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    黃連對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道內(nèi)嗜黏蛋白益生菌A.muciniphila菌及腸粘膜屏障的影響

    2022-06-01 19:42:23楊光勇喻良錦涂小華何亞敏游豐鋒何光志
    關(guān)鍵詞:潰瘍性結(jié)腸炎黃連

    楊光勇 喻良錦 涂小華 何亞敏 游豐鋒 何光志

    【摘 要】 目的:通過ERIC-PCR和半定量PCR技術(shù)檢測黃連對潰瘍性結(jié)腸炎(UC)小鼠腸道內(nèi)菌群及嗜黏蛋白益生菌(A.muciniphila)菌的變化對腸粘膜屏障的影響。方法:葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)制備UC小鼠模型,分別為空白對照組,模型組,美沙拉嗪組(65 mg/kg, tid),黃連組(0.3 g/kg, qd)。造模成功后給予相應(yīng)的藥物或蒸餾水,連續(xù)給藥10 d。實驗第18天,收集小鼠新鮮糞便,用糞便基因組DNA試劑盒提取DNA,設(shè)計用ERIC-PCR及A.muciniphila細(xì)菌基因特異性引物,用ERIC-PCR方法檢測糞便中菌群多樣性,半定量PCR以反映各組A.muciniphila細(xì)菌變化,病理切片HE染色檢測各組腸道組織變化。結(jié)果:ERIC-PCR結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組條帶數(shù)量沒有明顯減少,但是條帶位置變化較明顯,黃連組帶數(shù)量明顯減少,但相比美沙拉嗪組多,腸道菌群的多樣性提高;半定量PCR結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組條帶稍明顯,美沙拉嗪組稍暗,黃連組亮度明顯升高,即A.muciniphila豐度升高;病理組織切片結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組腸道組織隱窩和腺體的正常結(jié)構(gòu)被破壞,觀察發(fā)現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤到黏膜層,與模型組相比,美沙拉嗪組和黃連組的黏膜損傷程度小,腺體結(jié)構(gòu)破壞較輕,炎性細(xì)胞的數(shù)量和浸潤深度都顯著減少。結(jié)論:黃連可調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠腸道菌群組成,提高A.muciniphila菌群豐度,可改善UC模型小鼠炎癥。

    【關(guān)鍵詞】 黃連;潰瘍性結(jié)腸炎;ERIC-PCR;半定量PCR;嗜黏蛋白益生菌

    【中圖分類號】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A? 【文章編號】1007-8517(2022)05-0027-06

    基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(81760864);貴州省教育廳創(chuàng)新群體重大研究項目(黔教合KY字[2016]036);貴州中醫(yī)藥大學(xué)項目(黔科合平臺人才[2018]5766號-16);貴州省科技科學(xué)技術(shù)基金(黔科合基礎(chǔ)[2020]1Y392);貴州省教育廳青年科技人才成長項目(黔教合KY字[2017]173);貴州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(貴中醫(yī)大創(chuàng)合字[2019]57號);貴州中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)科研項目(貴中醫(yī)科院內(nèi)[2018]49號)。

    作者簡介:楊光勇(1988- ),男,碩士,實驗師,研究方向為中醫(yī)藥對腸道菌群及腸道免疫的影響。Email:768305874@qq.com

    通信作者:何光志(1977- ),男,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向為中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。E-mail: 39272454@qq.com

    Effect of Coptis Chinensis on Mucinophilic Probiotics A.muciniphila and Intestinal Mucosal

    Barrier in Mice With Ulcerative Colitis

    YANG Guangyong YU Liangjin TU Xiaohua HE Yamin YOU Fengfeng HE Guangzhi*

    Guizhou University of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550025,China

