內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活STING信號(hào)通路并降低胰島β細(xì)胞活力*

彭榮東， 何學(xué)敏▲， 王 瑨， 文哲瑤， 艾鶴英， 朱延華，魯 巖， 石國(guó)軍△， 陳燕銘△

（1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病學(xué)科，廣州市肥胖分子機(jī)理與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省糖尿病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床免疫中心，廣東 廣州 510275）

糖尿病是一種以高血糖為特征，嚴(yán)重危害人類身心健康的慢性疾病，且目前尚未有治愈手段。糖尿病患者長(zhǎng)期使用外源性藥物，帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，大部分患者不能很好地控制血糖，從而誘發(fā)多種并發(fā)癥，威脅著患者的健康和生命。因此，尋找更加有效的糖尿病治療靶點(diǎn)是非常迫切的需求。炎癥介導(dǎo)的胰島β 細(xì)胞損傷是糖尿病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵特征［1］。研究證實(shí)，胰島微環(huán)境存在多種促炎因子，而1型干擾素被認(rèn)為是重要的炎癥因子之一［2］。1型干擾素的主要來(lái)源之一是干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）及其下游蛋白TANK 結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）信號(hào)通路，在抵御病原體入侵、誘導(dǎo)炎癥和細(xì)胞損傷等方面起著重要作用［3］。然而，STING 信號(hào)通路在糖尿病導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞損傷過(guò)程中的作用仍是未知的。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是導(dǎo)致β 細(xì)胞損傷或死亡的另一個(gè)重要因素，比如在糖尿病發(fā)病前的非肥胖型糖尿病小鼠以及1 型和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者的胰島中，可以檢測(cè)到ERS 標(biāo)志物C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的積累［4-6］，暗示了ERS 可能參與糖尿病狀態(tài)下的胰島β 細(xì)胞死亡。不能正確折疊的蛋白質(zhì)堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，誘發(fā)長(zhǎng)期不可逆的ERS，進(jìn)而激活下游CHOP 通路，促進(jìn)細(xì)胞死亡。一個(gè)非常直接的證據(jù)就是1 型糖尿病Akita 小鼠，由于其胰島素前體第96 位的半胱氨酸突變成酪氨酸，導(dǎo)致另一個(gè)半胱氨酸不能與之形成二硫鍵來(lái)促進(jìn)胰島素前體的正確折疊，胰島素前體持續(xù)堆積在胰島β 細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而誘導(dǎo)β 細(xì)胞的ERS 和死亡［7］。另有研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）的突變會(huì)影響蛋白質(zhì)合成的調(diào)控，導(dǎo)致合成蛋白過(guò)多，從而誘發(fā)β 細(xì)胞凋亡［8］。此外，ERS還在多種疾病中促進(jìn)炎癥因子表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，如早期酒精性肝?。?］、心臟炎癥和纖維化［10］等。

目前已經(jīng)有報(bào)道證實(shí)，ERS 與STING 信號(hào)通路的相互作用是導(dǎo)致心肌肥大、外傷性大腦損傷［11］和酒精性肝病［9］的重要致病因素。它們可以通過(guò)鈣通量的改變和活性氧的產(chǎn)生密切聯(lián)系［12］，也可以直接相互作用來(lái)誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)［10］。鑒于STING 信號(hào)通路與ERS 的密切關(guān)系，以及糖尿病條件下炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞功能減退和耗竭的重要因素，本研究擬探討胰島β 細(xì)胞中是否存在STING 信號(hào)通路，以及ERS 下STING 信號(hào)激活對(duì)胰島β 細(xì)胞活力的影響。

