多酶分步水解法制備菜籽多肽工藝的研究

周 桐，高 盼,2,3?，王 澍，周 力，胡傳榮，何東平,3

（1. 武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2. 大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，湖北 武漢 430023；3. 國家市場監(jiān)管重點實驗室（食用油質量與安全），湖北 武漢 430012；4. 武漢食品化妝品檢驗所，湖北 武漢 430012）

2020年，我國菜籽產量高達1 400萬t，為世界菜籽產量第一。菜籽粕中含有35%～42%的蛋白質，且氨基酸平衡，極少檢出限制氨基酸，營養(yǎng)價值不亞于酪蛋白和動物蛋白，開發(fā)潛力較大[1]。將菜籽蛋白降解成肽類，能使菜籽蛋白的利用率提高，不會產生毒害物質，增加其經濟價值。菜籽多肽比菜籽蛋白質結構簡單，分子量小，是一類由氨基酸通過肽鏈相連的化合物，可為機體提供營養(yǎng)，調節(jié)生理技能。同時部分低肽不僅能夠為人體提供生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質，還具備防病治病等特殊功效和一些食品蛋白質或其組成氨基酸所缺乏的獨特生物活性，如調節(jié)抗氧化、免疫和降低血壓等[2-3]。

目前制備菜籽多肽的方法主要有酶法、化學法和固態(tài)發(fā)酵法，酶法水解有反應效率高、條件溫和、反應過程可控且能夠保留多肽的營養(yǎng)價值等優(yōu)勢[4]。按照水解方式的不同可分為內切蛋白酶和外切蛋白酶，內切蛋白酶作用于蛋白質分子內部肽鍵，將蛋白質水解成分子量較小的多肽類。外切蛋白酶作用于蛋白質或多肽分子氨基或梭基末端的肽鍵，使肽鍵斷裂生成游離氨基酸，外切蛋白酶能夠將處于肽鏈末端的疏水性氨基酸水解出來，從而降低多肽的苦味[5]。酶的選擇必須依據氨基酸的組成和酶的專一性結合生成物的結構來選擇[6]。目前常見的酶有菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等，酶法水解的研究熱點集中在如何提高菜籽蛋白的酶解效率，郭濤[7]等利用中性蛋白酶水解菜籽蛋白制備菜籽多肽，通過正交實驗得到最佳酶解條件，將蛋白質酶解后有75%左右的蛋白質轉化為可溶性肽，得到的菜籽多肽點度低，流動性好，熱穩(wěn)定性優(yōu)良。采用分步酶解能有效地提高蛋白水解度，劉海梅[8]等采用木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶對脫脂菜籽餅柏中的蛋白質分兩步進行水解研究，在兩種蛋白酶的最適反應條件下，水解度可達30.95%。薛照輝[9]等對菜籽清蛋白進行了分步水解，將菜籽蛋白由單酶的水解度 14.72%提高至雙酶水解度28.10%。雖然現(xiàn)有的分步酶解法提高了水解度，但總體水解效果仍然較差。同時，酶水解后會暴露出疏水的氨基酸殘基，當疏水殘基達到一定含量時菜籽多肽有明顯苦味，限制了其在食品方面的應用[10-11]。

因此，本研究通過分步水解，優(yōu)化菜籽肽加工工藝，提高菜籽蛋白水解度，同時優(yōu)化水解條件，使菜籽肽脫苦，提高菜籽蛋白的開發(fā)利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽蛋白：實驗室自制；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復合風味蛋白酶（酶活力分別為 19.8×104U/g、20.1×104U/g、1.5×104U/g）：Novo Nordisk公司（北京分公司）；木瓜蛋白酶（酶活力為10.6×104U/g）：西安隆茂生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸銨（ANS）：吳江東風化工有限公司（98%以上）；正己烷、氫氧化鈉、鹽酸等分析純試劑：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-2C型精密酸度計：上海右一儀器有限公司；ZFA-1型旋轉蒸發(fā)儀、恒溫磁力攪拌器、微量凱式定氮儀、pH-Stat裝置：上海亞榮生化儀器廠；LXJ-Ⅱ型離心沉淀機：上海醫(yī)用分析儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿公司；電熱恒溫水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠；超級恒溫水浴糟：常州邁科諾儀器有限公司；低速離心機 LD5-10：北京醫(yī)用離心機廠；FD-8型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 常規(guī)成分含量的測定

