叢枝菌根真菌改善鎘脅迫下植物根系和土壤微環(huán)境的效應(yīng)

杜 紅，李玉鵬，程 文，肖榮英，胡 鵬

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 鄭州 451450； 2.南陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 小麥研究中心，河南 南陽(yáng) 473000； 3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 土壤肥料研究所，養(yǎng)分循環(huán)與資源環(huán)境安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031； 4.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000； 5.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微量元素研究中心，湖北 武漢 430070)

城市化進(jìn)程加快、工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)增加、農(nóng)藥化肥不合理使用，以及采礦廢水灌溉等問(wèn)題導(dǎo)致土壤重金屬含量顯著增加，對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展造成極大影響。重金屬Cd因污染面廣、持續(xù)期長(zhǎng)、降解率低等特性，在土壤重金屬污染領(lǐng)域備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，Cd污染不僅會(huì)引起土壤板結(jié)，影響N、P、K元素的保持和供應(yīng)，還會(huì)危害土壤酶活性和微生物環(huán)境平衡，顯著抑制植物根系生長(zhǎng)發(fā)育。試驗(yàn)表明，當(dāng)土壤中的Cd濃度為6 mg·kg時(shí)，對(duì)土壤真菌有顯著的刺激作用，但對(duì)細(xì)菌、放線菌、微生物總數(shù)則表現(xiàn)出抑制作用，且隨Cd濃度增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，土壤脫氫酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和過(guò)氧化氫酶活性相應(yīng)降低。何俊瑜等研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度Cd對(duì)水稻幼苗根系形態(tài)和根系活力的影響不盡相同：低濃度時(shí)，對(duì)水稻總根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根干重、根系活力無(wú)明顯影響；但在高濃度下，則表現(xiàn)出一定的抑制效應(yīng)。目前，關(guān)于Cd脅迫下植物光合生理變化、Cd富集吸收，以及植物耐受性等方面的研究較多，但涉及植物根系和土壤微生物環(huán)境等的研究還相對(duì)較少。

叢枝菌根真菌(AMF)是一類土壤有益微生物，能夠與植物協(xié)同建立共生關(guān)系，改善土壤條件，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，提高生物有機(jī)體抗性，加速建立健康的土壤生態(tài)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，接種摩西斗管囊霉()可使Cd脅迫下旱稻()根際土壤脲酶、蔗糖酶活性顯著提高(增幅9.6%～44.5%)，極大地促進(jìn)根際土壤碳、氮循環(huán)，并顯著提高旱稻根系生物量，但其效果隨鎘污染程度增加而顯著減弱。鎘脅迫下，向蘆葦()和狼尾草[((L.) Spreng.)]接種摩西斗管囊霉、根內(nèi)根孢囊霉()后，根系干質(zhì)量顯著增加，但上述AMF的侵染率隨鎘濃度增加而降低。廖繼佩等以玉米()為供試植物，發(fā)現(xiàn)不同濃度鎘處理下，接種光壁無(wú)梗囊霉()、蘇格蘭球囊霉()、木薯球囊霉()可顯著增加土壤中放線菌的數(shù)量，但隨Cd濃度增大，土壤中的放線菌數(shù)量變少，且接種上述AMF有利于提高土壤磷酸酶活性。

本研究以多年生黑麥草()為對(duì)象，探究Cd污染條件下接種AMF[變形球囊霉()]對(duì)黑麥草根系構(gòu)型、土壤酶活性，以及微生物群落等的影響，以期為利用AMF增強(qiáng)植物對(duì)重金屬Cd的抗性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料為多年生黑麥草品種卡特，種子購(gòu)自安徽良龍種業(yè)科技有限公司。黑麥草種子經(jīng)過(guò)氧化氫溶液浸泡10 min后，用無(wú)菌蒸餾水沖洗表面，消毒備用。

供試AMF菌種為變形球囊霉()，購(gòu)自叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(kù)。接種物為孢子、侵染根段、外生菌絲和培養(yǎng)基質(zhì)的混合物。

栽培基質(zhì)為壤土，基本理化性質(zhì)如下：pH值7.04，含鹽量0.12%，有效磷66.7 mg·kg，全氮89.4 mg·kg，速效鉀37.8 mg·kg，有機(jī)質(zhì)1.9%。風(fēng)干后，過(guò)1 cm篩，經(jīng)高壓蒸汽滅菌(120 ℃，2 h)后備用。

試驗(yàn)用的花盆(規(guī)格為25 cm×18 cm×18 cm)經(jīng)0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))高錳酸鉀溶液消毒1 h后使用。每盆裝3.5 kg栽培基質(zhì)(約至盆體積的2/3處)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