材料和方法

1 人胰島單細(xì)胞RNA 測(cè)序（single-cell RNA se?quencing，scRNA-Seq）數(shù)據(jù)分析

從PubMed 上獲取健康人和T2DM 患者的胰腺組織的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)集（ArrayExpress E-MTAB-5061）［13］并對(duì)其進(jìn)行分析。通過(guò)篩選并排除線粒體含量＞12%或待檢測(cè)基因＜200 的低質(zhì)量細(xì)胞后，用Seurat 3.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行歸一化、降維、縮減和聚類分析［14］，最終篩選到了2 358 個(gè)胰腺細(xì)胞的數(shù)據(jù)，其中包括1 561個(gè)內(nèi)分泌細(xì)胞。并根據(jù)相關(guān)激素基因的表達(dá)譜，把這些內(nèi)分泌細(xì)胞聚集分成了5 個(gè)細(xì)胞簇［13］。然后，用Seurat 3.0 與ggplot2 R 包一起生成單獨(dú)的UMAP 圖和氣泡圖。未檢測(cè)到靶基因mRNA 表達(dá)的患者數(shù)據(jù)不用于后續(xù)分析。分析工作流程如圖1所示。

Figure 1. Flow chart of the searching strategy of human pancreatic scRNA-Seq databases.圖1 人胰腺scRNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)篩選流程圖

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～6 周的雄性db/db小鼠［B6.BKS（D）-Leprdb/J）］和同窩野生型（wild-type，WT）小鼠購(gòu)自Cavens 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（中國(guó)常州），許可證號(hào)為SCNK（蘇）2021-0013，每種5 只。所有小鼠均被飼養(yǎng)在SPF 級(jí)、溫度（72±3°F）和空氣（50±20%相對(duì)濕）恒定的房間中，接受12 h 的光照/黑暗循環(huán)，并給予標(biāo)準(zhǔn)飲食和自來(lái)水。飼養(yǎng)9 周后，將小鼠用過(guò)量的異戊巴比妥鈉處死，摘取胰腺組織。此時(shí)，小鼠體重分別為（47.26±5.14）g和（28.32±1.33）g，血糖值分別為HI（超過(guò)血糖儀的測(cè)量范圍）和（7.98±1.54）mmol/L。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案預(yù)先獲得中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均在《赫爾辛基宣言》指導(dǎo)下進(jìn)行。

3 方法

3.1 免疫熒光染色 將分離的胰島組織進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋和切片。切片再經(jīng)過(guò)一系列的脫蠟和復(fù)水步驟，并用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，再用1%牛血清白蛋白和0.3% Triton X-100 的封閉液進(jìn)行破膜和封閉；之后向切片加入抗STING 抗體和抗胰高血糖素（glucagon）抗體（Cell Signaling Technology）于4 ℃中孵育過(guò)夜，然后用Alexa Fluor 488 偶聯(lián)山羊抗小鼠Ⅱ抗、Alexa Fluor 647 偶聯(lián)山羊抗兔Ⅱ抗和DAPI（Cell Signaling Technology）進(jìn)行染色［15］。我們使用DMI8 徠卡顯微系統(tǒng)對(duì)組織切片進(jìn)行觀察和成像。每組均有5個(gè)樣本。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 小鼠胰島β 細(xì)胞系Min6、NIT-1 和beta-TC-6 購(gòu)自廣州亞歷山生物醫(yī)藥公司；高表達(dá)STING 蛋白的陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞——小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7［16］購(gòu)自廣州剪刀手基因技術(shù)有限公司。Min6 和NIT-1 細(xì)胞使用添加了1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素，100 μmol/L β-巰基乙醇和10%胎牛血清（HyClone）的RPMI-1640 培養(yǎng)液，而beta-TC-6 和RAW264.7 細(xì)胞使用添加了1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。所有細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。我們將細(xì)胞種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞密集度達(dá)到70%～80%就進(jìn)行藥物處理。STING 信號(hào)通路激動(dòng)劑5，6-二甲基呫噸酮-4-乙酸（5，6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，DMXAA；MedChemExpress）的處理濃度為50 mg/L［16］，用7.5%碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液作為對(duì)照。ERS 激動(dòng)劑類胡蘿卜素（thapsigargin，TG；MedChemExpress）的處理濃度為0.5 μmol/L［17］，以同體積的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶劑作為對(duì)照。細(xì)胞處理結(jié)束后，分別通過(guò)Western blot 分析和RT-qPCR 檢測(cè)STING 信號(hào)通路的蛋白和mRNA 表達(dá)水平。每組樣品均有3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 Western blot 分析 用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的1×SDS 裂解液處理細(xì)胞獲得細(xì)胞裂解液，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量（30 μg）的蛋白質(zhì)樣品，然后轉(zhuǎn)移到固定化轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Millipore）。PVDF 膜在5%牛奶中進(jìn)行室溫封閉1 h，然后加入抗STING 抗體（13647S，Cell Signaling Technology）、抗p-TBK1 抗體（5483S，Cell Signaling Technology）、抗TBK1 抗體（38066S，Cell Signaling Technology）、抗p-IRF3 抗體（29047S，Cell Signaling Technology）、抗IRF3抗體（4302S，Cell Signaling Technology）、抗β-actin 抗體（A5441，Sigma）及抗GAPDH 抗體（2118S，Cell Signaling Technology）于4 ℃孵育過(guò)夜。在室溫孵育Ⅱ抗2 h 后，用HRP 底物ECL（Bio-Rad）對(duì)印跡進(jìn)行顯像，通過(guò)ChemiDocTM XRS+成像系統(tǒng)（Bio-Rad）進(jìn)行成像掃描，并用ImageJ 軟件對(duì)蛋白的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)［18］。每組樣品均有3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

