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    固定化脂肪酶TLIM催化制備低芥酸文冠果甘油酯

    2022-06-01 10:20:54徐春暉杜俊民
    糧油食品科技 2022年3期
    關(guān)鍵詞:水油芥酸酸價(jià)

    徐春暉,王 瑤,杜俊民

    (山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院,山西 晉中 030619)

    隨著全球人口老齡化,與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病越來(lái)越普遍,阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)是老年人群中最常見(jiàn)的癡呆癥[1]。最近的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,全世界約有5 000萬(wàn)人患有阿爾茨海默癥或其他類型的癡呆癥,影響著全球超過(guò)3 500萬(wàn)人,年輕人也可能患AD?;疾『髸?huì)導(dǎo)致海馬區(qū)以及大腦皮層大量淀粉樣斑塊沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和特定腦區(qū)選擇性神經(jīng)元和突觸丟失[2]。研究證明,神經(jīng)酸能夠恢復(fù)神經(jīng)末稍活性,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育,能夠明顯治療和預(yù)防阿爾茨海默病[3-4]。文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge),別名文冠木、文官果、土木瓜、木瓜、溫旦革子,為無(wú)患子科(Sapindaceae)文冠果屬植物文冠果的木材或枝葉,是自然界富含神經(jīng)酸的植物資源[5]。文冠果油占種子仁的55%~65%,其中含有大約95%的甘油三酯,具有預(yù)防和治療高血壓、血管硬化等心血管病的作用。張東等[6]檢測(cè)到文冠果油芥酸含量為 8.41%,動(dòng)物試驗(yàn)表明大量攝入含芥酸的油脂,心臟會(huì)是主要的中毒器官,可致心肌纖維化引起心肌病變,引起動(dòng)物增重遲緩,發(fā)育不良??赡軙?huì)對(duì)通過(guò)文冠果油攝取神經(jīng)酸的心臟病消費(fèi)者不利,同時(shí)限制了文冠果油的應(yīng)用。盡管還未有確切報(bào)道表明其對(duì)人體的有害作用,但為保障人群健康,更應(yīng)該加以重視文冠果油的質(zhì)量,并采取行動(dòng)[7]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織已規(guī)定油脂中的芥酸含量應(yīng)低于5%。

    目前人們主要通過(guò)基因育種培育低芥酸植物,達(dá)到降低芥酸的目的,這種方法耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),操作要求高,不利于工業(yè)化生產(chǎn),市場(chǎng)上還沒(méi)有出現(xiàn)低芥酸文冠果植物。相關(guān)文獻(xiàn)研究表明,海甘藍(lán)和高芥酸甘藍(lán)型油菜油中的長(zhǎng)碳鏈的芥酸主要位于甘油三酯的 Sn-1、Sn-3位,而 Sn-2位芥酸含量較低[8]。本實(shí)驗(yàn)選用了Sn-1,3位置專一性脂肪酶 TLIM[9]與文冠果油進(jìn)行反應(yīng),脂肪酶TLIM 可把甘油骨架的 Sn-1,3位脂肪酸水解為游離脂肪酸。酶催化法具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)較少、產(chǎn)品質(zhì)量好和收率高等優(yōu)點(diǎn),文冠果油的酶解脫除芥酸工藝的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

    本文以文冠果油為原料,以芥酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用脂肪酶TLIM對(duì)酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,為降低文冠果油中的芥酸含量提高一些參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    文冠果油實(shí)驗(yàn)室自行榨取。

    甲醇鈉溶液(0.1 mol/L)、乙酸溶液(10%體積分?jǐn)?shù))、硫酸甲醇溶液(0.1 mol/L)、正己烷、石油醚、無(wú)水乙醇、氫氧化鉀、酚酞:市售分析純;固定化脂肪酶Lipozyme TLIM:北京高瑞森科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    7890A氣相色譜儀:美國(guó)Agilent公司;800-1離心機(jī):惠智儀誠(chéng)(北京)科技發(fā)展有限公司;85-2B數(shù)顯恒溫磁力攪拌器:蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    精確稱量文冠果油,加入不同量的固定化脂肪酶TLIM和水,混勻,移入廣口瓶中。不同溫度條件下,反應(yīng)一段時(shí)間,取出油樣,使用離心機(jī)離心,取上層清液將甲酯化,利用氣相色譜檢測(cè)文冠果甘油酯的芥酸含量。