    Abstract:Objective ERIC-PCR and semi quantitative PCR were used to detect the effect of Coptis chinensis on intestinal flora and mucinophilic probiotics A.muciniphila in intesting mucosal barrier of ulcerative colitis(UC) mice.Methods UC mice models were induced by dextran sodium sulfate(DSS) and divided into blank control group, model group, mesalazine group(65 mg/kg, tid) and Coptis chinensis group(0.3 g/kg, qd). After successful modeling, corresponding drugs or distilled water were given for 10 days. On the 18th day of the experiment, fresh feces of mice were collected and DNA was extracted with fecal genomic DNA kit. ERIC-PCR and A.mucinipila gene specific primers were designed. ERIC-PCR was used to detect the bacterial diversity in feces. Semi quantitative PCR was used to reflect the changes of A.mucinipila bacteria in each group Organizational change.Results ERIC-PCR results showed that compared with the normal group, the number of bands in the model group was not significantly reduced, but the location of the bands was significantly changed. The number of bands in the Coptis chinensis group was significantly reduced, but compared with the mesalazine group, the diversity of intestinal flora was improved; the semi quantitative PCR results showed that compared with the normal group, the strip number of model group was slightly obvious, the mesalazine group was slightly dark, and the brightness of Coptis chinensis group was significantly increased which means the abundance of A.mucinipila increased. Pathological section esults showed that compared with the normal group, the normal structure of intestinal crypt and gland in the model group was destroyed, and a large number of inflammatory cells infiltrated into the mucosal layer. Compared with the model group, the degree of mucous membrane damage in mesalazine group and Coptis chinensis group was less, the damage of gland structure was lighter, the number and infiltration depth of inflammatory cells were significantly reduced Less.Conclusion Coptis chinensis can regulate the composition of intestinal flora in DSS induced UC model mice, increase the abundance of A.muciniphila flora, and improve the inflammation of UC model mice.3ABA55F6-DD74-4AC4-ABD5-C61A92410E3B

    Key words:Coptis Chinensis; Ulcerative Colitis; ERIC-PCR; Semi Quantitative PCR; Mucinophilic Probiotics

    潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC) 在中醫(yī)屬于中醫(yī)的“腸僻”“痢疾”“泄瀉”等范疇,是一種原因不明的慢性非特異性結(jié)腸炎性疾病,病變多從直腸開始,主要限于結(jié)腸的粘膜,呈持續(xù)性、彌漫性分布,病理表現(xiàn)主要為固有膜內(nèi)彌漫性急、慢性炎癥細(xì)胞浸潤,尤其是腸上皮細(xì)胞(Intestinal epithelial cells, IEC)間中性粒細(xì)胞浸潤及隱窩炎乃至隱窩膿腫。腸黏膜屏障損傷及由此造成的腸壁通透性增高是UC發(fā)病的始動因素和病情進(jìn)展的核心環(huán)節(jié)[1]。IEC是腸道黏膜屏障與抗原接觸的第一線,其屏障作用可抵擋致病菌、共生菌和食物抗原入侵,IEC損傷可致使腸道內(nèi)大量抗原與腸道免疫細(xì)胞接觸并使之激活,產(chǎn)生大量炎性因子,造成腸道組織損傷[2]。

    腸道微生物的群落組成和多樣性改變會影響腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),菌群失調(diào)會促進(jìn)結(jié)腸炎的發(fā)展[3]。腸道益生菌與腸道黏膜屏障的組成密切相關(guān),腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFA)以GPR43依賴的方式促進(jìn)腸上皮腸樣體產(chǎn)生RegIIIγ和β-防御素,通過該途徑調(diào)節(jié)IEC表達(dá)抗菌肽(AMP)和腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)[4]。腸道菌群失調(diào)與免疫功能異常直接影響著UC的演變[5],嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila,A.muciniphila)的代謝產(chǎn)物丙酸對機(jī)體有明確的免疫調(diào)節(jié)作用,在糖尿病、肥胖癥、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸癌等多種疾病中具有重要的作用[6]。

    黃連清熱燥濕,瀉火解毒是諸多治療潰瘍性結(jié)腸炎的方劑中的主要成分,黃連中的鹽酸小檗堿和黃連堿[7]等多種成分在治療潰瘍性結(jié)腸炎中也具有重要作用。筆者參與的前期研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯對大鼠腸道內(nèi)的A.muciniphila菌有促進(jìn)作用[8]。為進(jìn)一步研究黃連對其在UC小鼠中的影響,本研究通過與傳統(tǒng)藥物美沙拉嗪進(jìn)行對比實驗,用腸桿菌基因間重復(fù)一致序列聚合酶鏈反應(yīng)(ERIC-PCR)和半定量PCR對各組糞便樣本中的菌群結(jié)構(gòu)和特定益生菌A.muciniphila進(jìn)行檢測,綜合腸道組織病理切片的黏膜組織受損及恢復(fù)情況進(jìn)行分析,探究黃連對UC疾病中菌群失調(diào)下特定益生菌A.muciniphila對腸道組織粘膜屏障的影響。

