鐮形棘豆總黃酮通過調(diào)控JAK1/STAT1/SOCS3信號通路減輕特發(fā)性肺纖維化*

李欣澤， 王彥君， 李 楊， 梁乾坤， 陳彥文， 楊玲玲， 明海霞，2△

（1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗室，甘肅 蘭州 730000；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，甘肅 蘭州 730000）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是常見的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎，是一種不可逆的進(jìn)展性疾病，致死率高，中位生存期為3～5年，常發(fā)生于60 歲以上男性［1-2］。2014年美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了吡非尼酮（pirfenidone）和尼達(dá)尼布（nintedanib）用以治療IPF，這2 種口服藥物可以減緩IPF患者肺功能的下降，但并不能提高生存率或生活質(zhì)量，其相關(guān)的不良反應(yīng)和毒副作用也限制了患者的耐受性，導(dǎo)致多達(dá)26%的患者停藥［3-4］。因此，尋求新的副作用小、耐藥性強(qiáng)的藥物治療已迫在眉睫。

研究提示，Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducers and activators of transcription，STAT）炎癥信號通路與IPF 的發(fā)生密切相關(guān)，細(xì)胞因子信號傳送阻抑物（suppressor of cytokine signaling，SOCS）是該通路中重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子［5］。其中，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、細(xì) 胞 間 黏 附 分 子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）是炎癥疾病發(fā)病過程中重要的促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)［6］。鐮形棘豆（Oxytropis falcateBunge）是藏藥“三大抗炎藥”之一，其抗炎、抗腫瘤等方面的研究逐年增加［7-8］。鐮形棘豆總黃酮（total flavonoids ofOxytropis falcataBunge，F(xiàn)OFB）是鐮形棘豆的主要化學(xué)成分，其藥理活性與全草一致［9］。本實(shí)驗通過纖維化誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞系HFL-1以建立IPF體外模型，探討FOFB 是否能通過調(diào)控SOCS3 抑制JAK1/STAT1 炎癥信號通路并延緩IPF的進(jìn)展，為民族藥材鐮形棘豆治療IPF提供體外實(shí)驗依據(jù)。

材 料 與 方 法

1 材料

1.1 動物及細(xì)胞 6～8 周齡SPF 級SD 大鼠雌雄各半共50 只，平均體質(zhì)量（200±20）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心，許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物實(shí)驗室。HFL-1細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物及試劑 鐮形棘豆購自天?？h藏醫(yī)藥開發(fā)研究所，經(jīng)研究所質(zhì)管科鑒定藥材確為鐮形棘豆，質(zhì)量合格；TGF-β1 購自派普泰克生物有限公司；吡非尼酮（生產(chǎn)批號：20210319）購自北京康蒂尼藥業(yè)股份有限公司；青、鏈霉素混合液（批號：20200429）購自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶-EDTA（批號：2120734）購自Gibco；CCK-8 試劑盒、PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒（批號分別為C1901181、H1125080和H0001451）購自上海翌圣生物科技股份有限公司；I 型膠原（collagen type I，COL I）、III 型膠原（collagen type III，COL III）、α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、p-JAK1、p-STAT1 及SOCS3 抗體購自Abcam；GAPDH 購自GeneTex；山羊抗兔IgG-HRP購自Affinity Biosciences。

2 方法

2.1 FOFB 的提取及鑒定 通過乙醇浸泡法提取，用5000 mL 圓底燒瓶放入藥材200 g，用10 倍量的無水乙醇浸泡，浸泡3天，重復(fù)3次，取濾液，旋干，得產(chǎn)物。將提取后的FOFB，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用紫外分光光度計進(jìn)行總黃酮含量的測定，純度為85%。