水份含量的測定：105 ℃恒重法（《GB 5009.3—2016食品安全國家標準 食品中水分的測定》）；灰份含量的測定：550 ℃灼燒法（GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》）；蛋白質含量的測定：半微量凱氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》）；脂肪含量的測定：索氏抽提法（GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》）。

1.3.2 蛋白酶的選擇

選取中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶四種蛋白酶對菜籽蛋白進行水解，參照四種酶的最適宜條件進行實驗，選取其中水解度最高的酶進行第一步水解。

1.3.3 菜籽蛋白多肽液的制備

取15 g菜籽蛋白粉，以料液比1∶8添加蒸餾水在80～90 ℃進行濕熱處理，在添加食品添加劑三聚磷酸鈉進行酸化處理，經過濕熱處理和酸化處理的蛋白液，可有效地促進菜籽蛋白的水解；將經過預處理后的菜籽蛋白，采用多酶蛋白酶在超聲波輔助條件下進行恒溫酶解，酶解過程中均勻不斷地滴加堿液保持溶液 pH不變，反應結束后再次調節(jié) pH值與反應溫度，然后加入復合風味蛋白酶進行第二次酶解。酶解完成后，取出樣品進行微波滅酶處理。微波功率為600 W，滅酶溫度為80 ℃，滅酶時間約2 min，得到滅酶后的酶解液；將微波滅酶后的漿液使用離心機離心，轉速為5 000 r/min，離心時間20 min，取上清液，并計算水解度（DH），將上清液進行冷凍干燥處理，既得成品菜籽肽。

1.3.4 水解度（HD）的測定

采用pH-stat法[12]，在水解過程中不斷補充堿液，每30 min記錄加0.5 mol/L NaOH量，水解完畢，對其進行滅酶處理，根據所添加的NaOH量，計算水解度。水解度計算公式如下：

式中：B表示 NaOH消耗量，單位為 mL；Nb表示NaOH濃度，單位為mol/L；Mp表示被水解的蛋白質量，單位為g；htot表示單位質量原料蛋白中肽鍵的總數，單位為mmol/g。實驗采用菜籽蛋白為原料，取htot=7.21。

α—α-NH2在蛋白底物中的平均解離度，可用下式計算而得：

其中，pH表示酶解過程中反應液的pH值；pK表示NH3+的解離常數。

1.3.5 對菜籽蛋白進行濕熱處理濕熱溫度的確定

通過比較四種不同蛋白酶的水解效果，先對菜籽進行不同溫度（50、60、70、80、90 ℃）的濕熱處理，再用四種蛋白酶中效果最好的一種對經濕熱處理后的菜籽蛋白進行水解，通過比較水解度來確定濕熱處理較好的溫度，以空白為對照。

1.3.6 酶解菜籽蛋酶解條件的單因素實驗

取菜籽蛋白，加蒸餾水配置成底物濃度為3%的菜籽蛋白溶液，對菜籽蛋白進行水解，采用pH-stat法測菜籽蛋白的水解率，分別研究水解時間（10、20、30、45、60、75、90、120 min）、水解 pH（8、9、10、11）、水解溫度（45、50、55、60、65 ℃）、堿性蛋白酶用量（2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g）這四個因素對菜籽蛋白水解度的影響。