3.4 RT-qPCR 首先用Trizol 試劑（Sigma）提取細(xì)胞 總RNA，再 用PrimeScript ?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以生成模板cDNA。隨后使用TB Green?Premix Ex Taq?II 試劑盒（TaKaRa）在ABI QuantStudio 5 PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系依據(jù)產(chǎn)品制造商的指示進(jìn)行。將目的基因與內(nèi)參照GAPDH 進(jìn)行歸一處理，得到目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平［3］。本研究所使用的mRNA特異性引物序列見(jiàn)表1。每組樣品均有3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

3.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將消化下來(lái)的細(xì)胞，按照每孔2×104個(gè)接種于含完全培養(yǎng)液的96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱過(guò)夜貼壁，然后進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞處理。處理完畢，按照CCK-8 試劑盒（DOJINDO）的實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)細(xì)胞活力，然后將各組數(shù)值與對(duì)照組進(jìn)行歸一化，以相對(duì)活力來(lái)表示［19］。每組樣品均有3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料，則采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 通過(guò)已發(fā)表scRNA-Seq 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定并比較健康人和T2DM 患者胰島β 細(xì)胞的STING 信號(hào)通路基因表達(dá)情況

ArrayExpress E-MTAB-5061 數(shù)據(jù)庫(kù)包括6 例健康供體和4例T2DM 患者供體，其性別、年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）和HbA1c 等基本臨床信息列于表2［13］。

表2 scRNA-Seq分析數(shù)據(jù)來(lái)源的病人臨床基線資料Table 2. Baseline characteristics of donors enrolled for scRNASeq analysis

