鄂馬鈴薯3 號遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建與表達

高志鵬，杜玉蕭，馮 霞，余土元，李亞男，陳大清

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣州 510225；2.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；3.長江大學(xué)發(fā)展規(guī)劃處，湖北 荊州 434023）

硒（Se）是植物生長發(fā)育的重要營養(yǎng)元素［1］，其在人畜營養(yǎng)健康和環(huán)境保護中的重要性也受到了廣泛的關(guān)注。硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（SMT）參與催化甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）的合成，是植物硒代謝的中心環(huán)節(jié)［2］。甲基化作用避免硒摻入到蛋白質(zhì)中，從而顯著提高植物對硒的耐受性［3］。同時，硒的抗氧化性和抗癌特性也是一大研究熱點［4］，MeSe-Cys 的抗癌活性較強，能誘導(dǎo)癌細胞的凋亡，抑制血管腫瘤發(fā)生，阻止早期癌細胞的擴展，其應(yīng)用前景樂觀［5］。據(jù)報道硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因（SMT）在黃芪、西蘭花等植物中獲得了克?。?］。不同植物中的SMT序列存在較高的同源性，甲基化作為硒的主要代謝途徑，富硒植物具有高聚集甲基半胱氨酸的顯著特征。黃芪（Astragalus bisulcatus）幼芽中的硒也主要轉(zhuǎn)化成了 MeSeCys［7］。Neuhierl 等［8］基于聚硒植物中SMT 對SeCys 的偏好性，認為通過提高對SeCys 的甲基化能力可降低硒對蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合。在外源施加硒酸鹽的情況下，MeCys 的合成與MeSeCys 積累是相伴而存的，這說明二者的生物合成可能處于共同關(guān)聯(lián)的途徑上［9］。在過表達SMT的轉(zhuǎn)基因植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中研究發(fā)現(xiàn)此酶參與了MeSeCys 和MeCys 的合成，推測該酶在生物體外可以催化 SeCys 和 Cys 的甲基化［10］。擬南芥克隆的SMT序列與擬南芥中的硒代高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因（HTM）序列存在70%同源性［11］，推測二者催化甲基化機制上具有相似性。Nikiforova 等［12］通過對擬南芥中SMT基因進行過表達，增加了植株對硒的耐受性和聚集能力。印度芥菜（Brassica juncea）中的BjSMT也被驗證能夠增強植株對亞硒酸鈉耐受性以及促進葉片的硒轉(zhuǎn)化能力［13］。據(jù)測定轉(zhuǎn)基因植株的硒積累量較野生型高，尤其是亞硒酸鹽顯著高于野生型，表明通過超表達SMT調(diào)控植株的耐硒能力和硒積累是一個有潛在應(yīng)用價值的途徑［14］。在此基礎(chǔ)上通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中對SMT進行過表達，可以有效增強植物中硒的富集量［15］，為開發(fā)有效富硒農(nóng)產(chǎn)品提供了可能。近年來對于植物硒吸收、轉(zhuǎn)化以及代謝等分子機制研究取得了較大的進展，為研究植物的富硒機制提供了數(shù)據(jù)支持［16，17］。馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是有效的轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器［18］，又是糧蔬兼用作物，而關(guān)于以馬鈴薯為材料進行AbSMT基因的研究鮮有報道，因此本研究選擇馬鈴薯作為黃芪轉(zhuǎn)化硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（AbSMT）基因的受體植物，希望通過轉(zhuǎn)基因調(diào)節(jié)馬鈴薯的硒積累水平，提高植物源性的生物有機硒的補充來源，具有重要的社會經(jīng)濟意義［19］。通過運用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法構(gòu)建AbSMT基因轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株，為后續(xù)開展該物種的轉(zhuǎn)基因工作或通過基因編輯提高馬鈴薯有機硒含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 鄂馬鈴薯3 號脫毒試管苗由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室提供。