    1 材料

    1.1 實驗動物 6周齡KM小鼠40只,雌雄各半,體重(20±2)g,購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,動物使用許可證號:SCXK(湘)2019-0014。

    1.2 試劑與藥品 右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS,批號:H02J9B62777,Sigma-Aldrich公司);中草藥黃連(北京同仁堂);美沙拉嗪(批號:17G27518L,莎爾福公司);糞便基因組DNA提取試劑盒(批號:S8114,TIANGEN公司);快捷型瓊脂糖DNA回收試劑盒Ⅱ型(北京百泰克生物公司);2×Taq PCR MasterMix、溶菌酶(北京天根生化科技有限公司)。

    2 方法

    2.1 藥物制備及給藥方法 根據(jù)參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學(xué)》按體表面積計算劑量來算,人和小鼠間體表面積折算的等效劑量比值為0.0026,換算所得:若70 kg體重人的臨床劑量為X mg/kg,20 g體重小鼠的劑量=X mg/kg×70 kg×0.0026/0.02 kg=9.1×X mg/kg,因美沙拉嗪成人UC治療每次口服用量已知0.5g,即(X mg/kg×70 kg)=500 mg,則不需要在計算時×70 kg,即500 mg×0.0026/0.02 kg=65 mg/kg,則小鼠1次給藥劑量按0.65 mg/10 g比值進(jìn)行換算,配制成6.5 mg/mL的藥液,按0.1 mL/10 g小鼠灌胃給藥體積,1天3次(tid)灌胃給藥;從北京同仁堂購入黃連,制備水煎藥。換成中藥黃連以克(g)為單位即是9.1×X g/kg。參考李國輝等[9-10]實驗研究,為避免對小鼠產(chǎn)生抑菌效果和腦神經(jīng)損傷,最終將給藥劑量定為0.3 g/kg。取3 g黃連,用100 mL去離子水泡20 min,水煎30 min左右,再補足去離子水至100 mL即為3×10-2g/mL濃度。給藥劑量0.3 g/kg即是3×10-3g/10 g,則一只體重20 g的小鼠給藥量為6×10-3g,即按3×10-2g/mL劑量取0.2 mL,一天一次(qd)灌胃給藥。

    2.2 分組及UC模型制備 小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、美沙拉嗪組(65 mg·kg-1)、黃連組(0.3g·kg-1),每組10只??瞻讓φ战M給予蒸餾水,參考李望等[11]、吳昊等[12]和胡仁偉等[13]探討總結(jié)的誘發(fā)小鼠較理想的UC模型的方法,用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)制備UC小鼠模型,各組采用灌胃3% DSS溶液連續(xù)7 d,誘導(dǎo)UC模型,第8天開始全部換成蒸餾水。造模成功后第1天開始灌胃給藥,除空白對照組與模型組給予蒸餾水外,其余各組按上述劑量給予相應(yīng)的藥物,連續(xù)給藥10 d。

    2.3 小鼠病活動指數(shù)評分(Disease activity index,DAI) 觀察及疾病活動度評估自造模之日起,每日觀察并記錄小鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食、飲水和活動度等一般情況,每日定時稱量小鼠體重,觀察糞便情況及便血狀態(tài),參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行疾病活動評分。評分依據(jù)為黏著在肛門的水樣便為稀便,不黏著于肛門的糊狀大便為半稀便,成型的糞便為正常便。計算方法為DAI=(體質(zhì)量+大便性狀分?jǐn)?shù)+隱血分?jǐn)?shù))/3。3ABA55F6-DD74-4AC4-ABD5-C61A92410E3B

    2.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)前期的研究[8],設(shè)計引物序列: ERIC-1:5-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3,ERIC-2: 5-AAGTAAGTGACT GGGGTGAGCG-3;根據(jù)秦倩倩[15]等的研究,合成A.muciniphila細(xì)菌基因特異性引物,上游引物:5-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3,下游引物:5-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3,基因全長:329 bp;由上海生工生物工程有限公司合成。

