基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬通路研究茯苓多糖對(duì)2型糖尿病小鼠腸道屏障功能損傷和炎癥反應(yīng)的影響*

敖 文， 徐在革， 白 楊， 劉惠雙

（鄭州市第七人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450006）

在過(guò)去的幾十年中，全球糖尿病的患病率持續(xù)增長(zhǎng)。糖尿病及其并發(fā)癥已成為重要的全球健康問(wèn)題。研究表明，2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者的腸道屏障結(jié)構(gòu)和功能受損［1-2］。腸道屏障功能障礙促進(jìn)病原體和毒素從管腔吸收，從而誘發(fā)腸道炎癥和高血糖惡化［3］，這些病理改變使糖尿病預(yù)后惡化。因此，糖尿病的預(yù)防和治療迫切需要修復(fù)腸道屏障結(jié)構(gòu)和功能的有效策略。

茯苓是一種藥用真菌，作為中藥使用已有兩千多年的歷史，中醫(yī)認(rèn)為它具有健脾作用，可用于治療脾虛、腹瀉、消化不良、黏膜炎等腸道疾病癥狀。藥理研究表明，多糖是茯苓中含量最多的物質(zhì)，具有廣泛的生物活性，包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗肝炎、抗糖尿病和抗出血熱作用［4］。動(dòng)物研究顯示，茯苓多糖（Poria cocospolysaccharide，PCP）可改善腸道黏膜的完整性，并調(diào)節(jié)腸道微生物群以減輕ob/ob小鼠的高血糖和高脂血癥［5］。然而，PCP是否能減輕T2DM誘導(dǎo)的腸道屏障功能損傷還未可知。

近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）-自噬通路與腸黏膜屏障功能損傷的致病機(jī)制息息相關(guān)［6］。各種生理和病理情況會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生改變，這種情況稱為ERS，在肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗和T2DM［7］以及炎性腸?。?］的發(fā)展中起著重要作用。自噬是一種分解代謝過(guò)程，通過(guò)溶酶體降解及回收受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。自噬在正常腸黏膜中活躍［9］；然而，過(guò)度自噬和受損的自噬參與了腸道炎癥［10］。ERS 可以刺激或抑制自噬［11］，ERS 誘導(dǎo)的自噬激活可導(dǎo)致嚴(yán)重?zé)齻竽c道屏障功能障礙［12］，而抑制ERS 減輕了燒傷誘導(dǎo)的自噬激活和腸道通透性增加［6］。這表明ERS-自噬通路在腸道屏障功能障礙中具有重要作用。因此，本項(xiàng)工作以T2DM 模型小鼠為研究對(duì)象，探究PCP 在T2DM 誘導(dǎo)的腸道屏障功能損傷中的作用及潛在機(jī)制，以期為T2DM 腸道屏障功能損傷的治療提供實(shí)驗(yàn)參考。

材料和方法

1 動(dòng)物

6 周齡雄性SPF 級(jí)C57BLKS/JLeprdb突變（db/db）小鼠（T2DM 模型）60 只和C57BLKS/JNju 小鼠12 只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證為SCXK（湘）2019-0004。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行喂養(yǎng)，保持12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，溫度（25±2）℃，濕度70%～75%，所有小鼠均可自由獲取食物和水。

2 主要試劑及儀器

PCP（經(jīng)HPLC 檢測(cè)，純度≥90%；四川省維克奇生物科技有限公司）；衣霉素（tunicamycin，Tm；ERS誘導(dǎo)劑；MedChemExpress）；熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-dextran；Sigma-Aldrich）；兔源閉合蛋白（occludin）、閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）、蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、p-PERK、轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）和C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）抗體購(gòu)自Thermo Scientific；真核生物翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）、p-eIF2α（Ser51）、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3A/B（microtubule-associated protein 1 light chain 3A/B，LC3A/B）、p62、beclin-1 和β-actin 抗體及HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Cell Signaling Technology。

