guān)節(jié)軟骨導(dǎo)致骨破壞的自身免疫性疾病[10-11]。甲氨蝶呤一直是臨床治療RA 的常規(guī)用藥，但對重癥和甲氨蝶呤耐藥的RA 患者療效欠佳。近來臨床研究發(fā)現(xiàn)，新研制的藥物托法替布優(yōu)于甲氨蝶呤或安慰劑，且托法替布聯(lián)合甲氨蝶呤對RA 患者表現(xiàn)出更好的治療效果[8，12]。托法替布作為一種處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)的新藥，通過采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對其進(jìn)行系統(tǒng)和詳盡的研究，探討其靶基因及相互作用，有助于更好地確定藥物適應(yīng)證和不良反應(yīng)。本研究打破單一藥理學(xué)研究的局限性，全面地研究并闡述了托法替布聯(lián)用甲氨蝶呤的作用機(jī)制。

本研究通過pubchem 和PharmMapper 數(shù)據(jù)庫分別獲取了托法替布和甲氨蝶呤相關(guān)化合物的有效成分，并最終鑒定出137 個(gè)潛在靶蛋白/基因。其中 包 括 JAK2、JAK3、STAT1、AKT1、IL2、MAPK1、MAPK8、EGFR 等。最后通過GO 功能富集和KEGG 通路分析證實(shí)托法替布聯(lián)合甲氨蝶呤治療RA 的機(jī)制主要與JAK-STAT、TGF-β、PI3K-AKT、p53、Ras、MAPK、VEGF、NF-κB 及Notch 等信號(hào)通路密切相關(guān)。托法替布作為JAK 特異性抑制劑[13]，是由4 個(gè)非受體酪氨酸激酶（JAK1、JAK2、JAK3 和酪氨酸激酶2）組成，對應(yīng)不同的細(xì)胞因子受體。非受體酪氨酸激酶與細(xì)胞因子受體結(jié)合后可抑制受體相關(guān)的JAK，阻礙下游的STATs 被JAK 磷酸化，導(dǎo)致受體無法解離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，從而影響JAK-STAT 信號(hào)通路[14]。托法替布不僅減少了致RA 發(fā)病的關(guān)鍵基因（基質(zhì)金屬蛋白酶1 等）的表達(dá)，而且減少滑膜STAT1 和STAT3 的磷酸化水平，對RA 具有較好的治療效果[15]。而且STAT 靶基因與NF-κB 信號(hào)通路靶基因高度相關(guān)，后者則是另一個(gè)促炎的關(guān)鍵信號(hào)通路。腫瘤癌變過程中，特別是微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的相互作用時(shí)，STAT 信號(hào)往往是上調(diào)的，其上調(diào)涉及的生物過程包括分化、增殖、血管生成和細(xì)胞凋亡等。托法替布則通過干擾DNA 轉(zhuǎn)錄，從而對自身免疫性疾病RA 和腫瘤的相關(guān)炎性細(xì)胞的活性起到負(fù)性調(diào)控作用[16-17]。本研究結(jié)果亦證實(shí)，JAK2、JAK3、STAT1等是托法替布和甲氨蝶呤共同作用的靶蛋白/基因，其參與的JAK-STAT 信號(hào)通路與治療RA 的過程密切相關(guān)。此外，托法替布可以通過抑制JAK-STAT 信號(hào)通路，影響DNA 的表達(dá)，從而治療RA[18-19]，與本研究結(jié)果一致。目前JAK-STAT 是RA 致病的最重要的信號(hào)通路，是本研究網(wǎng)絡(luò)中最重要的節(jié)點(diǎn)，其上下游因子亦是未來需要重點(diǎn)研究的目標(biāo)。

炎癥因子是RA 發(fā)病和進(jìn)展的關(guān)鍵功能分子[20]。既往研究發(fā)現(xiàn)，IL-2 是參與RA 發(fā)生、發(fā)展的重要炎癥因子，主要與MAPK 蛋白家族具有一定的關(guān)聯(lián)性。IL-2 與活化T 細(xì)胞上的IL-2R 特異性結(jié)合后，進(jìn)而激活具有GTP 酶活性的小蛋白R(shí)as，Ras 進(jìn)一步激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的Raf 蛋白，最終啟動(dòng)p42/p44MAPK，其通過以上過程促進(jìn)T 細(xì)胞增殖，并引發(fā)炎癥因子大量釋放，造成免疫功能紊亂[21-22]。本研究亦證實(shí)IL-2、MAPK 是托法替布和甲氨蝶呤的主要靶蛋白/基因，且MAPK 信號(hào)通路在其間發(fā)揮著重要的作用。此外，胡志平等[23]研究證實(shí)通過抑制PI3K-AKT 通路可以減輕RA 大鼠的炎癥。Harris 等[24]和Smith 等[25]發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT 信號(hào)通路廣泛存在于RA 的滑膜細(xì)胞中，且處于異常激活狀態(tài)，是造成滑膜細(xì)胞失衡凋亡的原因之一。當(dāng)應(yīng)用PI3K 抑制劑ZSTK474 后，能明顯改善膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，證實(shí)其具有較好的抗RA 作用[26]。洪宏海等[27]還發(fā)現(xiàn)p53 具有抗RA 的免疫炎癥作用。這些通路多與炎性免疫反應(yīng)過程有關(guān)，本研究中亦體現(xiàn)了以上通路。

VEGF 是RA 病理性血管生成的重要參與者，促使血管翳形成，引起骨破壞[28]。雌激素可調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP3），促使成骨細(xì)胞膜表面的凋亡基因FasL 斷裂成為可溶性FasL，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，減少骨破壞[29]。與本研究結(jié)果相符。本研究亦發(fā)現(xiàn)AKT1 與自噬性死亡相關(guān)[5]，EGFR 抑制劑能夠誘導(dǎo)自噬[30]，重組人顆粒體蛋白前體通過MAPK 通路調(diào)控自噬[31]，STAT3 影響自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[32]，由此提示托法替布聯(lián)合甲氨蝶呤可能通過抑制血管形成和細(xì)胞自噬而起到治療RA 的作用。

綜上所述，托法替布聯(lián)合甲氨蝶呤在臨床試驗(yàn)中取得了較好的療效，但是缺乏系統(tǒng)科學(xué)的分子機(jī)制研究。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對兩者的活性成分、靶蛋白/基因和作用通路進(jìn)行了深入探討，證實(shí)托法替布聯(lián)合甲氨蝶呤具有多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)，并未臨床應(yīng)用實(shí)踐提供數(shù)據(jù)參考。由于現(xiàn)有數(shù)據(jù)的局限性，后期需要更多、更深入的研究為臨床應(yīng)用提供科學(xué)根據(jù)。