牛丙型肝炎病毒研究進(jìn)展

郭鑾英，李家磊，金芹芹，馬 駿，劉 全

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京 100081)

丙型肝炎病毒(Hepacivirus)是一類(lèi)有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)成員。2020年，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Virus,ICTV)將丙型肝炎病毒分為14個(gè)不同病毒種。目前為止，除了田鼠可被丙型肝炎病毒F和J型感染外，其他病毒種均存在宿主特異性。A型丙型肝炎病毒感染馬[1]，B、C型感染猴和人[2]，D型感染猴[3]，E、F、G、H、I和J型感染嚙齒動(dòng)物[4]，K、L和M型感染蝙蝠[5]，N型感染牛[6]。

長(zhǎng)期以來(lái)，丙型肝炎病毒屬只有人丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)1個(gè)種。HCV在自然情況下，只感染人和黑猩猩，是導(dǎo)致人類(lèi)慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病原體之一[7]。全球約有5 800萬(wàn)人感染慢性HCV，每年約有150萬(wàn)名新感染者，2019年約有29萬(wàn)人死于丙型肝炎[8]，目前尚無(wú)針對(duì)HCV的有效疫苗，由于缺乏合適的動(dòng)物模型，HCV的致病機(jī)理及疫苗的研制受到極大的阻礙，積極治療及控制病毒感染成了主要防控手段。

近年來(lái)隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究者在不同動(dòng)物物種中發(fā)現(xiàn)了丙型肝炎病毒，包括馬[9-10]、嚙齒動(dòng)物[11]、蝙蝠[5]和多種非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物[2]。目前該病毒屬已增加至14個(gè)病毒種(A～N種)，其中最新的病毒種是——N型丙型肝炎病毒(Hepacivirus N，HNV),2015年，德國(guó)首次報(bào)道在奶牛血清中發(fā)現(xiàn)該病毒，因此也稱(chēng)牛丙型肝炎病毒(Bovine hepacivirus,BovHepV)，HNV同HCV相似，能造成宿主無(wú)明顯臨床癥狀的急性和慢性感染[12]，因此盡管沒(méi)有肝損傷跡象，但HNV的感染對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展及與病毒密切接觸的農(nóng)民和育種人員健康均構(gòu)成潛在威脅。目前HNV的研究及報(bào)道內(nèi)容有限，國(guó)內(nèi)更是缺乏對(duì)HNV研究進(jìn)展的系統(tǒng)整理，筆者就HNV的病原學(xué)研究、流行情況及檢測(cè)方法方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為HNV的病原學(xué)發(fā)展、發(fā)病機(jī)制、人畜共患感染潛力的研究提供參考。

1 HNV特征

1.1 HNV的形態(tài)結(jié)構(gòu)

HCV呈球形，直徑50 nm，有囊膜，病毒核心直徑約30 nm[13]，詳細(xì)結(jié)構(gòu)尚不明確。而黃病毒科成員的病毒顆粒形態(tài)、基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)制方式相似[14]，加之丙型肝炎病毒屬病毒在體外細(xì)胞中增殖能力有限，目前尚無(wú)HNV分離成功的報(bào)道，因此可參照HCV的病毒顆粒形態(tài)，尋找HNV的病毒顆粒并觀察記錄。

1.2 HNV的基因組結(jié)構(gòu)及功能

HNV的基因組結(jié)構(gòu)及功能與黃病毒科病毒成員相似。 HNV為單股正鏈RNA病毒，長(zhǎng)約8.8 kb。HNV基因組包含非編碼區(qū)5′-UTR、3′-UTR及1個(gè)長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框(ORF)。ORF編碼1個(gè)含2 779個(gè)氨基酸的前體多蛋白，前體多蛋白在信號(hào)肽酶和蛋白酶共同作用下，被加工成約10個(gè)蛋白，其中包括3種結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白C(Core,C)、囊膜蛋白E1(為糖蛋白)、囊膜蛋白E2(含有能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的抗原表位)。此外，還有7種非結(jié)構(gòu)蛋白p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[15]。其中，5′-UTR、NS3及NS5B是HNV的高度保守區(qū)，NS3作為解旋酶和蛋白酶，還具有部分RNA聚合酶復(fù)合物的功能，NS3負(fù)責(zé)多聚蛋白酶的大部分剪切作用，而宿主蛋白酶參與剩余的剪切作用[13]。