1.3.7 酶解菜籽蛋白工藝條件的優(yōu)化

通過響應面實驗探索影響酶解菜籽蛋白的主要因素，以上述四個因素設置單因素實驗，根據單因素實驗的結果，應用 Design-Expert 8.0.6分析軟件，按Box-Behnken實驗設計方案，以菜籽蛋白水解度為響應值，選擇合適的因素和水平，通過響應面分析得出自變量與響應函數之間的統(tǒng)計模型，確定酶解菜籽蛋白的最優(yōu)工藝。

1.3.8 疏水性的測定

參考文獻[13]方法進行測定。以ANS為探針，此試劑在水中與非極性環(huán)境中不產生熒光。ANS與蛋白質中的膜或相對疏水的區(qū)域鍵合時，就會產生熒光，利用這個特性就可以檢測蛋白質的表面疏水性。

配制1 mg/mL的蛋白溶液，溶于0.01 mol/L的磷酸緩沖液中（pH 7.0），在20 ℃下處理2 h，于10 000 r/min下離心10 min，測定上清液中的蛋白質濃度。得到的上清液分別稀釋到 0.15、0.075、0.038和0.019 mg/mL，在4 mL的蛋白液中加入20 μL的ANS，測定熒光強度，發(fā)射光和激發(fā)光的波長分別為390 nm和470 nm，以熒光強度對蛋白濃度做出曲線，將曲線的開始斜率定為被檢測樣品的表面疏水性S0。

ANS溶液的配制：8 mmol/L ANS溶于0.01 mol/L的磷酸緩沖液中，pH值為7.0。

1.4 數據分析

所有樣品均檢測3次，采用SPSS 16.0軟件，對數據進行單因素方差分析，結果采用平均值±標準偏差（SD）表示，以 Duncan多邊檢驗對實驗均值進行差異顯著性分析（P＜0.05）。用Origin 8.5對數據分析作圖。

2 結果與分析

2.1 原料成分分析結果

本實驗所用菜籽蛋白原料，是實驗室對冷榨菜籽餅進行脫脂、粉碎、過篩得到的菜籽蛋白粉，對其進行成分分析，結果見表1。

表1 菜籽蛋白粉主要成分Table 1 Main components of rapeseed protein powder

由表1可知，冷榨菜籽餅中的粗蛋白含量為65.50%，蛋白含量較高，因此，其蛋白適合合成作制備菜籽肽的原料。

2.2 蛋白酶水解度

選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合風味蛋白酶和木瓜蛋白酶四種酶分別對菜籽蛋白進行水解，以水解度為考察指標，四種蛋白酶酶解效果比較見表2。

表2 四種蛋白酶的水解效果比較Table 2 Comparison of hydrolysis effects of four proteases

由表2可知，堿性蛋白酶的水解能力是這四種酶中最強的，DH為15.5%，水解度最高，且沒有不適感官特性，溶液清亮。因此，首先選擇堿性蛋白酶進行菜籽蛋白水解實驗，并進一步探討堿性蛋白酶水解條件。

2.3 對菜籽蛋白進行濕熱處理濕熱溫度的確定

選擇堿性蛋白酶進行酶解，選取5個不同溫度（50、60、70、80、90 ℃）對菜籽蛋白濕熱處理，菜籽蛋白濃度為40 mg/mL，處理時間10 min，底物濃度為 3%，選擇堿性蛋白酶添加量為4 000 U/g作為空白對照組，比較不同溫度濕熱處理水解度，結果見圖1。

圖1 不同濕熱預處理的溫度對菜籽蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of different damp heat pretreatment on hydrolysis degree of rapeseed protein

由圖1可知，濕熱溫度在50～90 ℃范圍內時，蛋白酶水解度先上升后趨于穩(wěn)定，在 50～60 ℃時，水解度隨著溫度上升而增大，從 50 ℃時，從18.1%增加到60 ℃時的19.3%，上升了1.2%。隨著溫度繼續(xù)增加，水解度變化平緩。因此，菜籽蛋白的濕熱預處理的溫度選取60 ℃。