2.2 含藥血清的制備 按照中藥血清藥理學(xué)方法［10］操作。選用SPF 級SD 大鼠50只，分為空白血清組（灌服同體積生理鹽水）、含低濃度FOFB 血清組（灌服100 mg/kg FOFB）、含中濃度FOFB 血清組（灌服200mg/kg FOFB）、含高濃度FOFB 血清組（灌服400mg/kg FOFB）［5］和含吡非尼酮血清組（灌服162 mg/kg 吡非尼酮），每組10 只。每天1 次，連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃前8 h 禁食不禁水，1 h 后，大鼠心尖處采血；靜置2 h，離心取血清，56 ℃水浴滅活30 min，置于-20 ℃保存。吡非尼酮的劑量依據(jù)人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值計算得出［11］。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將HFL-1 細(xì)胞在含有10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素溶液的F-12K培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)匯合度至80%以上，給藥干預(yù)。將細(xì)胞分為7組：正常組（正常培養(yǎng)液）、模型組［12］（正常培養(yǎng)液+10 μg/L TGF-β1）、空白血清組（正常培養(yǎng)液+10 μg/L TGF-β1+10%空白動物血清）、含低濃度FOFB 血清組（正常培養(yǎng)液+10 μg/L TGF-β1+10%含低濃度FOFB 的血清）、含中濃度FOFB 血清組（正常培養(yǎng)液+10 μg/L TGF-β1+10%含中濃度FOFB 的血清）、含高濃度FOFB 血清組（正常培養(yǎng)液+10 μg/L TGF-β1+10%含高濃度FOFB 的血清）和含吡非尼酮血清組（正常培養(yǎng)液+10 μg/L TGF-β1+10%含吡非尼酮的血清）。實(shí)驗前用無含藥血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞同步化后，換用含有10%各組含藥血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

2.4 CCK-8 法檢測含藥血清最佳干預(yù)時間 將HFL-1 細(xì)胞培養(yǎng)于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到30%左右時，加入含藥血清干預(yù)，每組設(shè)6 個復(fù)孔，共鋪6 個96 孔板。檢測前將含藥血清吸出，加入90 μL 新培養(yǎng)液和10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h。酶標(biāo)儀分別測定24、48、72、96、120 和144 h 后450 nm 波長下的吸光度，利用GraphPad Prism 6進(jìn)行繪圖。

2.5 透射電鏡觀察粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化用60 mm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，于各組細(xì)胞干預(yù)最佳時間后收集細(xì)胞于離心管中，離心后棄上清，加入3%戊二醛，4 ℃冰箱過夜固定細(xì)胞，再用4 ℃預(yù)冷1%四氧化鋨固定2 h，用不同體積分?jǐn)?shù)的丙酮梯度脫水后，環(huán)氧樹脂浸透、包埋，用超薄切片機(jī)制備約50 nm厚的切片，先用醋酸雙氧鈾染色10～15 min，再用檸檬酸鉛染色1～2 min，制片成功后，JEM-1400Flash 透射電鏡（JEOL）觀察并拍攝照片。

2.6 RT-qPCR 檢測相關(guān)基因的相對表達(dá)量 各組細(xì)胞干預(yù)最佳時間后，用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并根據(jù)擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，RTqPCR 檢測COL I、COL III、α-SMA、SOCS3、IL-1β、ICAM1、MCP1 和TNF-α mRNA 的相對表達(dá)量。數(shù)據(jù)按2-ΔΔCt計算。引物序列見表1。

表1 檢測目的基因的引物序列Table 1. The primer sequences for RT-qPCR

2.7 Western blot 檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞干預(yù)最佳時間后，用PBS 清洗3 遍后，加入裂解液超聲震碎細(xì)胞，提取蛋白，用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，加入封閉液封閉后，加入COL I 抗體（1∶5 000）、COL III 抗體（1∶5 000）和α-SMA 抗體（1∶1 000）孵育過夜后，TBST 清洗3 次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG（1∶5 000），孵育2h 后，TBST 清洗3 次，每次5 min，使用ECL 顯影液曝光，用ImageJ 軟件進(jìn)行分析，以檢測IPF體外模型建立是否成功。造模成功后，各組蛋白加入p-JAK1 抗體（1∶500）、p-STAT1 抗體（1∶500）、SOCS3 抗體（1∶1 000）、IL-1β 抗體（1∶1 000）、ICAM1 抗體（1∶1 000）、MCP1 抗體（1∶2 000）和TNFα抗體（1∶3 000），并根據(jù)上述步驟進(jìn)行檢測與分析。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并用Graph-Pad Prism 6 軟件繪圖。實(shí)驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 CCK-8法檢測含F(xiàn)OFB血清的最佳干預(yù)時間

與24 h 時點(diǎn)相比，模型組、空白血清組和含低濃度FOFB 血清組其余時點(diǎn)HFL-1 細(xì)胞活力的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；中濃度血清組、高濃度血清組、吡非尼酮血清組中，與24h 時間點(diǎn)相比，只有120 h 時間點(diǎn)有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且FOFB 各濃度血清組在120 h 時出現(xiàn)作用峰值。因此，120 h 為FOFB 含藥血清的最佳作用時間。見圖1。

