不同原料對醬香大曲微生物群落結構及多樣性的影響

趙 馳，蘇 偉,*，母應春，鄭 璞，王涵鈺

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

中國白酒被列為世界六大著名蒸餾酒之一。其中，茅臺酒是中國著名的傳統(tǒng)白酒，它以高度復雜、甘甜和清爽的風味而聞名，其特點主要來源于醬香大曲。醬香大曲以純小麥為主要原料，經(jīng)破碎、配料、成型、發(fā)酵、拆曲、貯存等步驟固態(tài)發(fā)酵而成。醬香大曲作為茅臺酒的糖化、發(fā)酵與生香劑，由多種微生物、功能酶和風味化合物組成。研究發(fā)現(xiàn)原料是影響發(fā)酵進程和產物品質的重要因素，不同原料營養(yǎng)成分的差異與發(fā)酵產物的品質和功能密切相關。然而，到目前為止，醬香大曲仍是基于純小麥在開放環(huán)境下自然發(fā)酵生產的，導致原料探索存在數(shù)據(jù)集缺陷。

純小麥與青稞和紫小麥成分類似，但青稞（-葡聚糖、酚類化合物和蛋白質）和紫小麥（花色苷和微量元素）部分功能營養(yǎng)成分明顯高于純小麥。因此，通過原料的營養(yǎng)成分差異探究大曲微生物菌群結構和豐度對白酒風格和品質的多元參數(shù)具有重要意義。曾橋等利用不同原料在同一加工條件下發(fā)現(xiàn)茯磚茶活性成分和微生物多樣性呈顯著差異。江偉等發(fā)現(xiàn)以高粱、小麥、大米、糯米和玉米釀造的白酒風味各具特色，但以高粱為釀造白酒原料更具優(yōu)勢。隨著檢測技術的發(fā)展，對發(fā)酵產品微生物的研究越來越多?；诟咄繙y序技術揭示了貴州和四川主要釀酒企業(yè)采集的14 份醬香大曲樣品微生物、傳統(tǒng)與自動化制醬香大曲的微生物群落結構、茅臺鎮(zhèn)不同主釀區(qū)大曲細菌菌群結構和貴州傳統(tǒng)小曲微生物群落分布及代謝潛力。但對醬香大曲的研究主要集中在純小麥發(fā)酵制備酒曲的微生物，不同原料營養(yǎng)成分差異對發(fā)酵調控微生物菌群結構及多樣性卻鮮見報道。

因此，本研究采用高通量測序技術，對同一加工條件下不同原料加工而成的醬香大曲樣品進行微生物群落結構和多樣性分析。并利用主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）和線性判別差異貢獻分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）對組間分離情況和菌群關鍵生物標記進行探究，旨在為醬香大曲的品質研究提供新參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香大曲：分別以青稞、紫小麥和純小麥為原料，按照傳統(tǒng)醬香大曲加工工藝（潤料、粉碎、拌曲、成型、發(fā)酵、拆曲、貯存）制成青稞曲（QKQ）、紫麥曲（ZMQ）和小麥曲（XMQ）（圖1）。樣本基于Zhang Chunlin等方法采集于2020年6月。收集后，這些樣本被迅速運送至實驗室，然后放入無菌袋儲存在－80 ℃待進一步分析。

圖1 醬香大曲制備流程Fig.1 Preparation process of Jiang-flavor Daqu

DNA提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司；瓊脂糖 西班Biowest公司；FastPolymerase 中國sGen公司；正反引物 深圳市英俊生物技術有限公司；DNA純化磁珠 南京諾唯贊生物科技有限公司；MinElute PCR純化試劑盒 德國Qiagen公司。

1.2 儀器與設備

GeneAmp 9700 PCR儀 美國ABI公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計、ST16R臺式高速冷凍離心機美國Thermo Fisher Scientific公司；Illumina HiSeq 2500測序儀 美國Illumina公司；FA1004N電子分析天平上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取和PCR擴增