圍繞是否接種AMF(接種處理標(biāo)記為AMF，不接種處理標(biāo)記為NM)和Cd濃度開展雙因素試驗(yàn)，其中，Cd濃度分別設(shè)置為0、10、20、30 mg·kg，共計(jì)8個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，隨機(jī)排列。

不同濃度Cd處理，以CdCl溶液的形式添加到土壤，靜置7 d后測(cè)定土壤Cd濃度，以此重復(fù)，直到試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平。AMF的接種劑量為50 g(每1 g含80個(gè)孢子)，NM處理接種等量滅菌接種物。接種后，加入基質(zhì)覆蓋，灌水澆透。

將多年生黑麥草種子播于花盆，每盆播種50粒種子，覆膜保濕，放于人工氣候室(晝夜光照各12 h，晝夜溫度分別為25、18 ℃，平均相對(duì)濕度70%)內(nèi)培養(yǎng)。出苗后，每周澆水1次，5～10 d澆1次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(300 mL)，保持水分在70%左右。培養(yǎng)3個(gè)月后取樣，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

用米尺測(cè)定黑麥草根莖部到植株生長(zhǎng)點(diǎn)的距離作為株高。植株地上部分收獲后，用水洗凈、擦干，105 ℃殺青0.5 h，85 ℃烘至恒重，記錄其干重。

采集黑麥草幼嫩根系100 g，洗凈后剪成1 cm左右的根段，用FAA固定液[70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液、甲醛、冰醋酸按90∶5∶5的體積比混合]固定24 h。加入3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鉀溶液100 mL，90 ℃水浴15～30 min(至根系相對(duì)透明為止)。洗去堿液后，加入10%(體積分?jǐn)?shù))HO溶液漂白15 min，用蒸餾水清洗，加入0.2 mol·L鹽酸酸化1 h以上，用乳酸甘油染色法計(jì)算菌根侵染率。

稱取根尖0.5 g，采用氯化三苯基四氮唑系周圍(TTC)法測(cè)定根系活力。

采集根系周圍土壤樣本，帶回實(shí)驗(yàn)室后經(jīng)風(fēng)干、磨碎，過(guò)5 mm篩，混勻備用。采用稀釋平板法測(cè)定土壤樣本中真菌、細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，采用熏蒸浸提法測(cè)定土壤微生物生物量碳(SMBC)和土壤微生物生物量氮(SMBN)含量，采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定土壤過(guò)氧化氫酶活性，采用鄰苯三酚比色法測(cè)定土壤多酚氧化酶活性，采用磷酸苯二鈉法測(cè)定土壤酸性磷酸酶活性，采用TTC比色法測(cè)定土壤脫氫酶活性。采用Bradford法測(cè)定球囊霉素相關(guān)土壤蛋白[易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(EE-GRSP)、總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(T-GRSP)]含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和繪圖。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，對(duì)有顯著(<0.05)差異的，采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種AMF對(duì)Cd脅迫下黑麥草菌根侵染的影響

不同Cd濃度下，AMF均能跟黑麥草根系形成共生結(jié)構(gòu)(圖1)。不加Cd的條件下，AMF侵染率最高(53.0%)，菌根中孢子數(shù)量最多(15.3 cm)，隨Cd濃度增加，AMF侵染率和孢子數(shù)量顯著(<0.05)降低(表1)。當(dāng)Cd濃度為0～20 mg·kg時(shí)，接種AMF處理的黑麥草株高較不接種處理顯著(<0.05)增加；當(dāng)Cd濃度為0～20 mg·kg時(shí)，接種AMF處理的黑麥草地上部干重較不接種處理顯著(<0.05)增加。無(wú)論是否接種AMF，隨Cd濃度增加(0～30 mg·kg)，黑麥草的株高和地上部干重顯著(<0.05)下降。方差分析結(jié)果顯示：是否接種AMF和Cd濃度均對(duì)黑麥草株高和地上部干重有極顯著(<0.01)影響，但二者交互作用的影響并不顯著(>0.05)。

圖1 AMF侵染黑麥草根系情況(左圖展示菌絲+孢子結(jié)構(gòu)，右圖展示根內(nèi)菌絲)

表1 不同處理下AMF侵染與黑麥草生長(zhǎng)情況

2.2 接種AMF對(duì)Cd脅迫下黑麥草根系活力的影響

相同Cd濃度下，是否接種AMF對(duì)黑麥草根系活力無(wú)顯著影響(圖2)。同一接種處理下，隨Cd濃度增加，黑麥草根系活力顯著(<0.05)降低。方差分析結(jié)果顯示，是否接種AMF和Cd濃度均對(duì)黑麥草根系活力有極顯著(<0.01)影響，但二者交互作用的影響并不顯著(>0.05)。

柱上無(wú)相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3 接種AMF對(duì)Cd脅迫下黑麥草根系構(gòu)型的影響