我們從該數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定出2 358 個(gè)胰腺細(xì)胞，其中1 561 個(gè)為內(nèi)分泌細(xì)胞。我們根據(jù)激素基因表達(dá)譜對(duì)內(nèi)分泌細(xì)胞進(jìn)行重新聚類，鑒定出5 個(gè)細(xì)胞簇，包括α、β、γ、δ 和ε 細(xì)胞（圖2A、B）。氣泡圖證實(shí)了β 細(xì)胞中有STING、TBK1和IRF3基因的mRNA 表達(dá)，而干擾素β（interferon β，IFN-β/IFNB）的表達(dá)較低（圖2C）。未激活狀態(tài)的STING蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上［3］，其活性受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的影響，因此我們還分析了ERS 相關(guān)基因［如轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、X 盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）、DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本3（DNA damage inducible transcript 3，DDIT3）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞核信號(hào)傳導(dǎo)蛋白1（endoplasmic reticulum to nucleus signaling 1，ERN1）］的表達(dá)。結(jié)果表明，胰島β細(xì)胞中也表達(dá)上述ERS相關(guān)基因（圖2C）。為了評(píng)估糖尿病對(duì)STING 信號(hào)通路和ERS 的影響，我們比較了健康對(duì)照組和T2DM 患者STING 通路基因TBK1和IRF3以 及ERS 相關(guān)基 因ATF4和XBP1的表達(dá)水平。結(jié)果表明，只有XBP1在T2DM 患者胰島β細(xì)胞中有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），而其他基因未檢測(cè)到顯著變化（圖2D）。

2 鑒定與比較小鼠胰腺組織β 細(xì)胞和小鼠β 細(xì)胞系的STING信號(hào)通路

我們采用免疫熒光染色法檢測(cè)小鼠胰腺組織以驗(yàn)證上述scRNA-Seq 結(jié)果。染色結(jié)果顯示，小鼠胰島β 和α 細(xì)胞均表達(dá)STING 蛋白，與scRNA-Seq 數(shù)據(jù)一致；STING 主要表達(dá)在胰島β 細(xì)胞的細(xì)胞核周圍，呈點(diǎn)狀分布；db/db小鼠β 細(xì)胞STING 表達(dá)較對(duì)照小鼠顯著增加（圖3A-2）。我們還在胰腺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到大量的STING蛋白（圖3A-1）。

Figure 2. Identification of STING pathway and endoplasmic reticulum stress by scRNA-Seq dataset of pancreatic islets from healthy and type 2 diabetes mellitus（T2DM）donors. A：clustering and annotation of the endocrine cells using public scRNA-Seq dataset（ArrayExpress E-MTAB-5061）from healthy and T2DM donors（right），or combined donors（left）；B：clusters of endocrine cell types based on their hormone expression profiles（GCG：glucagon；INS：insulin；PPY：pancreatic polypeptide；SST：somatostatin；GHRL：ghrelin）；C：bubble plot showing selected gene expression in endocrine cell types（bubble size indicates mean expression level of genes in each cluster，and color saturation indicates the percentage of cells that expressing the gene in respective cluster）；D：TBK1，IRF3，ATF4 and XBP1 expression in healthy and T2DM donors.Mean±SEM. n=3.圖2 通過(guò)scRNA-Seq對(duì)人胰島β細(xì)胞STING信號(hào)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的鑒定與比較

為了在胰島β 細(xì)胞系中驗(yàn)證STING 信號(hào)通路的是否可被激活，我們使用了3 種小鼠胰島β 細(xì)胞系，即beta-TC-6、Min6 和NIT-1，以 及 陽(yáng) 性 對(duì) 照 細(xì) 胞RAW264.7。DMXAA 處理上述細(xì)胞后，RAW264.7細(xì)胞的STING 信號(hào)通路被激活，表現(xiàn)為磷酸化TBK1（phosphorylated TBK1，p-TBK1）和 磷 酸 化IRF3（phosphorylated IRF3，p-IRF3）蛋白水平顯著升高；在DMXAA 刺激15 min后，我們檢測(cè)到STING的表達(dá)持續(xù)減少（圖3B）。雖然3 個(gè)小鼠胰島β 細(xì)胞系均表達(dá)TBK1 和IRF3，但僅有beta-TC-6 細(xì)胞表達(dá)STING蛋白；且只有beta-TC-6 細(xì)胞經(jīng)DMXAA 刺激后，p-TBK1 和p-IRF3 蛋白水平顯著升高（圖3C）。而Min6和NIT-1 細(xì)胞經(jīng)DMXAA 刺激后檢測(cè)不到p-TBK1 和p-IRF3信號(hào)（圖3D、E）。

