三種方法建立外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的兔模型研究*

陳 潔， 吳靈丹， 王資懿， 徐柒華

（南昌大學(xué)附屬眼科醫(yī)院，江西 南昌 330000）

外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（traumatic proliferative vitreoretinopathy，TPVR）是開放性眼外傷的一種常見的并發(fā)癥，其本質(zhì)是過度的眼內(nèi)創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)，在視網(wǎng)膜前后形成具有收縮能力的纖維膜，最終牽拉視網(wǎng)膜造成視網(wǎng)膜脫離［1］。有研究顯示，增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy，PVR）的發(fā)生與多種細(xì)胞因子有關(guān)，其中血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）與PVR 的發(fā)生密切相關(guān)［2-3］。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）中含有大量的血小板，血小板可以分泌多種細(xì)胞因子，比如PDGF 和TGF 等，這些因子可以促進細(xì)胞增殖和纖維形成，同時促進纖維向視網(wǎng)膜黏附，形成PVR模型。此外，視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）被認(rèn)為在PVR 病理生理過程中起著關(guān)鍵作用［4］。本實驗旨在觀察玻璃體腔內(nèi)注射PRP、RPE 以及TGF-β2在建立TPVR的兔模型的效果。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物及分組 清潔級健康青紫藍(lán)兔24只，共48 只眼，雌雄各半，6～8 周齡，體重2.0～2.5 kg，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK（湘）2019-0015，均排除眼部疾病，所有操作對動物雙眼進行。將動物隨機分為4組，每組6只動物，12 只眼：實驗組3 組，分別為PRP 組（玻璃體腔內(nèi)注射0.3 mL PRP）、TGF-β2組［玻璃體腔內(nèi)注射0.3 mL TGF-β2（50 μg/L）［5］］和RPE 組［玻璃體腔內(nèi)注射0.3 mL RPE 細(xì)胞（1.5×109/L）［6］］，以及對照組（玻璃體腔內(nèi)注射0.3 mL生理鹽水）。

1.2 實驗材料和儀器 RPE 細(xì)胞（上海鈺博生物科技公司）；TGF-β2［批號：081701-1，派普泰克生物科技（蘇州）有限公司］；鹽酸丙美卡因滴眼液（愛爾康有限公司）；加替沙星眼用凝膠（沈陽興齊眼藥股份有限公司）；左氧氟沙星滴眼液（萬漢制藥有限公司）；氟米龍滴眼液（參天制藥有限公司）；蛋白酶抑制劑（士德生物工程有限公司）；PBS（HyClone）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；SDS 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；蛋白酶抑制劑混合物（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體［西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］；GAPDH 抗體（諾倫生物科技有限公司）；Goat Anti-Rabbit IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；PVDF膜（Promega）；ECL 免疫印跡（Western blot）檢測試劑盒（Advansta）；眼球固定液（G1109，Servicebio）；眼底照相機［尼德克醫(yī)療器械貿(mào)易（上海）有限公司］；眼部B超機（Aviso）。

1.3 制備PRP 以注射器抽取兔耳動脈血5 mL，用含3.8%枸櫞酸鈉的玻璃離心管收集兔血（血與枸櫞酸鈉體積比為9∶1），輕輕搖動混勻；室溫、211×g離心10 min；取上1/3 之上清液，進行血小板計數(shù)，獲得的血小板密度為（1.9～2.8）×1011/L。

2 TPVR動物模型的制作

術(shù)前3 d，每只待手術(shù)的兔眼每天滴左氧氟沙星滴眼液4 次。術(shù)前用鹽酸丙美卡因滴眼液對兔子進行表面麻醉。然后按以下步驟制備模型：開瞼器開瞼，聚維酮碘注射液沖洗術(shù)眼結(jié)膜囊，于顳上方角膜緣后5 mm 處，采用15°刀刺向玻璃體中心部，造成鞏膜穿通傷，傷口長約3 mm，隨后于角鞏緣后3 mm 向各組玻璃體腔內(nèi)注射相應(yīng)藥物。術(shù)畢結(jié)膜囊內(nèi)涂加替沙星眼膏。術(shù)后1周內(nèi)，每日4次給予術(shù)眼左氧氟沙星滴眼液及氟米龍滴眼液預(yù)防感染及抗炎。

3 臨床觀察

3.1 術(shù)后觀察和PVR 分級 術(shù)后1、14、21 和28 d，術(shù)眼復(fù)方托吡卡胺散瞳后，用眼底照相和眼部B 超觀察，記錄各組兔眼玻璃體和視網(wǎng)膜改變并進行PVR分級（采用Fastenberg分級［7］，見表1）。