    1.3.1 酸價(jià)的測(cè)定

    水解前后的樣品其酸價(jià)用冷溶劑法測(cè)定。精確稱取約文冠果油5 g,溶解在50 mL石油醚和95%乙醇(體積比為1∶1)的混合溶液中,滴加0.15 mL的酚酞指示劑(10 g/L,10 g酚酞溶解在1 L95%的乙醇溶液中),用0.1 mol/L(實(shí)際濃度為0.098 mol/L)的氫氧化鉀乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確中和滴定。三份試樣平行滴定,一份空白對(duì)照,取滴定所用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)液的平均值,結(jié)果按以下公式計(jì)算。

    式中:m—稱取油樣的質(zhì)量,mg;V—滴定所用氫氧化鉀溶液的體積,mL;C—?dú)溲趸浫芤旱膶?shí)際物質(zhì)的量濃度,mol/L;56.1—?dú)溲趸浀哪栙|(zhì)量。

    1.3.2 不同甲酯化方法對(duì)比

    取5 μL文冠果油或最佳條件酶解后產(chǎn)物放置于2支試管中,分別加入5滴硫酸甲醇溶液,制備成高酸價(jià)油脂甲酯化樣品(酸價(jià)大于3.0);加入甲醇鈉溶液(0.1 mol/L)制備成低酸價(jià)甲酯化樣品(酸價(jià)小于3.0)。搖勻,室溫反應(yīng)30 min,加入 5滴乙酸溶液(10%體積分?jǐn)?shù)),搖勻終止反應(yīng),加入5~10滴正己烷,搖勻,靜置15 min。

    1.3.3 TLIM酶添加量對(duì)芥酸含量的影響

    取10 g文冠果油,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、3%、5%、7%、9%TLIM 酶,根據(jù)水油摩爾比為40∶1加入水,在50 ℃下,反應(yīng)0.5 h。

    1.3.4 溫度對(duì)芥酸含量的影響

    取10 g文冠果油,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)7% TLIM酶,根據(jù)水油摩爾比為40∶1加入水,分別在40、45、50、55、60 ℃下,反應(yīng)0.5 h。

    1.3.5 反應(yīng)時(shí)間芥酸含量的影響

    取10 g文冠果油,根據(jù)水油摩爾比為40∶1加入水,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%TLIM酶,在45 ℃下分別反應(yīng)2、3、4、5、6 h。

    1.3.6 水油摩爾比對(duì)芥酸含量的影響

    取10 g文冠果油,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%TLIM酶,水油摩爾比分別控制為10∶1、20∶1、30 ∶1、40∶1、50∶1,在45 ℃下,反應(yīng)5 h。

    1.3.7 正交實(shí)驗(yàn)

    根據(jù) TLIM脂肪酶酶解條件的單因素測(cè)定結(jié)果,對(duì)酶添加量(A)、反應(yīng)溫度(B)、反應(yīng)時(shí)間(C)、水油摩爾比(D)4個(gè)因素分別展開(kāi)3個(gè)水平,進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),具體因素及水平見(jiàn)表 1。

    表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

    1.3.8 氣相色譜測(cè)定芥酸含量的色譜條件

    色譜柱:30.0 m×320 μm 毛細(xì)管,膜厚0.25 μm,流速 1 mL/min。柱箱:初始溫度為180 ℃,平衡 1 min,以 20 ℃/min的速率保持4 min、運(yùn)行 4 min,以 10 ℃/min的速率保持8 min、運(yùn)行 15 min;檢測(cè)器:加熱器 250 ℃。采用面積歸一化法定量。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)采用Origin2018進(jìn)行處理,正交設(shè)計(jì)助手專業(yè)版V3.1破解綠色版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 水解前后酸價(jià)的比較

    根據(jù)圖 1文冠果油的酸價(jià)從 1.12 mgKOH/g升高到126.06 mgKOH/g。

    圖1 文冠果油水解反應(yīng)酸價(jià)的變化Fig.1 Changes of acid value in the hydrolysis reaction of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil

    2.2 不同甲酯化方法對(duì)比

    混合物中的甘油三酯、甘油二酯、單甘酯都是沸點(diǎn)較高的油脂類物質(zhì),不容易氣化,要分析脂肪酸組成和含量,需要預(yù)先進(jìn)行衍生化,衍生化后的產(chǎn)物沸點(diǎn)變低,容易氣化[10]。本實(shí)驗(yàn)采用酸法和堿法兩種不同的甲酯化方法,對(duì)文冠果油進(jìn)行衍生化。