1.1.2 質(zhì)粒與菌種 大腸桿菌Top10，農(nóng)桿菌LBA4404，質(zhì)粒 pBI121，含有AbSMT基因序列的質(zhì)粒pBinAr，加利福尼亞大學(xué)伯克利分校Danika 教授惠贈。

1.1.3 試劑 X-Gluc（武漢明銳生物技術(shù)有限公司），DNA Marker、Taq 酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 連接酶、吲哚乙酸、奈乙酸、赤霉素、羧芐青霉素、卡那霉素、利福平（武漢天源生物有限公司）。

1.1.4 引物AbSMT基因擴增引物（上游：5′-GCTCTAGAATGTCGTCGCCATTGAT-3′；下游：5′-CGGGATCCTTACTAGTAGATTTGTTTGC-3′ ） PCR檢測引物（上游：5′-CTAACAGAACTCGCCGTAAA-3′；下游：5′-CGGGCAATCTCAACACTT-3′）。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)培養(yǎng)基的選擇 馬鈴薯外植體莖段移植到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。根據(jù)愈傷組織誘導(dǎo)情況，把誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)。直到分化出的再生植株長到2～3 cm 時，從愈傷組織上切下再生苗插入生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)。以上培養(yǎng)條件均為溫度18～22 ℃，光照度3 000 lx，每天光照16 h。每15 d繼代培養(yǎng)一次。愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)培養(yǎng)基為 MS 基本培養(yǎng)基附加植物激素（表1），pH 5.8，瓊脂1.5%，蔗糖3%。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)培養(yǎng)基配方

1.2.2 馬鈴薯外植體的擴繁及預(yù)培養(yǎng) 取一株帶有4～5 個莖節(jié)的脫毒試管苗，在無菌條件下切成單節(jié)莖段，轉(zhuǎn)接到裝有50 mL 固體培養(yǎng)基的150 mL 三角瓶中，在培養(yǎng)溫度25 ℃，光照度1 500 lx 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天光照16 h。待試管苗長至4～5 個莖節(jié)時，在同等條件下進行擴繁。將馬鈴薯莖段轉(zhuǎn)移到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。

1.2.3AbSMT基因的克隆及其表達載體的構(gòu)建 依據(jù)cDNA 全長序列設(shè)計引物：（分別帶有XbaⅠ和BamH Ⅰ酶切位點）以質(zhì)粒 pBinAr 中的AbSMT為模板進行 PCR 擴增。PCR 擴增體系為：2.0 μL 10×TaqBuffer，1.2 μL MgCl2，0.2 μL dNTP，0.8 μL TaqDN-ase，3.0 μL cDNA 模板，0.6 μL 引物（含上游引物和下游引物），加去離子水定容至20.0 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預(yù)變性4 min，進入循環(huán)：94 ℃變性1 min，58 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，進行30 個循環(huán)后，72 ℃保溫10 min。

另外，用XbaI 和BamH I 分別酶切質(zhì)粒pBI121和PCR 產(chǎn)物。分別回收純化酶切片段，用T4 連接酶進行連接并轉(zhuǎn)化至TOP10 感受態(tài)細胞中，在含有50 mg/L Kan 的LB 培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化菌落，挑取單菌落進行菌落PCR 鑒定。陽性克隆接種培養(yǎng)后于15%甘油保存，取1 mL 菌液置于1.5 mL 離心管中送上海生物工程有限公司測序，比對測序結(jié)構(gòu)從而準(zhǔn)確篩選出正確的克隆pBI121-AbSMT。其表達載體pBI121-AbSMT結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。

圖1 表達載體pBI121-AbSMT

1.2.4 根瘤農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備 挑取農(nóng)桿菌LBA4404 的單菌落接種于5 mL YEP 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，160～250 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。取2 mL 菌液轉(zhuǎn)入50 mL YEP液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm為0.3～0.5。轉(zhuǎn)入無菌離心管，冰浴10 min 隨后4 000 r/min離心10 min，去上清液，加入40 mL（50 mmol/L）CaCl2重懸菌液，離心10 min，去上清液。5 mL 預(yù)冷的50 mmol/L CaCl2懸浮細胞，冰浴備用。YEP 培養(yǎng)基成分如表2 所示。