表1 Fastenberg分級Table 1. The Fastenberg classification

3.2 Western blot 檢測玻璃體腔中α-SMA 的含量術(shù)后第28天，分別在各組中隨機抽取3只動物，于角膜緣后4 mm處從不同的鐘點位用7號針頭從玻璃體腔內(nèi)抽取玻璃體液0.5 mL，分別加入蛋白酶抑制劑135×g離心15 min 后，收集上清裂解液用于BCA 蛋白檢測。等量的蛋白質(zhì)在10%SDS-PAGE 凝膠上加載并分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶在TBST 中室溫封膜1 h，并與Ⅰ抗（α-SMA 和GAPDH抗體）在4 ℃孵育過夜；TBST 漂洗4 次，每次10 min；與Ⅱ抗在室溫下孵育1 h；TBST 漂洗4 次，每次10 min；滴加ECL 發(fā)光液，用成像系統(tǒng)顯影。使用成像軟件（ImageJ）確定每個檢測波段的綜合強度，至少重復(fù)3次。

3.3 眼球的固定與切片 術(shù)后第28 天，實驗組及對照組動物過量麻醉處死后，立即摘除眼球，分離干凈后立即置于FSA 眼球固定液中3 d，梯度蔗糖溶液脫水，OCT 包埋冰凍切片，常規(guī)HE 染色、顯微鏡觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。PVR分級采用等級資料的秩和檢驗；蛋白表達(dá)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），用最小顯著性差異法（LSD 法）進行事后檢驗來確定組間差異。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組玻璃體及視網(wǎng)膜改變結(jié)果

通過眼部B超及眼底照相檢查造模術(shù)后第28天各組兔眼，可觀察到：PRP 組玻璃體混濁伴視網(wǎng)膜漏斗狀脫離；TGF-β2組玻璃體渾濁，視網(wǎng)膜增生條索收縮，可見髓線扭曲抬高，視網(wǎng)膜脫離；RPE 組玻璃體混濁伴淺層視網(wǎng)膜脫離；對照組玻璃體輕度混濁，視網(wǎng)膜未脫離，見圖1、2。

Figure 1. Fundus photography results on day 28 after traumatic proliferative vitreoretinopathy modeling. A：fundus photography showed vitreous opacities and retinal detachment in PRP group；B：fundus photography showed shrinkage of vitreoretinal proliferative cords，visible distortion and elevation of the medullary line，and retinal detachment in TGF-β2 group；C：fundus photography showed localized retinal detachment in RPE group；D：fundus photography showed localized traction in the vitreous body of control group，without significant retinal detachment.圖1 外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變模型術(shù)后28 d眼底照相結(jié)果

Figure 2. Ultrasound results of rabbit eyes on day 28 after traumatic proliferative vitreoretinopathy modeling. A: ultrasound showed vitreous opacity with retinal funnel detachment in PRP group；B and C:ultrasound showed vitreous opacity with superficial retinal detachment in TGF-β2 group and RPE group；D:ultrasound showed mild vitreous opacity and no retinal detachment in control group.圖2 外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變模型術(shù)后28 d眼底B超結(jié)果

2 各組PVR分級與平均級別比較結(jié)果

根據(jù)造模后第7、14 和28 天眼底檢查情況，將各組實驗動物依據(jù)Fastenberg 分級。在造模后第7 天，PRP 組0 級 有5 只 眼，1 級 有6 只 眼，2 級 有1 只 眼，TGF-β2組0級有7只眼，1級有5只眼，RPE組0級有6只眼，1 級有5 只眼，2 級有1 只眼，對照組0 級12 只眼；3 組實驗組玻璃體混濁發(fā)生率與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組術(shù)后第7天PVR分級與平均級別情況統(tǒng)計Table 2. PVR grade and average grade statistics of each group on the 7th postoperative day（n=12）

在造模后第14 天，PRP 組0 級有2 只眼，1 級有4只眼，2 級有5 只眼，3 級有1 只眼，TGF-β2組0 級有4只眼，1 級有4 只眼，2 級有2 只眼，RPE 組0 級有3 只眼，1級有5只眼，2級有3只眼，3級有1只眼，對照組0 級10 只眼，1 級2 只眼；3 組實驗組玻璃體混濁發(fā)生率與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組術(shù)后第14天PVR分級與平均級別情況統(tǒng)計Table 3. PVR grade and average grade statistics of each group on the 14th postoperative day（n=12）

在造模后第28 天，PRP 組2 級有2 只眼，3 級有3只眼，4 級有4 只眼，5 級有3 只眼，TGF-β2組0 級有1只眼，1 級有3 只眼，2 級有3 只眼，3 級有2 只眼，4 級有2 只眼，5 級有1 只眼，RPE 組0 級有1 只眼，1 級有2 只眼，2 級有3 只眼，3 級有3 只眼，4 級有2 只眼，5級有1 只眼，D 組0 級12 只眼；，3 組實驗組玻璃體混濁發(fā)生率與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PRP 組與TGF-β2組和RPE 組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組術(shù)后第28天PVR分級與平均級別情況統(tǒng)計Table 4. PVR grade and average grade statistics of each group on the 28th postoperative day（n=12）