    根據(jù)張浩對(duì)兩種甲酯化方法進(jìn)行對(duì)比的結(jié)果,堿法更適合甘油三酯的衍生化(酸價(jià)大于3.0),而酸法為游離脂肪酸的衍生化的最佳方法[11]。從圖2可以看出脂肪酶水解文冠果油后甘油三酯中的芥酸含量降低,游離脂肪酸中的芥酸含量升高,文冠果油的酸價(jià)從 1.12 mgKOH/g升高到126.06 mgKOH/g,說(shuō)明以甘油三酯為主的文冠果油轉(zhuǎn)變?yōu)橐杂坞x酸形式為主,脂肪酸存在形式發(fā)生轉(zhuǎn)變,同時(shí)檢測(cè)到游離酸中芥酸含量由水解前12.31%增加到水解后的17.51%,可以初步斷定芥酸從甘油三酯上水解下來(lái),變?yōu)橛坞x芥酸。由于產(chǎn)品的最終形式為甘油三酯成分為主,所以本實(shí)驗(yàn)均采用堿法甲酯化,進(jìn)行衍生化。

    圖2 兩種甲酯化方法比較Fig.2 Comparison of two methyl esterification methods

    2.3 不同TLIM酶添加量對(duì)芥酸含量的影響

    在水解的過(guò)程中起著催化作用的 TLIM酶具有位置專一性,能特異性水解甘油三酯Sn-1,3位上的脂肪酸,本實(shí)驗(yàn)研究了不同TLIM酶添加量對(duì)酶解文冠果油芥酸含量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。

    圖3 TLIM酶添加量對(duì)芥酸含量的影響Fig.3 Effect of TLIM enzyme addition on erucic acid content

    圖3顯示,芥酸含量隨著加酶量的增加先緩慢降低,在TLIM酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)達(dá)到最低后穩(wěn)定。分析原因可能是酶主要催化劑的作用,酶添加量較低時(shí),脂肪酶水解程度不夠,當(dāng) TLIM酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí),酶與文冠果油的接觸已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài),催化反應(yīng)趨于穩(wěn)定。因此,最佳TLIM酶添加量是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%。

    2.4 不同酶解溫度對(duì)芥酸含量的影響

    在酶催化的過(guò)程中,溫度的變化不僅對(duì)酶的活性有很大的影響,還會(huì)致使反應(yīng)的熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)過(guò)程產(chǎn)生有很大的變化。實(shí)驗(yàn)研究了不同溫度對(duì)酶解文冠果油芥酸含量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。

    圖4 酶解溫度對(duì)芥酸含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on erucic acid content

    圖4顯示,芥酸含量呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢(shì)。酶解溫度低于 45 ℃時(shí),隨著酶解溫度的增加,芥酸含量不斷下降,45 ℃時(shí)芥酸含量達(dá)到最小,當(dāng)溫度超過(guò) 45 ℃芥酸含量逐漸上升。原因可能是 Sn-2位羥基與酶形成過(guò)度中間態(tài)所需的活化能要遠(yuǎn)高于Sn-1(3)位羥基,先增加是由于溫度升高加快了反應(yīng)速率,后減少便是因?yàn)槊傅倪x擇性降低,反應(yīng)速率會(huì)逐漸降低,芥酸含量逐漸升高。綜上考慮,最佳酶解溫度為45 ℃。

    2.5 不同酶解時(shí)間對(duì)芥酸含量的影響

    在催化反應(yīng)的過(guò)程中,反應(yīng)時(shí)間與芥酸含量密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)考察了不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解文冠果油芥酸含量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。

    圖5 酶解時(shí)間對(duì)芥酸含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on erucic acid content

    圖5顯示,隨著酶解時(shí)間的增大芥酸含量逐漸升高,5 h時(shí)達(dá)到最小值,隨后逐漸升高。分析原因可能是脂肪酶的水解反應(yīng)和酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng)[12],隨著酶解時(shí)間的增加,被水解下來(lái)的游離芥酸逐漸升高,與甘油、甘油一酯、甘油二酯發(fā)生酯化反應(yīng)導(dǎo)致文冠果油甘油三酯上結(jié)合的芥酸含量略上升,反應(yīng)平衡被打破,建立起新的平衡。因此,酶解反應(yīng)時(shí)間5 h為最佳。