Accu-Chek Active 型 血 糖 儀（Roche）；JEM-1400Plus透射電子顯微鏡（JEOL）。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物分組與干預(yù) 小鼠適應(yīng)14 d 后，禁食12 h，從尾靜脈收集血液，使用血糖儀檢查空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），F(xiàn)BG 高于11.1 mmol/L被認(rèn)為是高血糖狀態(tài)。將12 只C57BLKS/JNju 小鼠作為對(duì)照（control）組；將db/db小鼠分成5 組：模型（model）組、低劑量（6 mg/kg）PCP（low-dose PCP，PCP-L）組、高劑量（12 mg/kg）PCP 組（high-dose PCP，PCP-H）組［5］、Tm 組和PCP+Tm 組，每組12只。PCP-L組和PCP-H 組小鼠分別給予相應(yīng)劑量的PCP 灌胃；Tm 組小鼠腹腔注射1 mg/kg Tm［6］；PCP+Tm 組小鼠在給予12 mg/kg PCP 灌胃的同時(shí)腹腔注射1 mg/kg Tm；control 組和model 組小鼠只給予相同體積的生理鹽水，每天1次，持續(xù)8周。

3.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）和胰島素耐量試驗(yàn)（insulin tolerance test，ITT） 完成為期8 周的給藥方案后進(jìn)行OGTT和ITT。OGTT 中，動(dòng)物禁食16 h，按體重口服2 g/kg葡萄糖溶液；在口服葡萄糖之前及之后30、60、90 和120 min 測(cè)量血糖水平。3 d 后，進(jìn)行ITT：禁食4 h后，給小鼠腹腔注射胰島素（0.5 U/kg）；在注射胰島素之前及之后30、60、90和120 min測(cè)量血糖水平。

3.3 小鼠FBG 和空腹血清胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）水平檢測(cè) 給藥結(jié)束后，禁食12 h，尾部采血，血糖儀檢測(cè)小鼠FBG 水平；然后摘眼球取血，按常規(guī)步驟分離血清，ELISA 法檢測(cè)FINS水平；計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

3.4 FITC-dextran 灌胃檢測(cè)腸道通透性 給藥結(jié)束后，每組隨機(jī)選擇6只小鼠，將FITC-dextran用PBS溶解，以600 mg/kg 的劑量灌胃，4 h 后取血，分離血清，將血清用PBS（pH 7.2）以1∶10 稀釋，然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm。根據(jù)在PBS 中連續(xù)稀釋FITC-dextran 產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清FITC-dextran濃度。

3.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察小鼠腸組織病理學(xué)變化 取血完成后，在距回盲部5 cm 處環(huán)切回腸組織樣本。取部分腸組織，按常規(guī)步驟進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織病理學(xué)變化并進(jìn)行病理評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［13］：0 分，腸黏膜正常；1分，絨毛頂端上皮下間隙增寬，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；2分，絨毛上皮下間隙進(jìn)一步擴(kuò)大，絨毛頂尖端上皮抬高與固有層分離；3分，絨毛兩邊上皮成塊脫落，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；4分，上皮完全脫落，僅存固有層結(jié)構(gòu)；5分，黏膜固有層崩解，出現(xiàn)出血和潰瘍。

3.6 小鼠血清腸黏膜損傷標(biāo)志物和炎癥因子水平檢測(cè) 取小鼠血清，通過(guò)ELISA 分析血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、D-乳酸（D-lactic acid，DLA）、內(nèi)毒素（endotoxin，ET）、白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）水平。

3.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腸組織occludin 和ZO-1表達(dá) 取3.5 中石蠟包埋組織，切片；抗原修復(fù)后，用3%過(guò)氧化氫孵育10 min，與occludin 和ZO-1 抗體（1∶200）4℃孵育過(guò)夜，然后用生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG 孵育，DAB 顯色。光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選擇3 個(gè)視野，用Image-Pro Plus 6.0 計(jì)算平均光密度（average optical density，AOD）。