2 TGF-β1 誘導(dǎo)后HFL-1 細(xì)胞中COL I、COL III和α-SMA表達(dá)的變化及FOFB對其影響

RT-qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組HFL-1 細(xì)胞中COL I、COL III 和α-SMA 的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），提示IPF體外模型構(gòu)建成功；與模型組相比，空白血清組HFL-1細(xì)胞中COL I、COL III 和α-SMA 的mRNA 和蛋白表達(dá)量無顯著差異；隨著FOFB 濃度的升高，HFL-1 細(xì)胞中COL I、COL III 和α-SMA 的mRNA 和蛋白表達(dá)量逐漸下降，以含高濃度FOFB 血清組最為顯著（P＜0.01）；含高濃度FOFB 血清組HFL-1 細(xì)胞中COL I、COL III 和α-SMA 的mRNA 和蛋白表達(dá)量與含吡非尼酮血清組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2及圖2。

Figure 1. Effects of different concentrations of FOFB-containing serum on the viability of HFL-1 cells at different time points. A：control group；B：model group；C：animal serum group； D： animal serum containing lowconcentration FOFB group；E：animal serum containing medium-concentration FOFB group；F：animal serum containing high-concentration FOFB group；G：animal serum containing pirfenidone group. Mean±SD. n=6.圖1 含各濃度FOFB 的血清作用不同時間對HFL-1 細(xì)胞活力的影響

表2 各組HFL-1細(xì)胞中COL I、COL III和α-SMA mRNA相對表達(dá)量Table 2. Relative mRNA expression of COL I，COL III and α-SMA in HFL-1 cells of each group（Mean±SD. n=6）

3 FOFB對HFL-1細(xì)胞中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常，數(shù)量增多；空白血清組中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和數(shù)量與模型組相比無顯著差異；與模型組相比，含低濃度FOFB血清組中部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；含中濃度FOFB血清組中大部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，變?yōu)槟遗轄?；含高濃度FOFB 血清組與含吡非尼酮血清組中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)全部變?yōu)槟遗轄睿緹o正常結(jié)構(gòu)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，見圖3。

Figure 2. Relative protein expression levels of COL I，COL III and α-SMA in HFL-1 cells of each group. A：control group；B：model group；C：animal serum group；D：animal serum containing low-concentration FOFB group；E：animal serum containing medium-concentration FOFB group；F：animal serum containing high-concentration FOFB group；G：animal serum containing pirfenidone group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs A；#P＜0.05，##P＜0.01 vs B；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs G.圖2 各組HFL-1細(xì)胞中COL I、COL III和α-SMA蛋白的相對表達(dá)量

Figure 3. Effect of FOFB-containing serum on rough endoplasmic reticulum structure in HFL-1 cells（observed by transmission electron microscopy，scale bar=2 μm）. A：control group；B：model group；C：animal serum group；D：animal serum containing low-concentration FOFB group；E：animal serum containing medium-concentration FOFB group；F：animal serum containing high-concentration FOFB group；G：animal serum containing pirfenidone group.圖3 含F(xiàn)OFB血清對HFL-1細(xì)胞中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的影響

4 FOFB 對JAK/STAT 信號通路中相關(guān)炎癥因子的影響

RT-qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與正常組相比，模 型 組HFL-1 細(xì) 胞 中IL-1β、ICAM1、MCP1 和TNF-α mRNA 及蛋白水平，以及p-JAK1 和p-STAT1蛋白水平均顯著升高，SOCS3 的mRNA 和蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）；空白血清組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明動物血清對本實(shí)驗結(jié)果無影響；與模型組相比，各含藥血清組HFL-1 細(xì)胞中IL-1β、ICAM1、MCP1 和TNF-α mRNA 及蛋白水平，以及p-JAK1 和p-STAT1 蛋 白 水 平 顯 著 降 低，SOCS3 的mRNA 和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）；且隨著FOFB 濃度的升高，相關(guān)炎癥蛋白表達(dá)水平逐漸降低，SOCS3 蛋白表達(dá)水平逐漸升高，其中含高濃度FOFB 血清組及吡非尼酮血清組效果最佳，與正常組相比無顯著差異，見表3及圖4。

表3 各組SOCS3、IL-1β、ICAM1、MCP1和TNF-α mRNA的相對表達(dá)量Table 3. The mRNA expression levels of SOCS3，IL-1β，ICAM1，MCP1 and TNF-α in each group（Mean±SD. n=6）