3 玻璃體腔中α-SMA蛋白檢測結(jié)果

術(shù)后第28 天各組間玻璃體腔中α-SMA 蛋白表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=205.174，P＜0.05）；組間兩兩比較顯示，PRP 組、TGF-β2組和RPE 組玻璃體中的α-SMA 蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組（P＜0.05），見圖3。

4 視網(wǎng)膜組織HE染色檢查結(jié)果

術(shù)后第28 天，可見PRP 組與TGF-β2組視網(wǎng)膜各層排列紊亂，嚴(yán)重扭曲或局部斷裂，各層結(jié)構(gòu)不清晰，內(nèi)界膜斷裂，視網(wǎng)膜色素上皮層與神經(jīng)上皮細(xì)胞分離明顯；RPE 組視網(wǎng)膜各層排列扭曲，視網(wǎng)膜前可見增殖膜，牽拉視網(wǎng)膜；對照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列尚整齊，未見明顯視網(wǎng)膜脫離，見圖4。

討論

PVR 動物模型是PVR 防治研究的重要手段，現(xiàn)隨著PVR 疾病的認(rèn)知，已經(jīng)超過25 種動物模型方法建立標(biāo)志性的模型，包括經(jīng)典的玻璃體腔注射細(xì)胞或細(xì)胞因子、手術(shù)操作等，都在不斷發(fā)展［8-10］。PRP可以分泌多種細(xì)胞因子，最主要的是PDGF 和TGF，PDGF 的分泌和調(diào)節(jié)失衡對PVR 的病理過程起著重要作用，血清中高濃度的PDGF進入玻璃體腔和視網(wǎng)膜下，激活RPE 細(xì)胞，促使其發(fā)生遷移和增殖，最終形成增生膜，因此PRP 經(jīng)常在建立PVR 模型中被使用［11］。在PVR 發(fā)生發(fā)展中，RPE 細(xì)胞的釋放、增殖和分化是啟動和促進增殖形成的最重要因素，而且RPE 細(xì)胞同時會自分泌PVR 過程中重要的細(xì)胞因子，因此有學(xué)者會采用注射RPE 細(xì)胞的方法建立PVR 模型［6］。TGF-β2因其在纖維化疾病（如肝硬化、腎硬化等）中具有促進組織收縮的作用［12］，在PVR發(fā)病機制的研究中得到很大的關(guān)注。在體外實驗中，TGF-β2能刺激RPE 細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［13］；體 內(nèi) 實 驗中，TGF-β2注射到玻璃體腔后可引起兔眼PVR 的發(fā)生［14］。有研究表明，單純制作兔眼眼球穿通傷可以形成PVR，但其實驗周期長，需等待8～13 周［14］。目前的造模方法大多為單純玻璃體注射或行玻切手術(shù)造成視網(wǎng)膜裂口，但是實驗過程復(fù)雜或者結(jié)果不太理想，PVR 形成不顯著，影響進一步的實驗研究。所以探索一種更方便有效的PVR模型仍然顯得非常必要。本研究采用外傷加玻璃體注藥，實驗效果更為顯著。

Figure 3. Western blot analysis of α-SMA protein level in the lysates of rabbit vitreous body. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PRP group.圖3 各組兔眼玻璃體中α-SMA的蛋白水平

Figure 4. HE staining of rabbit retinal tissues on day 28 after surgery（scale bar=50 μm）. A and B：in PRP group and TGF-β2 group，the retinal layers were disordered，severely distorted or locally fractured，the structure of each layer was unclear，the inner boundary membrane was broken，and the retinal pigment epithelium（RPE）was clearly separated from the neuroepithelium；C：in RPE group，the layers of the retina were distorted and the proliferating membrane was visible in front of the retina，pulling the retina；D：in control group，the structure of the retinal layers was clear，the arrangement was still neat，and no obvious retinal detachment was seen.圖4 術(shù)后第28天兔眼視網(wǎng)膜組織病理變化

本實驗研究顯示，術(shù)后第28 天，PRP 組、TGF-β2組和RPE組中玻璃體腔內(nèi)的α-SMA蛋白含量都高于對照組，表明對TPVR 都具有一定的促進形成作用。從PVR 分級中分析，術(shù)后第28 天實驗組玻璃體視網(wǎng)膜增生程度高于對照組。視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，實驗組玻璃體視網(wǎng)膜增生程度也高于對照組。以上實驗結(jié)果表明，在造成眼球外傷的基礎(chǔ)上，PRP、RPE 和TGF-β2注射到玻璃體腔中均能有效地引起TPVR的發(fā)生發(fā)展。