3 比較3 種胰島β 細(xì)胞中STING 信號(hào)通路相關(guān)分子的mRNA水平

為了進(jìn)一步比較上述β 細(xì)胞系STING 通路的基礎(chǔ)表達(dá)水平，我們對(duì)Min6、NIT-1 和beta-TC-6 細(xì)胞進(jìn)行了RT-qPCR 分析。與Western blot 結(jié)果一致，beta-TC-6細(xì)胞中STING、TBK1和IRF3的基礎(chǔ)mRNA水平顯著高于Min6 和NIT-1 細(xì)胞（圖4A～C）。此外，我們還分析了DMXAA 處理后這些細(xì)胞系STING 信號(hào)成分和下游IFN-β 的mRNA 水平。DMXAA 處理2 h后，beta-TC-6 細(xì)胞表現(xiàn)出顯著升高的Sting 和IFN-β mRNA 水平，而在Min6 和NIT-1 細(xì)胞中均未觀察到類似的誘導(dǎo)（圖4D～G）。

4 ERS 激活STING 信號(hào)通路并協(xié)同降低胰島β 細(xì)胞活力

Figure 3. Identification of STING signaling pathway in mouse pancreatic β cells and β cell lines. A：immunofluorescence staining of STING protein expression in non-β cells（A-1）and β cells（A-2）of WT mice and db/db mice（scale bar=50 μm）；B：the protein expression and activation of STING signaling pathway in RAW264.7 macrophage cell line with DMXAA（50 mg/L）treatment for indicated time；C：the protein expression and activation of STING signaling pathway in beta-TC-6 cell line with DMXAA（50 mg/L）treatment for indicated time；D and E：the protein expression and activation of STING signaling pathway in Min6 and NIT-1 cell lines with DMXAA（50 mg/L）treatment for indicated time. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs 0 min group.圖3 小鼠胰腺組織β細(xì)胞和β細(xì)胞系中STING信號(hào)通路的鑒定與比較

為了檢測(cè)ERS 狀態(tài)下胰島β 細(xì)胞STING 信號(hào)通路的活性，我們采用了TG 處理細(xì)胞并檢測(cè)STING 通路組分的激活狀態(tài)。TG 處理能顯著誘導(dǎo)beta-TC-6細(xì)胞中TBK1和IRF3磷酸化（圖5A）。為了證實(shí)ERS對(duì)STING 信號(hào)通路的激活是否會(huì)對(duì)胰島β 細(xì)胞的活力產(chǎn)生影響，我們用TG、DMXAA 或TG+DMXAA 處理beta-TC-6 細(xì)胞，然后用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，在TG 處理12 h 后，beta-TC-6 細(xì)胞活力顯著降低，并隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸降低（圖5B）；DMXAA 單獨(dú)處理細(xì)胞48 h 后可顯著降低細(xì)胞活力（圖5C）；當(dāng)TG 和DMXAA 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，與單獨(dú)使用TG 或DMXAA 處理相比，beta-TC-6 細(xì)胞活力進(jìn)一步降低（圖5D）。

Figure 4. Comparisons of mRNA expression profiles of STING signaling pathway-related molecules in 3 mouse pancreatic islet β cell lines. A，B and C：the basal mRNA levels of STING，TBK1 and IRF3 in Min6，NIT-1 and beta-TC-6 cell lines；C，D，E and F：the mRNA expression of STING，TBK1，IRF3 and IFN-β in Min6，NIT-1 and beta-TC-6 cell lines after treatment with DMXAA for 2 h. Mean±SEM. n=3.##P＜0.01 vs beta-TC-6 group；**P＜0.01 vs Min6-control group；△△P＜0.01 vs NIT-1-control group；▲P＜0.05 vs beta-TC-6-control group.圖4 3種小鼠胰島β細(xì)胞系中STING信號(hào)通路mRNA表達(dá)譜的比較