表2 YEP 培養(yǎng)基成分

1.2.5 植物表達載體pBI121-AbSMT向農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定 取200 mL 感受態(tài)細胞，加入20 μL 構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，冰上放置10～20 min，液氮中速凍2 min，28 ℃水浴5 min，然后加入1 mL YEP 培養(yǎng)基，28 ℃慢速（＜200 r/min）振蕩培養(yǎng) 4 h；涂布于含有 50 mg/L Kan 和 100 mg/L Rif 的YEP 平板上，28 ℃培養(yǎng)約48 h。挑取YEP 平板上的單菌落，接種于含有50 mg/L Kan 和100 mg/L Rif YEP 液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；少量提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA 為模板進行PCR 擴增鑒定。

1.2.6 農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的確定及轉(zhuǎn)化 將無菌馬鈴薯莖段切成長約0.5 cm 大小，轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素依次為 20、30、50、75、100 mg/L 的 A2 培養(yǎng)基上篩選抗生素濃度。

篩選陽性克隆接種于50 mL YEP 液體培養(yǎng)液中（含有 50 mg/L Kan 和 100 mg/L Rif），28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為 0.6～0.8。轉(zhuǎn)移至 50 mL 離心管中，4 000 r/min 離心 10 min，收集菌體后，用 MS 液體培養(yǎng)基重懸菌體。再次離心收集菌體后，用MS液體培養(yǎng)基重懸菌體調(diào)整菌液濃度至OD600nm分別為0.3、0.5、0.7 進行菌液濃度探究，將預(yù)培養(yǎng)后的外植體分別置于上述濃度菌液中，室溫下緩慢搖動，使外植體與菌液充分接觸［20］。當(dāng)外植體在菌液中分別處理4、8、10 min 以確定最佳的農(nóng)桿菌侵染時間，分別取出外植體并用無菌水沖洗3 次，用高壓滅菌的濾紙吸去多余水分后轉(zhuǎn)移到愈傷組織培養(yǎng)基中。于28 ℃下分別于暗處共培養(yǎng)1、3、5 d 以確定最佳共培養(yǎng)時間，隨后將外植體轉(zhuǎn)接到愈傷組織培養(yǎng)基中進行選擇培養(yǎng)。

1.2.7 轉(zhuǎn)化馬鈴薯的繼代培養(yǎng)及PCR 檢測 外植體培養(yǎng)20～30 d 后，將其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，直到愈傷組織產(chǎn)生再生苗。將分化培養(yǎng)基中得到的再生苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，待生根后，于MS 培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)化苗的大量繁殖。挑選轉(zhuǎn)化苗，利用PCR 檢測引物進行PCR 檢測。培養(yǎng)基配方見表3。

表3 馬鈴薯培養(yǎng)基（1L）

1.2.8 轉(zhuǎn)化馬鈴薯的GUS 組織化學(xué)染色 將植物材料放在50%丙酮溶液中，在室溫下浸泡30 min。取出材料，用無菌水沖洗一次，然后用pH 7.0 的磷酸緩沖液沖洗3次。室溫下，在染色液中浸泡48 h。將浸染過的材料轉(zhuǎn)入70%乙醇中脫色，至陰性對照材料呈白色為止［21］，在實體鏡下觀察GUS基因表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)培養(yǎng)基的選擇

將馬鈴薯莖段分別培養(yǎng)在3 種不同的愈傷組織培養(yǎng)基中，15 d 后統(tǒng)計成愈率。結(jié)果顯示，3.00 mg/L的 6-BA 和0.08 mg/L 的 NAA 的組合能夠最大限度促進愈傷組織的形成（圖2），成愈率為96.25%（表4）。從圖3 可知，在此愈傷組織培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn) 6-BA 和 GA3 濃度分別為 1.00、3.00 mg/L 時，更有利于促進愈傷組織分化出不定芽，不定芽的發(fā)生頻率最高達38%（表5）。