2.4 多酶法水解菜籽蛋白單因素實驗

將菜籽蛋白濕熱處理后添加堿性蛋白酶進行第一次水解，對影響堿性蛋白酶水解菜籽蛋白可能的因素如反應溫度、反應pH、加酶量及反應時間等進行單因素實驗，分別探究反應溫度（45、50、55、60、65 ℃）、反應 pH（9.0、9.5、10、10.5、11）、加酶量（4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g）及反應時間（30、60、90、120、150 min）這四個因素對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白的影響。

2.4.1 反應溫度對菜籽蛋白水解的影響

實驗條件為：PH 10，加酶量10 000 U/g，反應時間90 min，超聲強度1.0 W/cm3，選擇5個不同反應溫度（45、50、55、60、65 ℃）探討溫度對酶催化菜籽蛋白水解的影響，結果見圖2。

圖2 反應溫度對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白水解效果的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the hydrolysis effect of rapeseed protein hydrolyzed by alkaline protease

如圖2所示，水解度隨著反應溫度增加總體呈先上升后下降，在反應溫度為45～55 ℃時，水解度隨著溫度提高而增加，在55 ℃時達到最高，為35.8%，之后隨著溫度增加而降低。由此可知，當溫度大于 55 ℃時，隨著溫度繼續(xù)升高，超過蛋白酶活性適宜溫度，活性降低，催化能力下降，因此，選擇反應溫度為55 ℃，進一步優(yōu)化實驗。

2.4.2 反應pH對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白的影響

實驗條件為，反應溫度 55 ℃，加酶量8 000 U/g，反應時間 90 min，超聲強度 1.0 W/cm3，選擇5個不同的pH（9.0、9.5、10.0、10.5、11）探討 pH值對酶催化菜籽蛋白水解效果的影響，結果見圖3。

圖3 反應pH對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白水解效果的影響Fig.3 Effect of reaction pH on the hydrolysis effect of rapeseed protein hydrolyzed by alkaline protease

如圖3所示，隨著 pH增加，水解度先上升后下降，在pH 9～10.5時，水解度緩慢上升，在pH值10.5時達到最大，為35.3%，之后隨著pH值繼續(xù)增大，水解度快速下降，堿性蛋白酶有最適宜的反應 pH值，過高或者過低時都會影響其催化水解的能力。選擇pH值為10.5進一步優(yōu)化實驗。

2.4.3 加酶量對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白的影響

實驗條件為，反應溫度55 ℃，反應pH 10.5，反應時間 90 min，超聲強度 1.0 W/cm3，選擇 5個不同的加酶量（4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g）探討加酶量對酶催化菜籽蛋白水解效果的影響，結果見圖4。

圖4 加酶量對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白水解效果的影響Fig 4 Effect of enzyme dosage on the hydrolysis effect of rapeseed protein hydrolyzed by alkaline protease

如圖 4所示，隨著加酶量增大，水解度先上升后趨于穩(wěn)定。在加酶量4 000～10 000 U/g時，水解度快速增大，隨后隨著加酶量繼續(xù)增加水解度趨于穩(wěn)定，因此，選取加酶量 0.05%（以水溶液重量計算）進行下一步優(yōu)化。

2.4.4 反應時間對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白的影響

實驗條件為，反應溫度55 ℃，反應pH 10.5，加酶量10 000 U/g，超聲強度1.0 W/cm3，選擇5個不同的反應時間（30、60、90、120、150 min）探討加酶量對酶催化菜籽蛋白水解效果的影響，結果見圖5。

如圖5所示，在30～150 min反應時間內，水解度隨著時間增加先增大后趨于穩(wěn)定。在 30～60 min時，水解度隨著時間增加快速增大，在60～90 min時，水解度隨著時間增加減速增大，反應時間達到90 min時，水解度隨著時間繼續(xù)增大變化不顯著。因此，選擇反應時間為90 min。

圖5 反應時間對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白水解效果的影響Fig.5 Effect of reaction time on the hydrolysis effect of rapeseed protein hydrolyzed by alkaline protease