相同Cd濃度下，接種AMF的處理較不接種顯著(<0.05)增加了黑麥草根系總長(zhǎng)度(除20 mg·kgCd濃度外)、根系總投影面積(表2)。同一接種處理下，隨Cd濃度增加，黑麥草根系總長(zhǎng)度、根系總投影面積、根系總體積、根尖數(shù)和根分叉數(shù)顯著(<0.05)下降。方差分析結(jié)果顯示：是否接種AMF和Cd濃度均對(duì)黑麥草根系總長(zhǎng)度、根系總投影面積、根系總體積、根尖數(shù)和根分叉數(shù)有極顯著(<0.01)影響，但二者交互作用的影響并不顯著(>0.05)。

表2 不同處理下黑麥草的根系構(gòu)型

2.4 接種AMF對(duì)Cd脅迫下土壤微生物群落組成的影響

相同Cd濃度下，接種AMF的處理較不接種顯著(<0.05)增加了土壤中細(xì)菌(除30 mg·kgCd濃度外)、真菌(除30 mg·kgCd濃度外)、放線菌(除20 mg·kgCd濃度外)的數(shù)量(表3)。同一接種處理下，隨Cd濃度增加，土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量呈顯著(<0.05)減少。不加Cd的條件下，接種AMF處理的土壤真菌、細(xì)菌與放線菌數(shù)量最大，分別為2.51×10g、3.10×10CFU·g和5.17×10g。方差分析結(jié)果顯示：是否接種AMF對(duì)土壤真菌、細(xì)菌、放線菌數(shù)量有極顯著(<0.01)影響；Cd濃度對(duì)土壤放線菌數(shù)量有極顯著(<0.01)影響，對(duì)細(xì)菌、真菌數(shù)量有顯著(<0.05)影響；二者交互作用對(duì)土壤真菌、細(xì)菌數(shù)量有極顯著(<0.01)影響，對(duì)放線菌數(shù)量無(wú)顯著(>0.05)影響。

表3 不同處理下土壤微生物群落組成

2.5 接種AMF對(duì)Cd脅迫下土壤微生物生物量碳、氮的影響

不同處理對(duì)土壤SMBC、SMBN的影響趨勢(shì)基本相同(圖3)。相同Cd濃度下，接種AMF的處理較不接種顯著(<0.05)增加了土壤SMBC含量(除30 mg·kgCd濃度外)，但對(duì)土壤SMBN含量無(wú)顯著影響。同一接種處理下，隨Cd濃度增加，土壤SMBC、SMBN含量顯著(<0.05)降低，說(shuō)明其對(duì)SMBC、SMBN的抑制作用逐漸增強(qiáng)。方差分析結(jié)果顯示：是否接種AMF和Cd濃度均對(duì)土壤SMBC、SMBN含量有極顯著(<0.01)影響，但二者交互作用的影響并不顯著(>0.05)。

圖3 不同處理下黑麥草根際土微生物生物量碳、氮含量

2.6 接種AMF對(duì)Cd脅迫下土壤酶活性的影響

相同Cd濃度(0～20 mg·kg)下，接種AMF的處理較不接種顯著(<0.05)增加了土壤中多酚氧化酶的活性；不加Cd時(shí)，接種AMF的處理較不接種顯著(<0.05)增加了土壤中過(guò)氧化氫酶的活性(表4)。同一接種處理下，隨Cd濃度增加，土壤中脫氫酶和過(guò)氧化氫酶的活性顯著(<0.05)增加，而酸性磷酸酶和多酚氧化酶的活性則顯著(<0.05)降低。方差分析結(jié)果顯示：是否接種AMF和Cd濃度均對(duì)土壤多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶、脫氫酶活性有極顯著(<0.01)影響，但二者交互作用的影響不顯著(>0.05)；Cd濃度對(duì)土壤酸性磷酸酶活性有極顯著(<0.01)影響，但是否接種AMF及其與Cd濃度的交互作用對(duì)土壤酸性磷酸酶活性的影響不顯著(>0.05)。

表4 不同處理下土壤酶活性

2.7 接種AMF對(duì)Cd脅迫下土壤中球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量的影響

相同Cd濃度下，接種AMF的處理較不接種顯著(<0.05)增加了土壤中EE-GRSP(除30 mg·kgCd濃度外)、T-GRSP含量(圖4)。接種AMF的處理中，隨Cd濃度增加，土壤中EE-GRSP和T-GRSP含量顯著(<0.05)降低；不接種處理中，不同Cd濃度處理的土壤中EE-GRSP和T-GRSP含量差異不顯著(>0.05)。方差分析結(jié)果顯示：是否接種AMF及其與Cd濃度的交互作用對(duì)土壤中EE-GRSP和T-GRSP含量有極顯著(<0.01)影響，但Cd濃度的影響不顯著(>0.05)。