    2.5 各組樣品基因組模板制備 DNA實驗第18天,收集小鼠新鮮糞便,用糞便基因組DNA試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作,提取基因組DNA,用核酸濃度檢測儀測定提取的DNA模板的純度及濃度,確保DNA純度A260/A280 比值在1.8左右,濃度在200 ng/μL左右,均置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.6 ERIC-PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為: DNA 模板2 μL,10 μmol /L 上、下游引物各0.5 μL,2×Taq PCR MasterMix [0.1U Taq Polymerase/μL, 500 μmol dNTP each, 20 mmol Tris-HCl(pH值為8.3), 100 mmol KCl,3 mmol MgCl2]12.5 μL,ddH2O 補足至25 μL。反應(yīng)條件為: 95 ℃ 預(yù)變性 7 min;95 ℃ 變性 30 s,46 ℃ 退火 90 s,72 ℃ 延伸 3 min,共35個循環(huán);72 ℃ 延伸 5 min。

    2.7 A.muciniphila菌半定量PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)采用20 μL體系:模板2 μL,10 μmoL/L 上下游引物各0.3 μL,2×Taq PCR MasterMix 10 μL,去離子水補充體系至20 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,39個循環(huán),65 ℃ 延伸 10 min。

    2.8 條帶克隆測序與序列分析 選取A.muciniphila菌半定量PCR產(chǎn)物目的條帶,按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書回收DNA。收集菌體送上海生工生物有限公司測序,將測序結(jié)果與 GenBank 中已登錄的細(xì)菌 DNA 序列用 BLAST軟件進(jìn)行比對分析。

    2.9 腸道組織病理學(xué)檢測 組織置于10%福爾馬林溶液中放置24 h以上,將組織修正大小為1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm,放入包埋盒沖洗12 h,瀝干水后,分別置于無水乙醇100%、95%、90%,85%、80%、70%酒精1 h;二甲苯1、二甲苯2各30 min,置于左右蠟缸各一個小時,冰凍切片后,置于切片機(jī),將腸道組織切到5 μm厚,后進(jìn)行展片、鋪片,將裝有組織的載玻片放入烘干箱12 h,按照切片盒步驟依次對組織進(jìn)行HE染色,觀察切片結(jié)果。

    3 結(jié)果

    3.1 各組小鼠體質(zhì)量的變化 記錄各組小鼠造模開始后至治療期間每天的體質(zhì)量變化。對照組體質(zhì)量呈現(xiàn)上升趨勢;造模開始后各造模組小鼠從造模第3天起,體質(zhì)量下降較對照組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);治療開始后,各組小鼠體質(zhì)量有所回升,模型組小鼠停用DSS后開始自愈,但體質(zhì)量較黃連組和美拉沙秦組恢復(fù)緩慢。如圖1所示。

    3.2 DAI 評分結(jié)果 造模成功后模型組、美沙拉嗪組和黃連組小鼠均出現(xiàn)精神呆滯、行動緩慢、便血、體重下降,而空白對照組小鼠精神、活動度、飲食、毛發(fā)、大便、體重等一般情況均為正常。隨著藥物治療的進(jìn)行,美沙拉嗪組和黃連組的DAI較治療前均減輕(P<0.01),較模型組DAI有顯著下降(P<0.01),美沙拉嗪組和黃連組之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)無意義(P>0.01)。見表1。

    3.3 腸道菌群結(jié)構(gòu) ERIC-PCR結(jié)果 腸道菌群的多樣性,與正常組相比,模型組條帶數(shù)量沒有明顯減少,說明腸道菌群的多樣性沒有明顯變化, 但是條帶位置變化較明顯,說明菌群紊亂,但腸道菌群的豐度減少。美沙拉嗪組條帶數(shù)量明顯減少,提示菌群基因組DNA含量明顯減少,腸道菌群的多樣性抑制,黃連組條帶數(shù)量也明顯減少,但比美沙拉嗪組多。如圖2所示。

    3.4 A.muciniphila菌半定量PCR結(jié)果 半定量PCR亮度與正常組相比,模型組條帶稍明顯,提示A.muciniphila菌群豐度有所升高,美沙拉嗪組稍暗,提示菌群豐度有所降低黃連組亮度明顯升高,提示菌群豐度明顯升高。如圖3所示。

    3.5 條帶克隆測序與序列分析 克隆測序結(jié)果顯示與GenBank 中已登錄的細(xì)菌 DNA 序列(NR_042817.1)用 BLAST軟件進(jìn)行比對分析結(jié)果一致,屬于Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835 strain Muc 16S ribosomal RNA, partial sequence,基因全長329 bp。如圖4所示。