2.5 堿性蛋白酶水解菜籽蛋白工藝條件的優(yōu)化

在單因素實驗的基礎上，根據 Box-Behnken實驗設計原理，對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白的 3個主要影響因素反應溫度、反應 pH和加酶量采用3因素3水平的響應面分析方法，實驗因素及水平編碼見表3。

表3 Box-Behnken實驗因素及水平編碼表Table 3 Box Behnken test factors and level codes

采用Design-Expert 8.0.6 Box-Behnken實驗設計方法對反應溫度、反應pH和加酶量3個因子進行3因素3水平的響應面分析方法，以菜籽蛋白水解度(Y)為響應值進行響應面分析實驗設計。進行5次零水平實驗，共17個實驗點，堿性蛋白酶水解菜籽蛋白的優(yōu)化工藝設計及結果見表 4，該模型的回歸分析見表5。

表4 堿性蛋白酶水解菜籽蛋白工藝優(yōu)化BBD實驗設計及結果Table 4 BBD experimental design and results of optimization of rapeseed protein hydrolysis process by alkaline protease

表5 回歸方程方差分析表Table 5 Analysis of variance of regression eq uation

由表 5回歸方程方差分析表可知，模型P＜0.01（非常顯著），失擬項 P=0.989 2＞0.05（不顯著），說明該模型選擇正確，擬合程度較好，該模型的預測值與實際值能夠很好的吻合。由P值可知，一次項 A、B、C以及二次項 A2、B2、C2對響應值脫膠油中磷脂含量的影響是非常顯著的（P＜0.01）。擬合所得的回歸方程如下：

Y=-13 377.21+94.23A+1 981B+0.083C-0.38AB+0.000 03AC-0.003BC-0.82A2-93.13B2-0.000 003 58C2

在所選取的各因素水平范圍內，根據表 6中各因素的 F-value的絕對值大小可以判斷出反應溫度、反應 pH和加酶量這三個因素對堿性纖維素酶水解菜籽蛋白效果的影響程度大小排序為：加酶量＞反應pH＞反應溫度。

由Design Expert 8.0.6b軟件處理得到的各因素交互作用的響應面圖，隨著各因素的增大，響應值增大；當響應值增大到最大值后，隨著因素的增大，響應值變化不明顯或逐漸減??；在交互項對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白的影響如圖 6～8所示。

圖6 反應溫度與反應pH交互作用對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白水解效果的影響Fig.6 Effect of interaction between reaction temperature and reaction pH on the hydrolysis effect of rapeseed protein hydrolyzed by alkaline protease

圖7 反應溫度與加酶量的交互作用對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白水解效果的影響Fig.7 Effect of the interaction between reaction temperature and enzyme dosage on the hydrolysis effect of rapeseed protein hydrolyzed by alkaline protease

圖8 反應pH與加酶量的交互作用對堿性蛋白酶水解菜籽蛋白水解效果的影響Fig.8 Effect of the interaction between reaction pH and enzyme dosage on the hydrolysis effect of rapeseed protein hydrolyzed by alkaline protease

通過響應面回歸分析，得出最佳反應條件：反應溫度為55.30 ℃，反應pH為10.47，加酶量為10 400.97 U/g，在此優(yōu)化條件下，菜籽蛋白水解度的理論值為31.82%，與單因素實驗結果較為一致，這也驗證了預測的準確度。考慮到實際操作與經濟效益，對工藝條件進行修正，為反應溫度55.5 ℃、反應pH為10.5、加酶量為10 400 U/g。在修正條件下進行驗證，重復實驗3次，酶催化菜籽蛋白的平均水解度為31.64%，這與所預測的最優(yōu)值基本吻合，這也進一步表明了回歸模型的有效性。