3.8 透射電鏡觀察小鼠腸組織自噬情況 取部分回腸組織，用2.5%戊二醛快速固定2 h；然后將樣品用2%四氧化鋨固定，梯度酒精中脫水，最后包埋在Epon 812 環(huán)氧樹(shù)脂中；使用超薄切片機(jī)切割樣品以獲得超薄切片（60～70 nm）；將切片用2%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛固定；在透射電鏡下拍照，經(jīng)計(jì)數(shù)獲得各個(gè)圖片中自噬小體的數(shù)量。

3.9 Western blot 檢測(cè)腸組織ERS-自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取部分腸組織，在RIPA 裂解液中勻漿；收集上清液，使用BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后取等量（30 μg）蛋白質(zhì)上樣，經(jīng)SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜；使用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜1 h，然后在4 ℃下與Ⅰ抗（PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、LC3A/B、beclin-1 和p62 抗體，1∶1 000稀釋；β-actin 抗體，1∶2 000 稀釋）孵育過(guò)夜；將膜與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的Ⅱ抗（1∶4 000 稀釋）在室溫下孵育1 h；最后，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒對(duì)印跡進(jìn)行可視化，以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組小鼠OGTT和ITT結(jié)果的比較

與control 組相比，model 組小鼠各時(shí)點(diǎn)的血糖水平和曲線下面積（area under curve，AUC）均顯著升高（P＜0.05）；與model組相比，Tm組小鼠各時(shí)點(diǎn)的血糖水平和AUC 顯著升高，而PCP-L 組和PCP-H 組血糖水平和AUC 顯著降低（P＜0.05）；與PCP-H 組相比，PCP+Tm 組血糖水平和AUC 顯著升高（P＜0.05）；與Tm 組相比，PCP+Tm 組血糖水平和AUC 顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2 各組小鼠FBG、FINS和HOMA-IR比較

與control 組相比，model 組小鼠FBG、FINS 和HOMA-IR 顯著升高（P＜0.05）；與model 組相比，Tm組小鼠FBG、FINS 和HOMA-IR 顯著升高，而PCP-L組和PCP-H 組小鼠FBG、FINS 和HOMA-IR 顯著降低（P＜0.05）；與PCP-H 組相比，PCP+Tm 組小鼠FBG、FINS 和HOMA-IR 顯著升高（P＜0.05）；與Tm 組相比，PCP+Tm組小鼠FBG、FINS和HOMA-IR顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠FBG、FINS和HOMA-IR的比較Table 1. Comparison of FBG，F(xiàn)INS and HOMA-IR in the mice of each group（Mean±SD. n=6）

3 各組小鼠腸道通透性的比較

與control 組［（6.73±1.15）mg/L］相比，model 組小鼠血清FITC-dextran 濃度［（13.49±1.72）mg/L］顯著升高（P＜0.05）；與model 組相比，Tm 組小鼠血清FITC-dextran 濃度［（16.59±1.81）mg/L］顯著升高，而PCP-L組［（10.37±1.6）mg/L］和PCP-H組［（9.80±1.45）mg/L］顯著降低（P＜0.05）；與PCP-H 組相比，PCP+Tm 組小鼠血清FITC-dextran 濃度顯著升高（P＜0.05）；與Tm 組相比，PCP+Tm 組小鼠血清FITC-dextran濃度［（12.82±1.56）mg/L］顯著降低（P＜0.05）。