    2.6 不同水油摩爾比對(duì)芥酸含量的影響

    本實(shí)驗(yàn)考察了不同水油摩爾比對(duì)酶解文冠果油芥酸含量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。

    圖6 水油摩爾比對(duì)芥酸含量的影響Fig.6 Effects of molar ratio of water to oil on erucic acid content

    由圖6可知,隨著水油摩爾比的增加芥酸含量逐漸降低后又升高至平穩(wěn),分析原因可能是脂肪酶的活性中心部位被一個(gè)α螺旋的“蓋子”結(jié)構(gòu)所覆蓋,當(dāng)脂肪酶作用于油水反應(yīng)界面時(shí),脂肪酶分子的構(gòu)像發(fā)生變化[13]。α螺旋的“蓋子”打開(kāi),催化中心與底物接觸,發(fā)生催化反應(yīng)。當(dāng)水油摩爾比較低時(shí),文冠果油與TLIM脂肪酶的接觸少,大多數(shù)脂肪酶的活性中心沒(méi)暴露出來(lái)導(dǎo)致反應(yīng)速率低;隨著水油摩爾比的增加,TLIM脂肪酶與文冠果油可以充分接觸,脂肪酶活性中心充分暴露,水解速率就會(huì)加快,酶解程度升高,但位置選擇性會(huì)變差。綜上考慮,最佳水油摩爾比為30∶1。

    2.7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)酶添加量(A)、反應(yīng)溫度(B)、反應(yīng)時(shí)間(C)、水油摩爾比(D)4個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。

    由表 2可知,RA>RB>RD>RC可得出酶添加量是影響酶水解法降低芥酸含量的最主因素,各因素對(duì)酶水解法降低芥酸含量的影響從強(qiáng)到弱依次是:酶添加量>反應(yīng)溫度>水油摩爾比>反應(yīng)時(shí)間。以芥酸含量為考察指標(biāo),綜合分析四個(gè)因素及三組水平得到最優(yōu)條件應(yīng)為A1B2C2D3:酶添加量為(質(zhì)量分?jǐn)?shù))5%、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、水油摩爾比為30∶1,得到芥酸含量最低4.86%。

    表2 正交實(shí)驗(yàn)直觀表L9(34)Table 2 Intuitive Table of orthogonal experiment L9(34)

    2.8 文冠果油酶解后脂肪酸組成

    由表 3可知,文冠果油的主要脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、二十碳烯酸、芥酸、神經(jīng)酸。圖7為文冠果油酶解前后氣相色譜對(duì)比圖,A為文冠果油色譜圖,B為最優(yōu)條件下酶解產(chǎn)物色譜圖。在固定化脂肪酶TLIM的催化水解下甘油三酯上芥酸含量從酶解前的 8.04%降低酶解后到了 4.86%,且神經(jīng)酸含量保持著 1%左右(酶解后為0.98%)。確定甘油三酯1,3位上的芥酸水解為游離芥酸,導(dǎo)致酸價(jià)升高,脫除游離酸后可得到低芥酸文冠果油,具體脫酸工藝實(shí)驗(yàn)室正在研究中。

    圖7 文冠果油及其水解產(chǎn)物的氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatogram of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil and its hydrolysates

    表3 酶解前后文冠果油組成成分Table 3 Components of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil before and after enzymatic hydrolysis %

    3 結(jié)論

    利用脂肪酶對(duì)文冠果油中芥酸進(jìn)行水解,在酶添加量為(質(zhì)量分?jǐn)?shù))5%、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、水油摩爾比為30∶1的優(yōu)化工藝條件下,文冠果油甘油三酯上芥酸含量從酶解前的8.04%降低酶解后到了4.86%,芥酸含量降低了約一半,達(dá)到了聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織的規(guī)定,同時(shí)神經(jīng)酸的含量保持在1%左右,后期通過(guò)脫除游離酸可得到合格的低芥酸文冠果油。實(shí)驗(yàn)初步證明了芥酸分布在文冠果油的Sn-1, 3位,固定化脂肪酶 TLIM 能定向水解文冠果油的芥酸,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為低芥酸文冠果油的開(kāi)發(fā)和工藝路線制定提供了可靠的支持。

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