使用E.Z.N.A.土壤DNA 試劑盒（OMEGA）直接從樣本中提取總基因組DNA。然后使用正反引物（338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）結合適配器和條形碼序列對1 6 Sr RNA 基因的V3-V4高變區(qū)進行PCR擴增；真菌使用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）在ITS1區(qū)進行PCR擴增。PCR使用下列程序進行：95 ℃預變性3 min，27 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存。

1.3.2 高通量測序和數(shù)據(jù)處理

擴增后的PCR產物純化參考文獻[19]。純化后的產物通過NanoDrop 2000分光光度計進行定量，隨即按照每個樣本的測序要求，進行相應比例的混合，并使用Low Sample Protocol進行建庫，最后在Illumina HiSeq 2500平臺上進行高通量測序。首先，使用FLASH v1.2.7軟件，通過Overlap對每個樣品的reads進行拼接；然后使用Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的raw tags進行過濾，得到高質量的tags數(shù)據(jù)；最后通過UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。此外，使用Usearch軟件對tags在97%的相似度水平下進行聚類獲得可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），并基于Silva（細菌）和 UNITE（真菌）分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 25.0軟件進行?；讷@得的OTU表格，利用QIIME計算樣品的多樣性，包括豐富度指數(shù)（ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)）和多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）。隨后使用R軟件可視化樣品間Venn圖、稀釋曲線圖和優(yōu)勢屬的堆疊柱狀圖。使用SIMCA 14.1軟件對微生物屬數(shù)據(jù)集進行PCA和OPLSDA，在OPLS-DA模型上，確定細菌和真菌的PCA得分圖。此外，通過R軟件進行了樣品間的HCA。最后，利用Python 2.0軟件進行LEfSe。每個樣品進行5 次實驗。

2 結果與分析

2.1 α多樣性分析

XMQ、ZMQ和QKQ樣本質量控制后，在16S rRNA序列中分別得到（59 763±8 414）、（68 309±4 326）條和（57 368±12 272）條有效序列，ITS序列中分別得到（77 787±419）、（77 963±553）條和（77 364±12 220）條有效序列?；诩毦驼婢鶲TU 數(shù)的覆蓋率（表1）和稀釋曲線（圖2A）趨于平緩，表明本研究的測序深度足以代表樣品的微生物結構，說明測序數(shù)據(jù)足夠后續(xù)分析。此外，描述了不同樣品中微生物群落的豐富度和多樣性（表1）。通過計算樣品的豐富度指數(shù)發(fā)現(xiàn)，QKQ的真菌和細菌ACE指數(shù)（79.6±15.3和139.9±7.9）和Chao1指數(shù)（76.9±18.2和142.7±9.7）最高，說明樣品中微生物群落的豐富度最高；相反地，ZMQ樣品中微生物群落的豐富度最低，其真菌和細菌的豐富度指數(shù)分別為ACE指數(shù)（39.0±19.3和103.1±16.5）和Chao1指數(shù)（37.0±18.3和100.9±16.0）。同時，通過多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)XMQ中真菌和細菌的Simpson指數(shù)（0.3±0.1和0.2±0.1）和Shannon指數(shù)（1.6±0.3和2.2±0.3）分別為最高和最低，這表明樣品中微生物群落的多樣性最低。而真菌多樣性以QKQ最高，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為0.2±0.1和1.8±0.3。

表1 大曲樣品中微生物菌群的α多樣性Table 1 α Diversity of microflora in Daqu samples

圖2 真菌和細菌的稀釋曲線（A）和Venn圖（B）Fig.2 Rarefaction curves (A) and Venn diagrams (B) of fungi and bacteria

根據(jù)Venn圖（圖2B），3 份大曲樣品中細菌OTU總數(shù)和唯一數(shù)均為最高，但真菌OTU的唯一數(shù)在3 份大曲樣品中無明顯差異。此外，QKQ和XMQ樣品中細菌和真菌的OTU獨自共有數(shù)最多，分別為20和15。