討論

IPF 是一種病因不明的慢性進(jìn)行性纖維化疾病，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積，最終導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)衰竭和死亡［13］。肺泡上皮細(xì)胞的反復(fù)損傷是IPF發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，這些微小的損傷導(dǎo)致傷口異常愈合，同時釋放大量的炎性因子、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子等，使成纖維細(xì)胞（fibroblast，F(xiàn)b）分化為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFb），導(dǎo)致ECM 過度沉積，肺間質(zhì)重構(gòu)，最終形成IPF［14-16］。FOFB 是鐮形棘豆的主要起效成分，具有良好的抗炎作用。因此本研究使用FOFB干預(yù)IPF體外模型，以探討其中的作用機(jī)制。

膠原蛋白占機(jī)體總蛋白的30%，由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工合成，是ECM 的主要結(jié)構(gòu)成分，F(xiàn)b 與MFb 產(chǎn)生的膠原蛋白主要為I 型與III 型，MFb 相較于Fb 大大增加了產(chǎn)生膠原蛋白的速度與數(shù)量，而MFb 成熟的標(biāo)志為α-SMA 的表達(dá)［17-21］。本文結(jié)果顯示，通過TGF-β1 誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)IPF 體外模型后，細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量增多，COL I、COL III 及α-SMA 的表達(dá)量顯著升高，提示體外模型構(gòu)建成功。經(jīng)FOFB干預(yù)后，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少且結(jié)構(gòu)呈囊泡狀，且這些蛋白表達(dá)量顯著降低，表明FOFB 具有延緩IPF 體外模型進(jìn)展的作用。

JAK/STAT 信號通路是經(jīng)典的炎癥信號通路之一，與IPF 的發(fā)生關(guān)系密切［22］。JAK 是一種非受體酪氨酸激酶，通過I/II型細(xì)胞因子和干擾素在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。STAT 是保守和有效的轉(zhuǎn)錄因子之一，STAT1 轉(zhuǎn)錄因子向JAK1 下游傳遞I/II 型細(xì)胞因子信號，從而激活JAK1/STAT1信號通路［23-25］。

JAK1/STAT1 信號通路被激活后，JAK1 磷酸化，并誘導(dǎo)STAT1磷酸化。磷酸化的STAT1形成異源二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，釋放趨化因子和炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、ICAM1、MCP1 等，而這些因子已被證實(shí)為多種纖維化疾病的治療靶點(diǎn)［6，26］。SOCS 家族是典型的JAK1/STAT1 通路細(xì)胞因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控蛋白，是被認(rèn)可的JAK/STAT 通路反饋抑制劑［27］。本研究結(jié)果顯示，HFL-1 細(xì)胞經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)后，JAK/STAT 通路中p-JAK1 和p-STAT1 蛋白水平顯著升高，SOCS3 表達(dá)量顯著降低，相關(guān)促炎因子TNF-α、IL-1β、ICAM1 及MCP1 的表達(dá)量顯著升高；經(jīng)FOFB干預(yù)后，上述蛋白異常表達(dá)得到抑制，提示FOFB 通過抑制JAK1/STAT1 信號通路，減輕炎癥損傷，從而延緩IPF 體外模型的進(jìn)展。這與Montero［28］等檢測博來霉素誘導(dǎo)的纖維化小鼠肺組織中出現(xiàn)JAK1過表達(dá)并檢測到p-STAT1的結(jié)果相一致。

Figure 4. Relative protein levels of JAK1/STAT1/SOCS3 signaling pathway-related proteins and inflammatory factors in each group.A：control group；B：model group；C：animal serum group；D：animal serum containing low-concentration FOFB group；E：animal serum containing medium-concentration FOFB group；F：animal serum containing high-concentration FOFB group；G：animal serum containing pirfenidone group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs A；#P＜0.05，##P＜0.01 vs B；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs G.圖4 各組細(xì)胞中JAK1/STAT1/SOCS3信號通路相關(guān)蛋白及炎癥因子的相對表達(dá)量

綜上所述，本研究采用TGF-β1 誘導(dǎo)HFL-1 細(xì)胞，構(gòu)建IPF 體外模型，并經(jīng)過FOFB 干預(yù)，結(jié)果顯示FOFB 可能通過升高SOCS3 的表達(dá)而抑制JAK1/STAT1 信號通路的激活及相關(guān)炎性因子的表達(dá)，從而發(fā)揮延緩IPF體外模型進(jìn)展的作用。