2.6 復合風味蛋白酶二次水解菜籽蛋白

菜籽蛋白經過上一階段堿性蛋白酶水解之后，將水解后的溶液加熱至90 ℃，滅酶10 min。隨后將溶液冷卻至55 ℃，調節(jié)pH為6.2，加酶量為1 200 U/g。添加復合風味蛋白酶進行下一階段水解，水解曲線見圖 9。如圖 9所示，水解度隨著時間增加先增大后趨于穩(wěn)定，在0～90 min時，隨著時間增加水解度持續(xù)增大，之后隨著時間繼續(xù)增加水解度變化平緩。結果表明，使用多酶水解能有效增加菜籽蛋白水解度，水解度由開始時的 30.56%增長到 38%以上，在水解時間 90 min后，繼續(xù)增加水解時間水解度變化不顯著。因此，選擇復合風味蛋白酶水解時間90 min。此外，利用復合風味蛋白酶其外切酶作用的特性，將位于肽鏈端基的疏水性氨基酸殘基切下，可有效的減小菜籽蛋白水解液的苦味。

圖9 復合風味蛋白酶水解菜籽蛋白酶解液曲線Fig.9 Curve of rapeseed hydrolysate hydrolyzed by complex flavor protease

2.7 菜籽肽疏水基的測定

通過水解菜籽蛋白制備的菜籽肽經常有明顯苦味，加入復合風味蛋白酶后，切斷分子內部肽鍵，使形成短肽鏈。其中含有一定量的疏水氨基酸，因而形成苦肽；在食品加工的過程中添加合適的復合風味蛋白酶，能夠水解風味前體物，風味物質被釋放，食品的風味得到改善。不同來源的蛋白質和蛋白質水解后的結構特征不同，對水解產物中的苦味影響很大，研究發(fā)現(xiàn)平均疏水性大于5.85 kJ/mol殘基時，蛋白質或肽才會產生苦味。通過酶解反應，能夠切除末端的疏水性氨基酸，使達到脫苦的目的，且復合風味蛋白酶水解產生的肽具有特殊的鮮味，因此以平均疏水性為指標，研究了復合風味蛋白酶對菜籽肽脫苦的影響。菜籽蛋白在水解過程中隨著時間的變化對復合風味蛋白酶脫苦的影響如圖10所示。

圖10 時間的變化對復合風味蛋白酶脫苦的影響Fig.10 Effect of time change on debittering of compound flavor protease

由圖 10可知，在未經復合風味蛋白酶水解時，菜籽肽的平均疏水性為87.62 kJ/mol殘基，遠大于5.85 kJ/mol，疏水殘基隨著復合風味蛋白酶水解時間增加而減少。在0～60 min時殘基急劇下降，由87.62 kJ/mol下降到18.26 kJ/mol殘基，在60～120 min時，殘基平緩下降，由60 min時18.26 kJ/mol下降到 120 min時平均疏水殘基5.62 kJ/mol，小于5.85 kJ/mol，達到理論脫苦效果。

3 結論

通過對比研究堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合風味蛋白酶和木瓜蛋白酶對菜籽蛋白的水解效果，選擇堿性蛋白酶，更易于與氨基酸殘基反應。水解度隨著濕熱處理溫度、加酶量、反應時間等條件升高變化趨勢相同，先上升后趨于穩(wěn)定。水解度隨著反應溫度、反應pH值升高先上升后下降。

本實驗探討了不同反應條件對菜籽多肽水解度影響并對工藝進行優(yōu)化。優(yōu)化工藝條件為：反應溫度 55.5 ℃、反應時間 90 min、反應 pH為10.5、加酶量為 10 400 U/g，該條件下水解度為31.64%。選擇分步水解制備菜籽多肽，經過超聲輔助堿性蛋白酶和復合風味蛋白酶二次酶解的菜籽肽，水解度達到 38%以上，平均疏水性由87.62 kJ/mol下降到5.62 kJ/mol，達到理論脫苦效果。采用多酶分步水解法制備出來的菜籽多肽產品，水解度高，苦味小，有利于在食品中的應用。