2.2 微生物群落結構分析

根據(jù)OTU分析結果，對樣品數(shù)據(jù)在門和屬水平上進行分類學分析。如圖3所示，在門水平上，所有樣品共檢測到8 個門（相對豐度＞0.1%），包括3 個真菌門（子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和毛霉門（Mucoromycota））和5 個細菌門（厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和藍藻菌門（Cyanobacteria））。3 個大曲樣品中均以子囊菌門、厚壁菌門和放線菌門為絕對優(yōu)勢門（相對豐度＞1%）。與之前研究結論一致，Gan Shuheng等在茅臺酒釀造使用的大曲中確定了子囊菌門為優(yōu)勢真菌群。同時，有研究表明茅臺鎮(zhèn)不同主釀區(qū)域醬香型白酒釀造大曲中優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門和放線菌門。此外，擬桿菌門主要存在于ZMQ中。根據(jù)相關研究報道，擬桿菌門不僅是醬香大曲中優(yōu)勢門，同樣也是芝麻香型大曲和濃香型大曲等白酒糖化發(fā)酵劑中的主要細菌門。

圖3 大曲樣品在門水平上細菌（A）和真菌（B）的相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) at the phylum level in Daqu samples

在屬水平上，圖4A、B分別顯示了9 個大曲樣品細菌屬和真菌屬的總體概況（相對豐度＞1%），分別占總豐度的93.57%和96.25%。觀察到優(yōu)勢細菌屬為克羅彭斯特菌屬（）、uncultured_bacterium_f_Bacillaceae、高溫放線菌屬（）、魏斯氏菌屬（）、枝芽孢菌屬（）、乳桿菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、鏈霉菌屬（）、葡萄球菌屬（）、火山渣芽孢桿菌屬（）、棒狀桿菌屬（_1）、uncultured_bacterium_f_Pseudonocardiaceae、短桿菌屬（）和鞘氨醇桿菌屬（），屬厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門。更具體地說，克羅彭斯特菌屬和枝芽孢菌屬在XMQ（33.40%和26.20%）、ZMQ（12.36%和5.28%）中表現(xiàn)出優(yōu)勢相對豐度，與Zou Qiancheng等對傳統(tǒng)與機械化制醬香大曲發(fā)酵過程中細菌多樣性和任愛榮等對茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造大曲及環(huán)境中可培養(yǎng)細菌多樣性及功能分析研究一致?？肆_彭斯特菌屬有利于白酒發(fā)酵過程中醋酸、乳酸、蘋果酸和乙酸乙酯的增加。據(jù)報道，枝芽孢菌屬在白云邊白酒發(fā)酵劑及發(fā)酵過程、玉米黃酒和中國傳統(tǒng)魚露等發(fā)酵產品中發(fā)現(xiàn)，具有較高的蛋白酶活性，且與十二酸乙酯、3-甲基-1-丁醇等風味化合物呈正相關關系。同樣，在QKQ和XMQ中，乳桿菌屬、魏斯氏菌屬的相對豐度分別為13.71%、25.37%和10.84%、11.92%。檢測到的這兩種屬均屬于乳酸菌，與自動與傳統(tǒng)法制醬香大曲微生物群落研究一致。簡而言之，乳酸菌作為功能微生物，在中國食品工業(yè)中發(fā)揮著至關重要的作用。已有報道，乳酸菌不僅通過發(fā)酵產生細菌素，而且通過消耗發(fā)酵糖積累有機酸，這表示乳酸菌可以提供一個較低的pH值條件，抑制病原菌在釀造過程中的繁殖，從而促進最終產品的感官和營養(yǎng)價值的提高。高溫放線菌屬39.86%僅存在于QKQ，有研究根據(jù)可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)兩種方法報道了高溫放線菌屬大多存在于高溫發(fā)酵條件下。因此，在高溫大曲中檢測到高溫放線菌屬也不足為奇。此外，uncultured_bacterium_f_Bacillaceae 41.65%、芽孢桿菌屬11.11%和火山渣芽孢桿菌屬6.09%僅作為ZMQ的主要優(yōu)勢屬。芽孢桿菌屬是一種廣泛存在于各種發(fā)酵食品中的需氧菌，已被鑒定為大曲中的功能性微生物，能代謝產生蛋白酶、淀粉酶和其他水解酶，也能產生吡嗪、揮發(fā)酸、芳香和酚類化合物，這些物質對茅香型白酒的風味形成和品質具有重要貢獻。有研究報道，火山渣芽孢桿菌屬存在于高溫大曲中，細胞具有需氧、不活動、革蘭氏染色陽性、氧化酶陰性和過氧化氫酶陽性等特點。然而，uncultured_bacterium_f_Bacillaceae在本研究中被首次報道。