圖4 不同處理下土壤中球囊霉素相關(guān)土壤蛋白含量

3 討論

AMF是土壤-微生物系統(tǒng)中寄主植物根系與微生物互利共生的結(jié)合體。據(jù)報(bào)道，AMF能與陸地生態(tài)系統(tǒng)中90%以上的維管植物建立共生關(guān)系，這種菌根共生體能夠幫助寄主植物提高其對(duì)重金屬的耐受力，從而減輕重金屬的毒害作用。研究發(fā)現(xiàn)，AMF能與花生形成良好的共生關(guān)系，Cd處理對(duì)其AMF侵染率無(wú)顯著影響，且接種AMF后花生地上部生物量平均增加13%，花生根系的長(zhǎng)度、根系表面積和根系體積也均顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，隨Cd濃度增加，黑麥草的AMF侵染率顯著降低，但接種AMF有助于促進(jìn)黑麥草的生長(zhǎng)，改善植物根系發(fā)育。這可能是因?yàn)?，AMF侵染植物根系表皮細(xì)胞后，促進(jìn)了表皮細(xì)胞壁的木質(zhì)化，進(jìn)而促進(jìn)寄主植物根系的發(fā)育和分枝，顯著改變宿主植物根系形態(tài)。張旭紅等發(fā)現(xiàn)，摩西斗管囊霉能夠促進(jìn)蠶豆()根系發(fā)育。本試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，接種AMF有助于增加黑麥草根系總長(zhǎng)度、根系總投影面積、根系總體積、根尖數(shù)和根分叉數(shù)，提高根系活力。

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，直接參與土壤系統(tǒng)的物質(zhì)、能量循環(huán)；因此，微生物(真菌、細(xì)菌、放線菌)數(shù)量常被用作土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，尤其是在重金屬污染土壤上。廖潔等研究報(bào)道，甘蔗盆栽條件下，Cd污染使土壤微生物數(shù)量發(fā)生顯著改變，高濃度時(shí)土壤中真菌、細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著下降。但也有研究發(fā)現(xiàn)，隨Cd濃度增加，稻田土壤細(xì)菌數(shù)量先增后減，而放線菌和真菌數(shù)量則一直減少。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下，黑麥草根系周圍土壤中真菌、細(xì)菌、放線菌數(shù)量都呈減少的趨勢(shì)。謝宏鑫等發(fā)現(xiàn)，西瓜接種AMF后，土壤中的細(xì)菌、放線菌數(shù)量顯著高于對(duì)照，而真菌數(shù)量顯著低于對(duì)照。本研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF后，黑麥草根系真菌、細(xì)菌、放線菌數(shù)量均顯著增加。土壤微生物的數(shù)量直接決定SMBC、SMBN含量。研究發(fā)現(xiàn)，SMBC、SMBN含量隨Cd濃度增加呈下降趨勢(shì)；另有研究顯示，低濃度重金屬對(duì)土壤SMBC、SMBN起刺激作用，但高濃度時(shí)則表現(xiàn)為抑制作用。本試驗(yàn)表明，Cd脅迫下土壤中的SMBC、SMBN含量都顯著降低，但接種AMF有助于SMBC、SMBN含量的提高。

在植物-微生物系統(tǒng)中，土壤酶活性受環(huán)境脅迫變化較大。高大翔等研究發(fā)現(xiàn)，Cd對(duì)土壤脲酶、脫氫酶活性具有顯著抑制作用，隨Cd濃度增加，這些酶的活性顯著降低。在本研究中，土壤多酚氧化酶和酸性磷酸酶活性隨Cd濃度增加表現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，與前述結(jié)果相似。

球囊霉素相關(guān)土壤蛋白是AMF侵染—繁殖—衰解周轉(zhuǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的一種抗性有機(jī)質(zhì)組分，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的潛在生態(tài)功能。AMF產(chǎn)生的球囊霉素相關(guān)土壤蛋白在土壤中周轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)，難分解，對(duì)土壤有機(jī)碳的累積或保存具有重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF的處理有助于提高土壤中EE-GRSP和T-GRSP的含量。

綜上，AMF能夠與黑麥草建立良好的共生關(guān)系，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，改善植物根系構(gòu)型，增加根系總長(zhǎng)度、根系總投影面積、根系總體積、根尖數(shù)和根分叉數(shù)，提高根系活力。此外，AMF能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較多的球囊霉素相關(guān)土壤蛋白，促進(jìn)土壤微生物生物量碳、氮的積累，提高土壤中過(guò)氧化氫酶和多酚氧化酶的活性，增加土壤微生物(真菌、細(xì)菌、放線菌)數(shù)量，提高對(duì)Cd脅迫的抗性。