表4 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對馬鈴薯愈傷組織成愈率的影響

表5 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對馬鈴薯愈傷組織分化率的影響

圖2 馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

圖3 馬鈴薯愈傷組織不定芽的誘導(dǎo)

2.2 AbSMT 基因表達載體的構(gòu)建及鑒定

以含有AbSMT目的基因的質(zhì)粒pBinAr 為模板，用帶有XbaI 和BamH I 酶切位點的定向克隆引物擴增得到基因兩端帶有酶切位點的AbSMT基因（圖4）。從LB 培養(yǎng)基中挑取單菌落進行菌落PCR 鑒定，PCR產(chǎn)物電泳可見大小約1 067 bp 的特異條帶（圖5），與預(yù)期大小一致。初步說明表達載體pBI121-AbSMT構(gòu)建成功。然后對菌落PCR 鑒定為陽性的單菌落進行搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用XbaI 和BamH I 雙酶切鑒定，電泳可見2 條大小約14 kb 和1 067 bp 的目的條帶（圖6），再一次證明pBI121-AbSMT構(gòu)建成功。把經(jīng)鑒定含有目的片斷的表達載體送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行DNA 序列測定。測定結(jié)果經(jīng)分子生物學(xué)軟件DNAMAN 分析，結(jié)果證實表達載體pBI121-AbSMT構(gòu)建成功。

圖4 AbSMT 基因 PCR 電泳結(jié)果

圖5 菌落PCR 電泳結(jié)果

圖6 pBI121-AbSMT 酶切電泳結(jié)果

2.3 根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化鑒定

選取經(jīng)測序確定的pBI121-AbSMT重組質(zhì)粒經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404 感受態(tài)細胞，從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，小量提取質(zhì)粒進行PCR 鑒定，PCR產(chǎn)物可見與表達載體pBI121-AbSMT擴增大小相同約為1 067 bp 的特異條帶（圖7），從而證明pBI121-AbSMT重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LB4404 中。

圖7 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌PCR 檢測

2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系確定

外植體莖段培養(yǎng)在含有50 mg/L 的Kan 的愈傷組織培養(yǎng)基中，前期生長緩慢，3～4 d 后，莖段中間變黑，但兩端有少量的愈傷組織，隨著愈傷組織的繼續(xù)生長，70%以上的莖段完全變黑，且生長趨勢下降，50 mg/L 的Kan 濃度可以作為外植體篩選的抗生素濃度。菌液濃度的大小因不同的植物具有差異性，試驗結(jié)果表明，農(nóng)桿菌菌液濃度為0.50（OD600nm），侵染時間為8 min時，芽的分化率最高，達37.5%（表6）。共培養(yǎng)1 d，農(nóng)桿菌感染和轉(zhuǎn)移不充分，細胞受抗生素的過早抑制，分化率僅為8%，共培養(yǎng)超過5 d，由于農(nóng)桿菌的大量生長，外植體被農(nóng)桿菌菌落覆蓋，難以控制污染，分化產(chǎn)生的抗性芽很難成活（表7）。因此，確定共培養(yǎng)時間為3 d。

表6 不同農(nóng)桿菌濃度和侵染時間對抗性芽分化率的影響

表7 共培養(yǎng)時間對芽分化的影響

2.5 轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株P(guān)CR 檢測

用CTAB 法提取轉(zhuǎn)化植株的DNA，以未轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株為陰性對照，陽性轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌為陽性對照，利用檢測引物進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化苗與陽性對照有相同的長度約800 bp 的條帶，證明成功構(gòu)建了AbSMT基因轉(zhuǎn)化的鄂馬鈴薯3 號（圖8），共篩選到了1 株陽性轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株（圖9）。