圖4 大曲樣品在屬水平上細菌（A）和真菌（B）的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) at the genera level in Daqu samples

鑒定出的優(yōu)勢真菌屬（相對豐度＞1%）為熱子囊菌屬（）、紅曲霉屬（）、絲衣霉屬（）、嗜熱真菌屬（）、哈薩克斯坦酵母屬（）、孢圓酵母屬（）、德巴利氏酵母屬（）、、曲霉屬（）和，屬于子囊菌門。其中，在3 個大曲中以熱子囊菌屬和德巴利氏酵母屬為主，而嗜熱真菌屬和絲衣霉屬分別為QKQ和XMQ的絕對優(yōu)勢屬。熱子囊菌屬和嗜熱真菌屬是高溫大曲中常見的兩種真菌，在高溫下生長繁殖，產生多種耐熱水解酶幫助白酒堆積糖化發(fā)酵，從而對醬香風味的形成起重要作用。絲衣霉屬具有耐熱、耐低氧、耐酸和產果膠酶等特性，且與己酸乙酯、辛酸乙酯等醬香型白酒主體香氣成分密切相關。紅曲霉屬主要存在于XMQ和ZMQ，而哈薩克斯坦酵母屬和孢圓酵母屬則以XMQ和QKQ為主。紅曲霉屬能分泌大量酯酶，對碳酸十四乙酯和苯乙醇的形成有促進作用。哈薩克斯坦酵母屬和孢圓酵母屬作為非釀酒酵母菌，通過其獨特的次生代謝物產生對酒的感官特性作出積極貢獻。其中，哈薩克斯坦酵母屬代謝物主要具有果香和花香的特征，與釀酒酵母相比，能產生大量乙酸異戊酯等酯類化合物。有研究報道，孢圓酵母屬對糖的利用速度優(yōu)于哈薩克斯坦酵母屬。此外，曲霉屬和主要存在于ZMQ。曲霉屬能產生水解酶作用于淀粉糖化、蛋白質水解和類黃酮的生成，從而促進芳香類化合物的形成。有報道稱，是中溫大曲和普洱茶風味形成的潛在功能微生物。綜上所述，大曲樣品中檢測到的微生物在結構和多樣性上存在較大差異，主要由原料營養(yǎng)成分差異所致。

2.3 PCA、OPLS-DA和HCA

通過對樣品數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計分析，較為客觀地反映樣品的微小變化及分類?；诓煌现苽涞尼u香大曲微生物屬的相對含量數(shù)據(jù)，利用SIMCA 14.1軟件進行PCA、OPLS-DA和HCA（圖5）。PCA得分圖表明組間分離明顯、信度較高，在細菌分析中變量得分圖顯示PC1和PC2的方差貢獻率分別為43.39%和40.24%（圖5A），真菌中的變量得分圖顯示PC1為52.43%，PC2為33.69%（圖5A）。此外，為了更好地了樣品組間差異的微生物屬，進行了OPLS-DA，以濾除與微生物屬中分類變量無關的正交變量，并分別分析非正交變量和正交變量，以獲得更可靠的模型信息。根據(jù)OPLS-DA得分圖的結果，樣本均在95% Hotelling的平方橢圓內，說明分析樣本中不存在異常值（圖5B）。模型中細菌和真菌的R和值非常接近1，表明它們可以有效地解釋樣本之間的差異。同時，通過HCA結果發(fā)現(xiàn)，在細菌屬的聚類分析中ZMQ和XMQ聚為一簇，而QKQ獨為一簇（圖5C）。然而，在真菌屬的聚類分析中QKQ和ZMQ為一簇，XMQ單獨為一簇（圖5C）。上述結果表明，不同原料制備的醬香大曲由于原料成分差異導致最終產品在微生物間存在較大差異。