討論

STING 信號(hào)通路可以感知細(xì)菌入侵或宿主細(xì)胞損傷，是先天免疫反應(yīng)的重要組成部分［20］。STING分子表達(dá)存在著顯著的細(xì)胞差異性，如STING 蛋白在免疫細(xì)胞［21］和內(nèi)皮細(xì)胞［22］中高表達(dá)，但肝細(xì)胞中未 檢 測(cè) 到STING 表 達(dá)［23］。胰 島β 細(xì) 胞 是 否 表 達(dá)STING 信號(hào)通路相關(guān)蛋白，及其活性是否被糖尿病狀態(tài)所影響仍不清楚。本研究系統(tǒng)分析了STING 信號(hào)通路相關(guān)基因在人和小鼠胰島β 細(xì)胞及3 種小鼠胰島β 細(xì)胞系中的表達(dá)，并進(jìn)一步通過(guò)beta-TC-6 胰島β 細(xì)胞系，研究了STING 信號(hào)通路與ERS 產(chǎn)生協(xié)同作用對(duì)胰島β細(xì)胞活力的影響。

已發(fā)表的研究通過(guò)免疫熒光染色分別在人與小鼠胰島β 細(xì)胞中檢測(cè)到STING 蛋白的表達(dá)［24-25］。本研究顯示STING 在小鼠胰腺的內(nèi)皮細(xì)胞以及胰腺外分泌腺細(xì)胞中均有較強(qiáng)的表達(dá)，而在β 細(xì)胞表達(dá)相對(duì)較弱（圖3A）。上述文獻(xiàn)與本研究中的結(jié)果差異可能源于抗體不同，但均明確提示STING 蛋白及其信號(hào)通路在胰島β 細(xì)胞中的存在。已有文獻(xiàn)表明靜息穩(wěn)態(tài)下，STING 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體［3，26］；被HSV 感染、雙鏈DNA 或cGAMP 等刺激因子激活后，STING 被重新定位到核周區(qū)［27-28］；另一研究顯示STING 的自激活突變體熒光染色信號(hào)分布于核周和非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體區(qū)［29］。我們的熒光染色結(jié)果亦顯示STING 主要分布在胰島β 細(xì)胞核周的點(diǎn)狀小泡，且db/db小鼠胰島β 細(xì)胞的STING 蛋白表達(dá)較WT 小鼠的顯著增強(qiáng)。因此，基于STING 在db/db小鼠β 細(xì)胞核周的分布模式及其較野生型小鼠更高的表達(dá)水平，我們推測(cè)糖尿病小鼠胰島β 細(xì)胞中STING 信號(hào)通路呈一定的激活狀態(tài)；但需要更多的證據(jù)來(lái)明確STING 通路在db/db小鼠胰島β細(xì)胞是否是呈較強(qiáng)的活性狀態(tài)。研究報(bào)道高脂導(dǎo)致的脂毒性會(huì)誘發(fā)線粒體DNA 泄 露到胞質(zhì)從而激活STING 信號(hào)通路［30］；Sting全身敲除的小鼠其胰島素敏感性及葡萄糖耐量均得到顯著改善，但胰島β 細(xì)胞特異性敲除Sting的小鼠其胰島素分泌能力顯著下降［31］，表明STING 信號(hào)通路在不同組織、不同狀態(tài)下的功能是比較復(fù)雜的，有待于更多的深入研究。

Figure 5. Activation of STING signaling pathway under endoplasmic reticulum stress and their synergistical effect on the viability of beta-TC-6 cells. A：Western blot was used to detect the expression of STING signaling pathway-related proteins in beta-TC-6 cells with TG（0.5 μmol/L）treatment；B，C and D：the viability of beta-TC-6 cells after treated with TG（0.5 μmol/L）for 12，24 and 48 h（B），DMXAA（50 mg/L）for 12，24 and 48 h（C），or TG（0.5 μmol/L）combined with DMXAA（50 μmol/L）for 24 h（D）was detected by CCK-8 assay. Mean±SEM. n=3 to 6.##P＜0.01 vs DMSO group；**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs TG+NaHCO3 group；▲▲P＜0.01 vs DMSO+DMXAA group.圖5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下beta-TC-6細(xì)胞STING信號(hào)通路的激活及其協(xié)同影響細(xì)胞活力