圖8 馬鈴薯抗性植株P(guān)CR 鑒定

2.6 GUS 組織化學(xué)染色檢測

經(jīng)過GUS 染色后，在陰性對照材料中沒有觀察到藍色斑點，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中可以觀察到清晰的藍色GUS 表達位點（圖10）。說明AbSMT基因成功轉(zhuǎn)化并且在植株中表達。

圖10 轉(zhuǎn)化植株與非轉(zhuǎn)化植株的GUS 組織化學(xué)染色比對分析

3 小結(jié)與討論

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯轉(zhuǎn)基因的方法已經(jīng)逐漸成熟，應(yīng)用很廣泛。在農(nóng)桿菌侵染過程中，農(nóng)桿菌在植物細胞表面的附著是實現(xiàn)T-DNA 轉(zhuǎn)移和整合的前提，因此控制農(nóng)桿菌的濃度及侵染時間是實現(xiàn)高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵［22］。濃度太高、侵染時間過長會使傷口褐化，軟腐增多，后繼培養(yǎng)中農(nóng)桿菌難以控制，轉(zhuǎn)化率下降。濃度太低、侵染時間過短將會達不到轉(zhuǎn)化的目的。共培養(yǎng)時間也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一，時間過短不能為目的基因轉(zhuǎn)移到植物細胞內(nèi)創(chuàng)造充分的機會，時間過長會增加產(chǎn)生假轉(zhuǎn)化體的機率［23］。上述因素以及具體的抗生素篩選濃度等也因不同的基因型、不同的外植體而異，必須通過試驗驗證，以達到最佳的轉(zhuǎn)化效果［24］。本研究分別對菌液濃度、侵染時間及共培養(yǎng)時間進行了試驗。試驗結(jié)果顯示，篩選抗生素是50.00 mg/L 的Kan；農(nóng)桿菌菌液濃度為0.50（OD600nm）；侵染時間為8 min；共培養(yǎng)時間為3 d，能夠?qū)崿F(xiàn)高效遺傳轉(zhuǎn)化，可為后續(xù)開展該物種轉(zhuǎn)基因試驗提供參考。

目前對于參與植物硒代謝相關(guān)酶類的研究較多，硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶又是植物緩解硒毒害的關(guān)鍵酶類［2-6］，然而有關(guān)SMT基因的研究在過去發(fā)展仍較緩慢。國內(nèi)近期以茶樹、毛薯為植物材料開展SMT基因功能及其表達量等研究居多［25］。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化研究中，薯塊無須脫分化可直接誘導(dǎo)再生，成為薯遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用較多的外植體［26］。本研究基于鄂馬鈴薯3 號遺傳轉(zhuǎn)化體系研究的基礎(chǔ)上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行AbSMT轉(zhuǎn)化馬鈴薯的研究。經(jīng)過PCR 鑒定和GUS 組織化學(xué)染色的初步鑒定分析，確認成功實現(xiàn)了AbSMT基因?qū)Χ躐R鈴薯3 號的遺傳轉(zhuǎn)化。通過GUS 組織化學(xué)染色分析，在轉(zhuǎn)化植株的葉片中觀察到了AbSMT基因的表達。為進一步研究AbSMT基因功能及其表達調(diào)控機制提供了試驗參考。此外，GUS基因瞬時表達受到共培養(yǎng)時間及農(nóng)桿菌菌株種類的影響，共培養(yǎng)時間不僅決定著遺傳轉(zhuǎn)化的效率，同時也影響GUS基因瞬時表達，二者呈現(xiàn)一定的負相關(guān)性，共培養(yǎng)時間越長對GUS基因表達越不利［27］。不同的農(nóng)桿菌菌株的感染毒力存在差異，LBA4404 菌株的感染毒力明顯低于 EHA101 菌株和 EHA105 菌株［28］。這可能是造成其他組織部位GUS基因表達異常的原因。