圖5 大曲樣品中微生物屬的PCA（A）、OPLS-DA（B）和HCA（C）Fig.5 PCA (A),OPLS-DA (B),and HCA (C) of microbial genera in Daqu samples

2.4 樣品組間微生物群落顯著性差異及標記物分析

為進一步探究不同原料加工制備醬香大曲中的微生物群落標記物，基于LEfSe方法對3 組大曲樣品間菌群豐度差異特征進行分析。微生物各分類水平上的分類等級樹如圖6A和圖6B所示，由內圈到外圈分別表現(xiàn)為微生物群落從界到屬分類單元的等級關系，節(jié)點大小表示分類單元的豐度高低，黃色節(jié)點代表組間無顯著差異的分類單元，其他顏色的節(jié)點表示該分類單元在對應樣品中豐度較高且組間具有顯著差異，線性判別分析值（LDA score）設定為4.0。

基于LEfSe，3 組大曲樣品優(yōu)勢屬中共發(fā)現(xiàn)10 種顯著差異細菌屬（圖6A）和9 種顯著差異真菌屬（圖6B）（LDA score＞4，＜0.05）。其中，ZMQ樣品占9 種，分別為5 種細菌屬（棒狀桿菌屬_1、鞘氨醇桿菌屬、芽孢桿菌屬、火山渣芽孢桿菌屬和uncultured_bacterium_f_Bacillaceae）和4 種真菌屬（曲霉屬、紅曲霉屬、熱子囊菌屬和）。XMQ樣品含4 種顯著差異屬，細菌屬（枝芽孢菌屬和克羅彭斯特菌屬）和真菌屬（絲衣霉屬和）分別占兩種。同時，QKQ顯著差異細菌屬（高溫放線菌屬、乳酸菌屬和魏斯氏菌屬）和真菌屬（嗜熱真菌屬、哈薩克斯坦酵母屬和孢圓酵母屬）分別為3 種。此外，柱狀圖的優(yōu)勢屬中4 種細菌屬（葡萄球菌屬、鏈霉菌屬、短桿菌屬和uncultured_bacterium_f_Pseudonocardiaceae）和1 種真菌屬（德巴利氏酵母屬）未能體現(xiàn)，可認為它們的組間差異性不明顯。

圖6 大曲樣品中細菌（A）和真菌（B）的LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis of bacteria (A) and fungi (B) in Daqu samples

3 結論

分別以青稞、紫小麥和純小麥為原料，以相同條件下加工而成的醬香大曲為樣品，采用高通量測序技術對微生物群落結構和多樣性進行分析，并基于多元統(tǒng)計分析揭示了組間分離情況及標記微生物。結果表明：在細菌屬中，XMQ以克羅彭斯特菌屬、枝芽孢菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬為主；ZMQ以克羅彭斯特菌屬、枝芽孢菌屬、uncultured_bacterium_f_Bacillaceae、芽孢桿菌屬和火山渣芽孢桿菌屬為主；QKQ以乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和高溫放線菌屬為主。在真菌屬中，樣品均以熱子囊菌屬和德巴利氏酵母屬為優(yōu)勢屬；此外，XMQ以絲衣霉屬、紅曲霉屬、哈薩克斯坦酵母屬和孢圓酵母屬為主；ZMQ以紅曲霉屬、曲霉屬和為主；QKQ以哈薩克斯坦酵母屬、孢圓酵母屬、嗜熱真菌屬為主。多元分析表明組間分離明顯，且從優(yōu)勢屬中共獲得了10 種顯著差異細菌屬和9 種顯著差異真菌屬。目前，對不同原料酒曲微生物的代謝機制不明確，后續(xù)研究需進一步利用代謝組學、轉錄組學和蛋白質組學方法研究酒曲的功能菌株及發(fā)酵機制。本研究結果為生產醬香大曲時選擇原料提供了指導。