我們的研究證實(shí)STING蛋白在beta-TC-6小鼠胰島β 細(xì)胞系中有表達(dá)且可被其激動(dòng)劑激活，而NIT-1和Min6 細(xì)胞系對(duì)STING 激動(dòng)劑無(wú)明顯反應(yīng)，提示STING通路可能與β細(xì)胞生理學(xué)功能的調(diào)控有關(guān)，且beta-TC-6 是研究STING 通路與β 細(xì)胞功能的合適細(xì)胞系。而上述不同小鼠細(xì)胞系中STING 信號(hào)通路活性存在差異，可能有以下原因。首先，這些細(xì)胞系來(lái)自不同遺傳背景的小鼠。Min6 細(xì)胞來(lái)自C57BL/6 小鼠胰島瘤細(xì)胞［32］，NIT-1 細(xì)胞來(lái)自轉(zhuǎn)NOD/LT 小鼠胰島β 細(xì)胞腺瘤細(xì)胞［33］，beta-TC-6 細(xì)胞來(lái)自轉(zhuǎn)染了SV40的C57BL/6和C3HEB/FEJ小鼠雜交后子代的原代胰島［34-35］；其次，不同細(xì)胞系表達(dá)和分泌不同種類的激素，例如，有報(bào)道顯示Min6 細(xì)胞和beta-TC-6 細(xì)胞分泌胰島素、胰高血糖素和生長(zhǎng)抑素［36-37］，而NIT-1細(xì)胞只分泌胰島素和胰高血糖素，但不分泌生長(zhǎng)抑素［38］；最后，在連續(xù)的細(xì)胞傳代過(guò)程中，Min6 細(xì)胞系會(huì)失去對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性［39］；而beta-TC-6 細(xì)胞系雖然保持著對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性，但己糖激酶的表達(dá)量發(fā)生了顯著改變［35］。

STING 信號(hào)通路可以感知線粒體和基因組損傷而泄露的DNA，然后啟動(dòng)炎癥反應(yīng)［40］。我們的研究顯示beta-TC-6細(xì)胞中持續(xù)激活STING信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致β 細(xì)胞活力顯著降低（圖5C），與前期其它關(guān)于STING 激活導(dǎo)致細(xì)胞死亡的研究一致［41-42］。我們還證實(shí)STING 信號(hào)通路和ERS 同時(shí)激活后，細(xì)胞活力較單獨(dú)激活均顯著下降（圖5D），提示在T2DM 中，STING 信號(hào)通路和ERS 之間的協(xié)同作用可能在β 細(xì)胞功能障礙和損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，我們證實(shí)人和小鼠胰腺組織中胰島β細(xì)胞均檢測(cè)到STING 的表達(dá)，而beta-TC-6 細(xì)胞是一種適合于體外研究STING 信號(hào)通路的胰島β 細(xì)胞系。ERS 和STING 信號(hào)通路均可顯著抑制β 細(xì)胞的活力，且二者協(xié)同作用可進(jìn)一步破壞胰島β 細(xì)胞的活力，提示這兩條通路均可能參與β 細(xì)胞損傷過(guò)程而與糖尿病等密切相關(guān)。雖然糖尿病小鼠胰島β 細(xì)胞和胰島β 細(xì)胞系的STING 信號(hào)通路激活機(jī)制及其參與糖尿病等的發(fā)病過(guò)程的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，但我們的工作提供了重要的證據(jù)和線索，并提示STING 信號(hào)通路和ERS 反應(yīng)可作為保護(hù)β 細(xì)胞活力從而治療糖尿病的潛在靶點(diǎn)。