圖1 丙型肝炎病毒基因組模式圖[14]Fig.1 Hepacivirus genome model map[14]

1.3 HNV的遺傳多樣性

2019年，Gang等[16]根據(jù)HCV的分類(lèi)原則，將HNV分為1個(gè)基因型和7個(gè)亞型(A～G亞型)，2021年，Shao等[17]將HNV分為2個(gè)基因型和8個(gè)亞型(圖2)，其中HNV的A和F亞型主要存在于德國(guó)；加納流行B、C亞型；巴西流行D亞型；中國(guó)廣東、江蘇及四川鑒定發(fā)現(xiàn)存在E、G和H亞型[16-19]，表明HNV基因型和亞型的地理分布復(fù)雜。

整體上，HNV的基因多樣性遠(yuǎn)不如HCV豐富，一方面，可能是因?yàn)橐延械腍NV研究成果是建立在地理隔離較大的牛群上，意味著可能存在更多的HNV有待發(fā)現(xiàn)，這與在歷史上人們發(fā)現(xiàn)不同HCV基因型的過(guò)程相似[20]；另一方面，可能是人類(lèi)圈養(yǎng)動(dòng)物的行為對(duì)病毒多樣性有一定的影響，如影響了HNV毒株跨地域傳播及基因重組。最后，想要更詳細(xì)地研究HNV的遺傳多樣性，需要更大的樣本量、縱向研究或動(dòng)物感染試驗(yàn)，對(duì)不同牛種的HNV流行情況進(jìn)行調(diào)查也有助于了解病原與病原、病原與生態(tài)之間的進(jìn)化關(guān)系。

值得注意的是，近幾年隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，HNV基因亞型的種類(lèi)不斷增加，分布情況也逐步改變。截至2021年中國(guó)至少存在HNV的4種亞型[17]，這可能是由于中國(guó)活牛國(guó)際貿(mào)易頻繁，促進(jìn)了HNV的跨界傳播。此外，目前僅在中國(guó)廣東、江蘇、云南和四川等有限地區(qū)的牛中檢測(cè)到HNV[16,18-19]，擴(kuò)大HNV流行病學(xué)調(diào)查范圍，可更好地揭示中國(guó)HNV的遺傳多樣性和流行病學(xué)特征。

1.4 HNV的致病機(jī)理

研究表明，持續(xù)的HCV感染與原發(fā)性肝癌、肝硬化和自身免疫性肝炎有關(guān)[21]，但非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、蝙蝠、牛和馬的肝炎病毒的致病機(jī)理和特征尚不明確。

有研究發(fā)現(xiàn)，兩頭持續(xù)性感染HNV的牛檢測(cè)不到病毒抗體[22]。已知人或動(dòng)物慢性感染病毒時(shí)，在血清中基本能檢測(cè)到病毒抗體，但當(dāng)慢性感染HCV的患者共感染人類(lèi)免疫缺陷綜合征病毒(HIV)時(shí)，其CD4+T細(xì)胞衰竭引起的免疫抑制會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)不到HCV抗體[23-24]。據(jù)此推測(cè)這2頭?？赡苁谴嬖跈C(jī)體免疫抑制，另一種推測(cè)是HNV可通過(guò)垂直傳播使幼畜產(chǎn)生特異性免疫耐受。

HNV 5′-UTR中存在1個(gè)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)，可與宿主因子microRNA-122(miR-122)結(jié)合，在不依賴(lài)5′-UTR帽子結(jié)構(gòu)的情況下顯著增強(qiáng)病毒翻譯效率[25-26]。牛肝臟組織中存在大量miR-122，在HNV生命周期中起著關(guān)鍵作用[27]，未來(lái)的研究集中于miR-122是如何影響病毒復(fù)制的過(guò)程，或可闡明HNV的致病機(jī)理。

2 HNV的流行病學(xué)研究

2.1 臨床癥狀

人急性感染HCV常因無(wú)明顯臨床癥狀而被忽略，感染者不能自行清除病毒則發(fā)展為慢性感染，這是導(dǎo)致肝炎和肝癌的主要原因[28]。有證據(jù)表明，馬感染丙型肝炎病毒時(shí)病毒的清除速度比人更快速，因此只會(huì)引起較輕微的肝臟炎癥,且馬的品種和年齡也會(huì)影響病毒感染結(jié)果[29]。