4 各組小鼠腸組織病理學(xué)變化

HE 染色結(jié)果顯示，control 組小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞層完整，腸絨毛清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)明顯病理?yè)p傷；model組小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)紊亂，絨毛兩邊上皮成塊脫落，并伴有固有層暴露、壞死和大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與control 組相比，model 組小鼠腸組織損傷評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與model組相比，Tm組小鼠腸組織損傷加重，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加，腸組織損傷評(píng)分顯著升高（P＜0.05），而PCP-L 組和PCP-H 組小鼠小腸絨毛水腫、脫落情況明顯減輕，固有層可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腸組織損傷評(píng)分顯著降低（P＜0.05）；PCP+Tm組小鼠腸組織損傷較PCP-H 組加重，腸組織損傷評(píng)分較PCP-H 組顯著升高（P＜0.05）；而與Tm 組相比，PCP+Tm 組小鼠腸組織損傷明顯減輕，腸組織損傷評(píng)分顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 2. The morphological changes of mouse intestine in each group（HE staining，scale bar=200 μm）. The black arrow indicates the shedding of intestinal villous epithelium，while black pentagram indicates inflammatory cell infiltration in lamina propria.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs PCP-H group；▲P＜0.05 vs Tm group.圖2 各組小鼠腸組織形態(tài)學(xué)改變

5 各組小鼠血清DAO、D-LA和ET水平比較

與control 組相比，model 組小鼠血清DAO、D-LA和ET 水平顯著升高（P＜0.05）；與model 組相比，Tm組血清DAO、D-LA 和ET 水平顯著升高，而PCP-L 組和PCP-H 組血清DAO、D-LA 和ET 水平顯著降低（P＜0.05）；與PCP-H 組相比，PCP+Tm 組血清DAO、D-LA和ET 水平顯著升高（P＜0.05）；與Tm 組相比，PCP+Tm 組 血 清DAO、D-LA 和ET 水 平 顯 著 降 低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清DAO、D-LA和ET水平比較Table 2. Comparison of serum DAO，D-LA and ET levels of the mice in each group（Mean±SD. n=6）

6 各組小鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平比較

與control 組相比，model 組血清IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05）；與model 組相比，Tm組 血 清IL-6、TNF-α 和IL-1β 水 平 顯 著 升 高（P＜0.05），而PCP-L 組和PCP-H 組血清IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05）；與PCP-H 組相比，PCP+Tm 組血清IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05）；與Tm 組相比，PCP+Tm 組血清IL-6、TNFα和IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平比較Table 3. Comparison of serum IL-6，TNF-α and IL-1β levels of the mice in each group（ng/L. Mean±SD. n=6）

7 各組小鼠腸組織occludin和ZO-1表達(dá)比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與control 組相比，model 組腸組織occludin 和ZO-1 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與model 組相比，Tm 組occludin 和ZO-1 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而PCP-L 組和PCP-H 組occludin和ZO-1 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與PCP-H 組相比，PCP+Tm 組occludin 和ZO-1 表 達(dá) 顯 著 降 低（P＜0.05）；與Tm 組相比，PCP+Tm 組occludin 和ZO-1 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

8 各組小鼠腸組織自噬情況比較

透射電鏡結(jié)果顯示，control 組在腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平未觀察到明顯的自噬形態(tài)學(xué)跡象；相比之下，model組可觀察到類似于自噬小體的雙膜結(jié)構(gòu)的存在；與model組相比，Tm 組小鼠腸上皮細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），而PCP-L 組和PCP-H 組小鼠自噬小體數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與PCP-H 組相比，PCP+Tm 組小鼠自噬小體數(shù)量顯著增加（P＜0.05）；與Tm 組相比，PCP+Tm 組小鼠自噬小體數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

9 各組小鼠腸組織ERS-自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與control 組相比，model 組小鼠腸組織p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、LC3-II/LC3-I、ATF4、CHOP 和beclin-1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），p62 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與model組相比，Tm組小鼠腸組織p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、LC3-II/LC3-I、ATF4、CHOP 和beclin-1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），p62蛋白水平顯著降低（P＜0.05），而PCP-L 組和PCP-H組小鼠腸組織p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、LC3-II/LC3-I、ATF4、CHOP 和beclin-1 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），p62蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與PCPH 組相比，PCP+Tm 組小鼠p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、LC3-II/LC3-I、ATF4、CHOP 和beclin-1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），p62 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與Tm 組 相 比，PCP+Tm 組 小 鼠p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、LC3-II/LC3-I、ATF4、CHOP 和beclin-1 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），p62 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