在臨床上，外傷造成的鞏膜和視網(wǎng)膜傷口，相比于其他原因引起的PVR，TPVR 形成更加迅速，后果也更加嚴(yán)重［15-16］。有臨床觀點表明，PVR一直與視網(wǎng)膜裂孔相關(guān)聯(lián)，但是單純視網(wǎng)膜裂孔是不足以產(chǎn)生PVR 這種現(xiàn)象，需要細(xì)胞因子與炎癥共同作用，所以我們給兔眼制造鞏膜穿通傷產(chǎn)生炎癥，并且破環(huán)血-視網(wǎng)膜屏障，使得RPE 細(xì)胞從Bruch 膜脫離，暴露于血清中的細(xì)胞因子，細(xì)胞間緊密連接破環(huán)并且丟失上皮細(xì)胞形態(tài)，使得RPE 細(xì)胞開始增殖、遷移，發(fā)生EMT，同時炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等遷入，使得RPE細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)α-SMA、波形蛋白（vimentin），分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力增強，最終在視網(wǎng)膜前后形成具有收縮能力的纖維膜［17-19］，導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離。此次實驗結(jié)果中，術(shù)后第28 天，對照組玻璃體及眼底無明顯異常，考慮原因首先是PVR 的發(fā)生發(fā)展是多因素多機制的復(fù)雜過程，其次是單純兔眼穿通傷形成PVR緩慢［14］。相對于其他研究中單純眼球穿通傷術(shù)后4 周有效建立PVR 模型［20］，本研究制作的傷口較淺，對眼內(nèi)環(huán)境影響較小，可能是導(dǎo)致術(shù)后第28天未見明顯PVR形成的因素之一。

在PVR 中，視網(wǎng)膜前膜細(xì)胞分泌的各種生長因子是EMT 的重要推動者，包括PDGF、結(jié)締組織生長因子和TGF-β 等［21-23］。PRP 中血小板分泌多種細(xì)胞因子（比如TGF-β 和PDGF）促進RPE 細(xì)胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞來模擬人PVR 發(fā)病。PDGF 是已知刺激血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，且該因子被證明能夠促進RPE細(xì)胞EMT，同時促進RPE細(xì)胞的增殖。有證據(jù)表明，牽引膜和視網(wǎng)膜裂孔形成發(fā)展的主要因素是PDGF，因為不受外源細(xì)胞的影響，目前認(rèn)為注射PRP 進入玻璃體可以模擬人PVR 的一個過程，但是單純注射導(dǎo)致PVR 的程度比較低，所以大部分學(xué)者都是通過聯(lián)合其它方式和注射PRP來建立PVR模型。因此本實驗中我們采用玻璃體腔注射PRP 同時聯(lián)合制作鞏膜外傷，PVR 效果明顯。TGF-β（主要是TGF-β2）在PVR 患者玻璃體、視網(wǎng)膜下液和增殖膜中過量表達(dá)［24］，能促進RPE 細(xì)胞中Ⅰ型膠原合成，導(dǎo)致組織纖維化的發(fā)生，同時促進細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、組織修復(fù)及其成分的改變、細(xì)胞增殖，提高VEGF 表達(dá)，促進血管新生，推動RPE 細(xì)胞EMT 過程。因此TGF-β 誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞EMT 過程在PVR 的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起著重要作用。本實驗中玻璃體腔注射TGF-β2造成的PVR 程度較PRP 組輕，一方面考慮PRP 可分泌多種細(xì)胞因子促進PVR 進展，另一方面考慮與青紫藍(lán)兔PVR 模型中PVR 嚴(yán)重程度與玻璃體中TGF-β1含量升高有關(guān)，而與TGF-β2含量無關(guān)［25］。在PVR 中，RPE 細(xì)胞的EMT 過程是核心步驟，即經(jīng)歷EMT 的RPE 細(xì)胞獲得成纖維細(xì)胞表型，增加增殖和遷移能力，從而促進纖維膜的形成。在EMT過程中，RPE細(xì)胞的間充質(zhì)標(biāo)志物，比如α-SMA 表達(dá)升高。RPE 細(xì)胞暴露于玻璃體中，是EMT的起始步驟，但缺少足夠的EMT 驅(qū)動的生長因子，可能是此次實驗中RPE 組的PVR嚴(yán)重程度也低于PRP組的原因。

綜上所述，在造成兔眼球穿通傷的基礎(chǔ)上，玻璃體腔內(nèi)注射RPE、PRP 和TGF-β2均能造成TPVR，其中玻璃體注射PRP建模效果最明顯。這為PVR的防治研究打下實驗基礎(chǔ)。