HNV同大多丙型肝炎病毒相似，有強(qiáng)嗜肝性，可造成牛無(wú)明顯臨床癥狀的急性和慢性感染[29-31]，HNV慢性感染時(shí)間可達(dá)9個(gè)月甚至更久[22]。但感染HNV的牛肝臟生化指標(biāo)正常，未見(jiàn)肝損傷或病變[32-33]，表明肝損傷與肝臟內(nèi)病毒滴度之間沒(méi)有相關(guān)性。盡管這一發(fā)現(xiàn)出人意料，但對(duì)于肝病毒感染來(lái)說(shuō)并不少見(jiàn)，如HCV驅(qū)動(dòng)肝損傷的發(fā)病機(jī)制主要是免疫介導(dǎo)的[34]，此外，參考HCV從感染到致病甚至引起肝癌一般需要幾十年的時(shí)間，目前沒(méi)有HNV感染引起動(dòng)物產(chǎn)生臨床癥狀的相關(guān)報(bào)道可能正是因?yàn)镠NV的慢性感染尚未發(fā)展到臨床期其宿主就被宰殺。

2.2 流行情況

HNV在牛群中呈高度流行趨勢(shì)。自2015年Christine等[12]首次通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)在德國(guó)奶牛血清中發(fā)現(xiàn)一種新型丙型肝炎病毒HNV后，世界范圍內(nèi)多個(gè)研究陸續(xù)報(bào)道了HNV的在牛群中流行率在0.2%～19.9%[6,12,20,22,33-35]。2015年，研究者在非洲牛群中檢測(cè)到HNV并對(duì)12個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的牛群進(jìn)行核酸篩查，結(jié)果顯示，6個(gè)牛場(chǎng)具有陽(yáng)性病例[6]。2017年，Canal等[32]利用貝葉斯系統(tǒng)分析方法證明HNV可能至少在1996年就在巴西流行，比德國(guó)的報(bào)道要早20年。2019年，中國(guó)商業(yè)化的血清中檢測(cè)到HNV核酸[16]。值得一提的是，2021年，有研究者在中國(guó)廣東的蜱中發(fā)現(xiàn)HNV新亞型并獲得全基因組[17]，提示蜱可能是HNV潛在的傳播媒介。

2.3 易感宿主

目前認(rèn)為?？苿?dòng)物為HNV的主要宿主，其中以牛為主，有可能感染共同圈養(yǎng)的羊，病毒感染無(wú)性別及年齡差異[36]。2020年，強(qiáng)欣[37]首次在云南的羊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)HNV，羊是?？蒲騺喛频慕y(tǒng)稱(chēng)，與牛親緣關(guān)系較近，所以牛羊一同飼養(yǎng)造成HNV感染羊的可能性非常大?？紤]到其他肝病毒的物種特異性，HNV可能不會(huì)感染?？埔酝獾奈锓N，但動(dòng)物丙型肝炎病毒的 NS3/4A 蛋白酶可切割動(dòng)物宿主及人的先天免疫接頭——線(xiàn)粒體抗病毒信號(hào)蛋白 (mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)來(lái)規(guī)避宿主的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致干擾素產(chǎn)生減少并有助于丙型肝炎病毒的持續(xù)感染[38]，在人獸共患病暴露的情況下，人類(lèi)MAVS可能無(wú)法有效抑制這些非人類(lèi)病毒的復(fù)制。

2.4 傳播途徑

丙型肝炎病毒幾乎完全通過(guò)血液、血液制品和被血液污染的物體進(jìn)行傳播。Gather等[39]在一項(xiàng)馬的研究中，揭示了動(dòng)物丙型肝炎病毒存在垂直傳播的可能。

對(duì)于牛而言，受血液污染的注射器是最重要的傳播因素。初步懷疑未更換的針頭、精液為HNV潛在的感染源，具體的傳染源、傳播途徑及傳播機(jī)制還需深入研究。德國(guó)一項(xiàng)HNV流行病學(xué)調(diào)查顯示，陽(yáng)性血清宿主(牛)的鼻咽拭子核酸檢測(cè)為陰性[12]，表明該病毒可能不是通過(guò)鼻分泌物在動(dòng)物之間傳播的。中國(guó)在商品化的血清中檢測(cè)出HNV核酸[16]，揭示HNV可能垂直傳播給胎牛。2021年在中國(guó)廣東蜱中發(fā)現(xiàn)HNV新亞型[17]，但蜱蟲(chóng)可能只是病毒的傳播載體，而不是病毒的自然宿主。