討論

腸道屏障結(jié)構(gòu)和功能受損是T2DM 的重要致病過(guò)程［14］。Yuan 等［1］的研究顯示血糖控制不佳與更多的糖尿病慢性并發(fā)癥及更差的腸道屏障功能有關(guān)；Shen 等［2］觀察到不能維持穩(wěn)定血糖水平的T2DM 患者發(fā)生腸黏膜屏障損傷的風(fēng)險(xiǎn)較高；動(dòng)物研究也顯示，在T2DM 早期，高脂飲食攝入可損害腸上皮細(xì)胞中的緊密連接（tight junction，TJ）結(jié)構(gòu)，改變上皮屏障功能［15］。以上研究表明，腸黏膜屏障損傷參與了T2DM 的發(fā)生發(fā)展，它也因此成為降糖藥物的潛在作用靶點(diǎn)。

Figure 3. Expression of occludin and ZO-1 in intestinal tissues of the mice in each group（immunohistochemical staining，scale bar=50 μm）. Brown yellow or brown indicates positive expression. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs PCP-H group；▲P＜0.05 vs Tm group.圖3 各組小鼠腸組織occludin和ZO-1表達(dá)

PCP 是茯苓中的主要生物活性成分。據(jù)報(bào)道，PCP 可減輕急性胰腺炎大鼠腸道屏障功能損傷和炎癥反應(yīng)［16］，并可降低ob/ob小鼠血糖水平，改善腸道黏膜的完整性［5］，說(shuō)明PCP具有降血糖和腸道保護(hù)作用。TJ 是腸道屏障的重要組成部分。作為TJ 的重要結(jié)構(gòu)蛋白，ZO-1 和occludin 的異常表達(dá)可能阻礙細(xì)胞間TJ 的形成并損害腸道機(jī)械屏障，使病原體和細(xì)菌毒素進(jìn)入血液并導(dǎo)致系統(tǒng)并發(fā)癥，如腸道感染、全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官衰竭［17］。血清ET、DLA 和DAO 是腸道屏障功能受損的標(biāo)志物，當(dāng)腸道屏障功能損害時(shí)，腸道內(nèi)ET、DAO 和D-LA 大量釋放入血［18］。本研究結(jié)果顯示，模型小鼠血清FITC-dextran濃度，腸道屏障功能損傷標(biāo)志物ET、DAO 和D-LA，以及促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平升高，而ZO-1 和occludin 表達(dá)降低，與以往的研究結(jié)果一致，表明模型小鼠腸道屏障功能受損。而給予PCP干預(yù)后，小鼠血糖水平顯著降低，胰島素抵抗顯著減輕，且血清腸道屏障功能損傷標(biāo)志物和促炎細(xì)胞因子水平降低，同時(shí)ZO-1 和occludin 表達(dá)升高。這提示，PCP 可減輕T2DM 小鼠的腸黏膜損傷和炎癥反應(yīng)，改善腸道屏障功能。然而，其發(fā)揮作用的分子機(jī)制并不明確。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積累，稱為ERS。ERS 激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），從而解決蛋白質(zhì)折疊缺陷并恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)；但當(dāng)應(yīng)激持續(xù)時(shí)會(huì)激活下游的細(xì)胞凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［19］。研究表明，過(guò)度的ERS 和受損的UPR 信號(hào)可通過(guò)誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡和腸道促炎反應(yīng)引起炎性腸病，導(dǎo)致腸道屏障功能障礙。PERK 屬于eIF2α 家族，在正常生理情況下，其表現(xiàn)為活性抑制，而當(dāng)ERS 錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白增多時(shí)被激活，活化的PERK 可磷酸化eIF2α 的第51 位Ser 位點(diǎn)，進(jìn)而刺激下游信號(hào)的激活，導(dǎo)致蛋白翻譯水平下降，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，包括指導(dǎo)自噬基因轉(zhuǎn)錄程序，以響應(yīng)ERS［20］；PERK 可以阻斷大部分蛋白質(zhì)的翻譯，但并非抑制了所有蛋白質(zhì)的合成，而是上調(diào)ATF4 的表達(dá)［21］。ATF4 可通過(guò)與CHOP 的5'-非翻譯區(qū)相互作用來(lái)激活CHOP；在ERS過(guò)程中，CHOP 可以反過(guò)來(lái)激活下游靶標(biāo)，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞死亡［22］。據(jù)報(bào)道，T2DM 患者胰腺β 細(xì)胞中存在ERS，β 細(xì)胞對(duì)過(guò)度的ERS 和失調(diào)的eIF2α 磷酸化敏感［23］；ERS 標(biāo)志物CHOP、PERK 和eIF2α 的磷酸化在糖尿病小鼠中均增強(qiáng)，抑制ERS的PERK-CHOP通路可減輕T2DM［24］和重癥急性胰腺炎大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡［25］。本研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致，表現(xiàn)為模型小鼠腸組織PERK 和eIF2α 的磷酸化水平以及ATF4和CHOP蛋白水平顯著高于正常小鼠，且Tm誘導(dǎo)ERS，進(jìn)一步增加了腸道通透性，以及TJ蛋白減少，加劇了腸道屏障功能損傷。這表明ERS 是參與T2DM 腸道屏障功能損傷的重要機(jī)制。而PCP 可下調(diào)ERS標(biāo)志物水平，抑制ERS。