    3.6 HE染色及病理組織切片 正常組,鏡下可見結(jié)腸粘膜完整,光滑,腺體層次清楚、清晰可見,未見糜爛、潰瘍及中性粒細(xì)胞浸潤等(圖5-a);模型組,結(jié)腸粘膜廣泛潰瘍發(fā)生,組織充血、水腫明顯,粘膜上皮排列紊亂、破裂損傷,細(xì)胞核集聚、模糊且伴有細(xì)胞脫垂,腸絨毛缺損,組織內(nèi)見大量炎性細(xì)胞浸潤,以中性粒細(xì)胞為主(圖5-b);美沙拉嗪組(圖5-c)、黃連組(圖5-d),上皮細(xì)胞較整齊,黏膜潰瘍情況減輕,組織充血、水腫減輕,炎性充血細(xì)胞減少,細(xì)胞破裂減少。

    4 討論

    腸道菌群參與固有免疫和適應(yīng)性免疫,黏膜上皮組織屏障作用是黏膜局部固有免疫的重要機(jī)制,腸道黏膜表面存在的共生菌群通過競爭而阻止病原微生物黏附腸道黏膜及感染機(jī)體,可產(chǎn)生某些抗微生物物質(zhì)。如大腸桿菌產(chǎn)生大腸桿菌素等,有助于維持IEC穩(wěn)態(tài),并參與修復(fù)腸炎所致的黏膜損傷[2]。腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸是IEC的直接能量來源,例如,丙酸可通過G蛋白偶聯(lián)受體43腸道黏膜免疫系統(tǒng)起到調(diào)節(jié)作用;丁酸可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的外周活化,增加結(jié)腸中Treg細(xì)胞亞群數(shù)量,抑制促炎免疫細(xì)胞CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞活性[16]。因此,腸道微生態(tài)系統(tǒng)菌群失調(diào)是UC發(fā)生發(fā)展的重要原因之一,腸道細(xì)菌刺激樹突狀細(xì)胞(DC)分泌IL-23,激活Th-17細(xì)胞并分泌IL-17和其他細(xì)胞因子,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[2,17]。3ABA55F6-DD74-4AC4-ABD5-C61A92410E3B

    A.muciniphila菌在腸道的外黏液層中定植,腸道黏蛋白是其生存增殖的唯一碳源和氮源,A.muciniphila分解黏蛋白并刺激杯狀細(xì)胞合成黏蛋白達(dá)到動態(tài)平衡,從而維持黏液層的穩(wěn)定[15]。黏蛋白增多可促進(jìn)肥胖、糖尿病、心臟代謝疾病和輕度炎癥[13],A.muciniphila菌降解黏蛋白的特性使其成為維持腸道黏膜屏障的關(guān)鍵微生物[14]。在治療難治性慢性活動性潰瘍性結(jié)腸炎時,含有高豐富度的A.muciniphila糞便樣本似乎有利于進(jìn)行糞便菌群移植[18]。

    黃連清熱燥濕,瀉火解毒是諸多治療潰瘍性結(jié)腸炎的方劑中的主要成分,其中鹽酸小檗堿、黃連堿等多種成分在治療潰瘍性結(jié)腸炎中也具有重要作用[7]。體外試驗證明,黃連或小檗堿對溶血性鏈球菌、腦膜炎球菌、肺炎雙球菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌以及金黃色葡萄球菌皆有較強的抑菌作用,但其對潰瘍性結(jié)腸炎中的菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不明確。

    研究用ERIC-PCR和半定量PCR技術(shù)分析黃連對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型結(jié)腸段A.muciniphila細(xì)菌的定殖數(shù)量變化,綜合腸道組織病理切片觀察分析黃連對潰瘍性結(jié)腸炎腸粘膜屏障和機(jī)體炎癥反應(yīng)的影響。研究表明,A.muciniphila細(xì)菌在模型組小鼠腸道中有一定增殖情況,這與黏蛋白在結(jié)腸炎腸道中增加有關(guān)。美沙拉嗪對A.muciniphila細(xì)菌較弱的抑制作用,可能是因為治療炎癥的效果和本身的抑菌作用導(dǎo)致黏蛋白減少而導(dǎo)致其減少。黃連對DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠腸道中的A.muciniphila細(xì)菌有明顯促進(jìn)增殖的作用,因黃連本身具有的抑菌作用和抗炎效果,但可能抑制的菌群種類和數(shù)量不同,其具體促進(jìn)A.muciniphila菌增殖機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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    (收稿日期:2021-07-12 編輯:劉 斌)3ABA55F6-DD74-4AC4-ABD5-C61A92410E3B

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