3 HNV的檢測(cè)診斷

目前，黃病毒科病毒的檢測(cè)方法已得到發(fā)展和推廣，可分為基于抗原、抗體的免疫學(xué)檢測(cè)方法和基于核酸序列的分子生物學(xué)檢測(cè)方法兩類(lèi)[40]。免疫學(xué)方法包含酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、中和抗體試驗(yàn)(VNT)、熒光素酶免疫沉淀反應(yīng)系統(tǒng)(luciferase immunoprecipitation systems,LIPS)等[25]。分子學(xué)方法有直接測(cè)序、PCR、特異性探針雜交法等。

HNV的鑒定及檢測(cè)采用何種方法主要取決于實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)有條件及目的。成熟的免疫學(xué)方法對(duì)試驗(yàn)條件要求不高，對(duì)臨床而言，免疫學(xué)檢測(cè)方法提供了快速、簡(jiǎn)便、高效的方法；評(píng)估病毒在動(dòng)物種群中受感染的比率及感染既往史，免疫學(xué)(血清學(xué))調(diào)查可提供比核酸檢測(cè)更真實(shí)的結(jié)果。對(duì)于流行病學(xué)研究而言，確定病毒基因型、準(zhǔn)確定位到病毒亞型的核酸檢測(cè)方法也是必需的。每種方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，所有這些方法都能正確辨別病毒基因組別，但只有核苷酸測(cè)序能有效區(qū)分病毒亞型。傳統(tǒng)檢測(cè)方法結(jié)合多組學(xué)聯(lián)合分析可更全面、更系統(tǒng)、更深入地研究新發(fā)病毒的生物學(xué)特征及其感染宿主后的發(fā)病機(jī)理，能為病毒的異質(zhì)性特征分析、新型靶向藥物開(kāi)發(fā)和疫苗研發(fā)提供更為可靠的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

3.1 分子生物學(xué)診斷

Elia等[31]利用針對(duì)5′-UTR基因區(qū)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR探針?lè)òl(fā)現(xiàn)在配對(duì)的血清和肝臟樣本中病毒載量之間存在正相關(guān)現(xiàn)象[34]，表明病毒血癥水平可能反映了肝臟中的病毒量。

針對(duì)新型、未知病毒或變異較活躍的病毒，如丙型肝炎病毒，高通量組學(xué)測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)分子生物方法相比具有顯著優(yōu)勢(shì)，僅需投入少量核酸即可構(gòu)建文庫(kù)得到大量數(shù)據(jù)，是科學(xué)研究中強(qiáng)有力的工具，HNV就是基于高通量組學(xué)測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行深入研究的[5,41-42]。隨著高通量組學(xué)方法的快速發(fā)展，先前報(bào)道的HNV保守引物已不適用于新發(fā)現(xiàn)的HNV基因亞型的檢測(cè)，需研究者不斷更新檢測(cè)方法。

3.2 免疫學(xué)診斷

ELISA是利用表達(dá)重組蛋白作為抗原，抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)顯色來(lái)檢測(cè)血清中病毒的抗體水平[43]。ELISA方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、時(shí)間短、效率高，適用于臨床檢測(cè)數(shù)量較多的血清樣品[44]，以及牛羊群HNV的流行病學(xué)調(diào)查，目前HNV的ELISA檢測(cè)研究還完全空白。

有研究者構(gòu)建HNVNS3基因的LIPS檢測(cè)方法[22]，但該方法與馬丙型肝炎病毒存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象，在此之前也有報(bào)道馬丙型肝炎病毒NS3融合蛋白與牛血清樣本產(chǎn)生免疫反應(yīng)[10]，因此免疫學(xué)檢測(cè)方法也存在不足之處。

4 HNV的預(yù)防控制

伴隨養(yǎng)殖模式多樣化、養(yǎng)殖密度高、從業(yè)人員素質(zhì)參差不齊、對(duì)HNV沒(méi)有足夠的認(rèn)識(shí)，HNV防控形勢(shì)還遠(yuǎn)不盡如人意。截至目前，既無(wú)有效的治療方法，又無(wú)免疫預(yù)防制劑用來(lái)防控HNV。

控制HNV的主要目標(biāo)是為了進(jìn)一步預(yù)防畜群出現(xiàn)感染或持續(xù)性感染，但尚無(wú)經(jīng)濟(jì)可行的控制措施?？刂艸NV首先需通過(guò)檢疫篩查和淘汰感染動(dòng)物，畜群要避免引入感染動(dòng)物，這個(gè)策略成本略高，因其需要對(duì)畜群進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查并盡量把陽(yáng)性動(dòng)物隔離，使用核酸探針和RT-PCR可能更敏感，但成本較高。另一種方法是只允許免疫成年動(dòng)物引入畜群，但目前尚無(wú)HNV的預(yù)防制劑。

HNV的防控策略很大程度上依賴(lài)于嚴(yán)格的生物安全。HNV可能通過(guò)血液、垂直傳播及節(jié)肢動(dòng)物叮咬途徑感染牛，養(yǎng)殖場(chǎng)噴灑殺蟲(chóng)劑滅蚊和清除蚊及蜱等的滋生可有效減少HNV的感染；群體注射疫苗時(shí)應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)控，杜絕注射針頭的交叉使用；此外做好環(huán)境消毒，建立經(jīng)濟(jì)、快速的檢測(cè)方法，及時(shí)監(jiān)測(cè)、發(fā)現(xiàn)并隔離病牛，加強(qiáng)HNV的流行病學(xué)研究是預(yù)防和控制HNV傳染的重要措施。

5 小結(jié)與展望

在過(guò)去的十年中，已在不同動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了HCV同源病毒，極大促進(jìn)了對(duì)HCV起源和進(jìn)化的理解，并有利于在同源動(dòng)物模型中研究HCV感染的發(fā)病機(jī)制和免疫應(yīng)答能力。特別需要指出的是，HCV具有很強(qiáng)的變異能力[45]，可能導(dǎo)致感染率的增加或不可預(yù)測(cè)的宿主適應(yīng)性，可能是導(dǎo)致其跨種傳播的重要因素。目前，尚不清楚HNV是否會(huì)感染人類(lèi)，而全世界牛的種群規(guī)模巨大，存在多種直接和間接(即食源性)感染途徑，突出了其作為病毒宿主的作用，可能需對(duì)這些新病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)和詳細(xì)描述，以排除其對(duì)公共衛(wèi)生造成的風(fēng)險(xiǎn)。

與其他病毒相比，HNV的研究進(jìn)展甚微，除了其為2015年新發(fā)現(xiàn)的病毒以外，主要有以下原因：①HNV感染通常是無(wú)癥狀或非致命性的；②丙型肝炎病毒在細(xì)胞中的增殖能力有限，HNV的分離培養(yǎng)體系還沒(méi)有完善；③HNV動(dòng)物模型尚未建立起來(lái)，這些因素給研究者們?cè)贖NV上開(kāi)展工作帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。因此，建立和優(yōu)化HNV的分離培養(yǎng)體系及動(dòng)物模型是需要解決的首要問(wèn)題。除此之外，今后的研究方向可分為以下幾點(diǎn)：①建立完善且高效的診斷方法，如ELISA檢測(cè)法；②加強(qiáng)HNV的基因結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)研究；③建立系統(tǒng)的HNV流行病學(xué)資料；④加強(qiáng)對(duì)病毒溯源、變異及演化機(jī)制方面的研究，明確病毒的傳播規(guī)律及病毒變異與致病性之間的關(guān)系；⑤加強(qiáng)HNV與牛肝臟疾病的相關(guān)性研究，揭示HNV的入侵途徑、致病機(jī)制、逃逸機(jī)制、免疫機(jī)制等；⑥研發(fā)高效的預(yù)防和治療藥品，如疫苗等。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)和鑒定新的病原微生物的能力越來(lái)越強(qiáng)。從發(fā)現(xiàn)HCV的存在到鑒定其病毒序列經(jīng)歷了14 年，到2003年科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)并鑒定嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)耗費(fèi)了幾個(gè)月[46]，而如今鑒定SARS-CoV-2只用了不到1個(gè)月[47-48]。未來(lái)是否還會(huì)出現(xiàn)新的致病性病原微生物難以預(yù)測(cè)，但目前的科學(xué)技術(shù)讓人們有信心也有能力盡早發(fā)現(xiàn)鑒定病原微生物，通過(guò)進(jìn)一步研究來(lái)控制其感染對(duì)人類(lèi)或動(dòng)物健康帶來(lái)的危害。