Figure 4. Ultrastructure of intestinal epithelial cells of the mice in each group（transmission electron microscopy，scale bar=1 μm）.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs PCP-H group；▲P＜0.05 vs Tm group.圖4 各組小鼠腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解途徑，也是ERS 期間必不可少的保護(hù)機(jī)制，這兩個(gè)系統(tǒng)是動(dòng)態(tài)互連的［26］。然而，報(bào)道稱，ERS 和自噬之間的相互作用在腸上皮內(nèi)表現(xiàn)出協(xié)同作用［27］；Kong 等［28］的研究顯示糖尿病小鼠ERS 的過(guò)度激活伴隨著自噬水平升高，如自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II 和beclin-1 表達(dá)上調(diào)，p62 水平下調(diào)。Huang 等［6］的研究也顯示，在嚴(yán)重?zé)齻∈笾?，Tm 誘導(dǎo)ERS 加劇了燒傷誘導(dǎo)的自噬激活，腸道通透性增加以及TJ蛋白減少和重組；相比之下，用4-苯基丁酸抑制ERS 減輕了燒傷誘導(dǎo)的自噬激活、腸道通透性增加以及TJ 蛋白的減少和重組；表明ERS 可誘導(dǎo)自噬激活，加劇腸道損傷。與以往的研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示PCP 可減少T2DM 小鼠腸組織中自噬小體的數(shù)量，顯著降低LC3-II/LC3-I 比值和beclin-1蛋白水平，并上調(diào)p62 蛋白水平；且在PCP 干預(yù)的基礎(chǔ)上，使用Tm 可顯著激活自噬，減弱PCP 對(duì)T2DM小鼠腸道屏障功能的保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)表明，PCP可能通過(guò)抑制ERS 引起的自噬激活，減輕T2DM 小鼠腸黏膜損傷和炎癥反應(yīng)，改善腸道屏障功能。

綜上所述，PCP 可減輕T2DM 小鼠腸黏膜損傷和炎癥反應(yīng)，改善腸道屏障功能，其作用機(jī)制可能與抑制ERS引起的自噬激活有關(guān)。

Figure 5. Expression of ERS-autophagy pathway-related proteins in intestinal tissues of the mice in each group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs PCP-H group；▲P＜0.05 vs Tm group.圖5 各組小鼠腸組織ERS-自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá)