絨山羊毛囊發(fā)育中非編碼RNA的研究進(jìn)展

王 東，梁加越，王笑冰，馮 娟，張 茹，夏慧巖，肖紅梅

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010010；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010010；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010010)

絨山羊是中國重要的絨肉兼用型山羊品種，生產(chǎn)的羊絨以其特有的優(yōu)良品質(zhì)享譽(yù)國內(nèi)外，被稱為“纖維鉆石”，在國民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。毛囊是皮膚的衍生物，是形成毛被的重要器官。絨山羊的毛囊結(jié)構(gòu)根據(jù)形成的時(shí)間先后及不同的功能特點(diǎn)分為初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊。初級(jí)毛囊由上皮細(xì)胞和真皮層細(xì)胞分化、發(fā)育而來，生長有髓的粗毛；次級(jí)毛囊由初級(jí)毛囊發(fā)育形成，生長無髓的羊絨。它們的成熟結(jié)構(gòu)由結(jié)締組織鞘、內(nèi)根鞘、外根鞘、毛球和毛干等構(gòu)成。初級(jí)毛囊的周期性變化不明顯，而次級(jí)毛囊具有明顯的周期變化，歷經(jīng)生長期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen)[1-2]。在生長期，核因子κB(NFκB)和Wnt/β-cantenin信號(hào)通路首先被激活，上皮細(xì)胞數(shù)目增加，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)[3]，形成基板；同時(shí)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路中的成纖維細(xì)胞生長因子10(fibroblast growth factors 10，F(xiàn)GF10)[4]、和FGF20[5]以及骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路中的骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)、BMP7[6]等信號(hào)分子被釋放使成纖維細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移能力增強(qiáng)并定向聚集，加快真皮聚集內(nèi)陷形成毛乳頭細(xì)胞[7]。隨著毛乳頭細(xì)胞的形成，Wnt信號(hào)通路激活了基板上層一側(cè),SHH(Sonic Hedgehog)信號(hào)通路，誘導(dǎo)毛母質(zhì)細(xì)胞快速增殖分化并在其他信號(hào)通路的參與下，向真皮層延伸形成毛干和內(nèi)根鞘、外根鞘，毛囊形態(tài)和結(jié)構(gòu)逐漸形成。因此，高表達(dá)的Wnt信號(hào)通路和SHH信號(hào)通路成為了毛囊生長期的重要標(biāo)志物[8]。毛囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)是一種動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)生長期維持一段時(shí)期后，在表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、TGF-β等信號(hào)通路的作用下[9]，Wnt信號(hào)通路激活被阻斷，并誘導(dǎo)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)，毛囊可再生部位的毛母質(zhì)細(xì)胞增殖減少，外根鞘角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡[10]，毛球發(fā)生萎縮，毛干停止分化，進(jìn)入退行期。當(dāng)細(xì)胞活性水平低下時(shí)，毛囊便進(jìn)入休止期。在休止期[11]，毛乳頭細(xì)胞處于休止?fàn)顟B(tài)，毛囊完全失去活性[12]。在休止期結(jié)束時(shí)，Notch、Wnt等信號(hào)通路作用使毛球開始再生，毛囊干細(xì)胞分化并增殖，并且毛囊再生部分重建，毛母質(zhì)細(xì)胞新一輪增生，進(jìn)入下一個(gè)生長周期。此時(shí)，由于產(chǎn)生新毛干，將杵狀毛干從皮膚表面推出，直至脫落[13]。毛囊的周期性變化表明間充質(zhì)細(xì)胞是毛囊發(fā)生的誘導(dǎo)者，上皮細(xì)胞是應(yīng)答者，二者間通過信號(hào)的傳導(dǎo)刺激了毛囊的周期性變化[14]。

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，既包括已知功能的核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和小RNA(microRNA，miRNA)，還包括一些未知功能的RNA。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，以及新的分子檢驗(yàn)和分析方法的創(chuàng)新，發(fā)現(xiàn)了諸多除基因和蛋白水平外對(duì)絨山羊毛囊發(fā)育起調(diào)控作用的ncRNA。這些ncRNA的發(fā)現(xiàn)，為絨山羊毛囊發(fā)育及絨毛生長調(diào)控機(jī)理的研究提供了新的機(jī)遇。文章就miRNA、lncRNA及circRNA的發(fā)現(xiàn)和形成過程以及其在絨山羊毛囊發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)及靶向調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)行總結(jié)，為進(jìn)一步挖掘調(diào)控毛囊發(fā)育的節(jié)點(diǎn)ncRNA和信號(hào)通路，揭示絨山羊絨毛品質(zhì)調(diào)控機(jī)理提供參考。

1 絨山羊毛囊發(fā)育中miRNA的研究進(jìn)展

1.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)及形成

miRNA是Lee等[15]在1993年于秀麗隱桿線蟲內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類長18～25 nt的ncRNA，廣泛存在于各種生物中，調(diào)節(jié)生物體生長、發(fā)育和凋亡等過程[16]，被miRNA調(diào)控的基因表達(dá)存在復(fù)雜的組合模式，具有時(shí)空特異性[17-20]，所以對(duì)miRNA功能的研究主要是通過轉(zhuǎn)錄表達(dá)及測(cè)序方式進(jìn)行。它通過5′-端的6～8個(gè)種子序列堿基與其靶向基因3′-非翻譯區(qū)堿基結(jié)合成互補(bǔ)序列，引起靶向mRNA降解或抑制翻譯調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而調(diào)控絨山羊毛囊發(fā)育及絨毛生長，屬于轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控因子(圖1)[21]。

圖1 miRNA形成的經(jīng)典途徑[21]Fig.1 The classical pathway of miRNA biogenesis[21]

1.2 miRNA在絨山羊毛囊發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)及靶向調(diào)控機(jī)制

隨著高通量測(cè)序技術(shù)和芯片等技術(shù)的不斷發(fā)展，有關(guān)調(diào)控絨山羊毛囊發(fā)育的miRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。 有研究指出，利用芯片技術(shù)得到了miR-24、miR-199a、miR-200b等15個(gè)可能在毛囊生長發(fā)育中起上調(diào)作用或直接靶向Wnt信號(hào)阻斷通路的miRNAs[22]；利用高通量測(cè)序鑒定了可能在毛囊發(fā)育和絨毛的生長中起重要調(diào)控作用的316個(gè)miRNAs，并發(fā)現(xiàn)miR-368、miR-668等22個(gè)新miRNAs[23]。有研究報(bào)道，Solexa測(cè)序比較山羊和綿羊皮膚miRNA轉(zhuǎn)錄組，鑒定了1 910個(gè)已知miRNAs和2 261個(gè)新的成熟miRNAs，并在此基礎(chǔ)上鑒定出在兩個(gè)文庫中的差異表達(dá)的107個(gè)新的成熟miRNAs和1 246個(gè)已知miRNAs[24]，此結(jié)果為探究與絨山羊毛囊發(fā)育相關(guān)的miRNA及進(jìn)一步闡明miRNA在絨山羊毛囊發(fā)育中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)；采用多組學(xué)方法鑒定了毛囊生長期與退行期表達(dá)的307個(gè)新的成熟miRNAs和差異表達(dá)的72個(gè)miRNAs，豐富了絨山羊的miRNA庫，有助于更好地了解參與調(diào)控絨山羊毛囊生長和發(fā)育的miRNA的分子機(jī)制[25]。另外，通過研究褪黑素對(duì)絨山羊毛囊發(fā)育的影響發(fā)現(xiàn)，在毛囊興盛前期，miRNA的下調(diào)能夠提高毛囊細(xì)胞活性，抑制毛囊細(xì)胞凋亡，推測(cè)miRNA可與褪黑素相互作用，調(diào)控毛囊生長周期，從而影響絨山羊絨毛生長[26]。所以，miRNA不僅在毛囊中表達(dá)，而且具有選擇表達(dá)性的特點(diǎn)[27]，并與其他因子相互作用構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控毛囊生長發(fā)育相關(guān)靶基因的表達(dá)。

在皮膚毛囊生長發(fā)育過程中，miRNA及其靶向調(diào)控基因形成了多樣化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使得不同miRNA或同一miRNA具有多樣化的靶基因。miRNA通過所在的信號(hào)通路負(fù)調(diào)控靶向基因從而抑制或促進(jìn)毛囊的生長和發(fā)育。在Wnt/β-cantenin信號(hào)通路中，miR-214靶向抑制Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖導(dǎo)致毛發(fā)形成減少[28]。有證據(jù)指出，miR-31的靶標(biāo)為角蛋白16(KRT16)、KRT17、同源轉(zhuǎn)錄因子DLX3和FGF10，其過表達(dá)和缺失影響著BMP和Wnt/β-cantenin信號(hào)通路的活躍程度[29]。miR-let-7a的靶標(biāo)為胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、C-myc和FGF5，通過調(diào)節(jié)它們所對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路影響毛囊的生長發(fā)育[30]。miR-195-5p在mRNA水平上抑制低密度脂蛋白相關(guān)受體蛋白(LRP6)的表達(dá)，調(diào)控毛乳頭細(xì)胞Wnt/β-catenin通路的活化[31]。此外，基于毛乳頭細(xì)胞構(gòu)建的miR-125b的過表達(dá)模型和抑制表達(dá)模型證實(shí)了miR-125b影響FGF5、IGF-1、SHH、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、肌節(jié)同源框基因家族基因MSX2、淋巴細(xì)胞增強(qiáng)結(jié)合因子-1(LEF-1)、FGF7、頭蛋白NOGGIN、BMP2、BMP4、TGF-β1和β-catenin的表達(dá)，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-125b[32]與調(diào)控毛的長度的FGF5[33]和影響絨毛生長速度的TNF-α[34]之間有著直接的作用。TGF-β信號(hào)通路具有調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、凋亡、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的形成等多種重要的功能。有研究根據(jù)miR-1298-5p與TGF-βR1基因在毛囊周期中的表達(dá)趨勢(shì)，推測(cè)miR-1298-5p可能通過負(fù)向調(diào)控TGF-βR1基因在毛囊不同時(shí)期的表達(dá)，來調(diào)控絨山羊絨毛的生長[35]。可見，miRNA在絨山羊毛囊發(fā)育中通過抑制與毛囊再生相關(guān)基因及相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)鍵分子調(diào)控毛囊周期以及毛囊的再生能力。在毛囊發(fā)育的不同階段，miRNA的表達(dá)水平也存在明顯差異，miRNA表達(dá)的時(shí)空特異性更加彰顯了其在毛囊生長發(fā)育中占據(jù)的重要地位。

2 絨山羊毛囊發(fā)育中l(wèi)ncRNA的研究進(jìn)展

2.1 lncRNA的發(fā)現(xiàn)及形成

lncRNA是一類長度>200 nt的ncRNA分子，最初被看作是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有任何生物學(xué)功能[36]。然而，1984年，Pachnis等[37]在小鼠中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)真核lncRNA-H19，并在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)，開啟了lncRNA參與生命活動(dòng)過程并發(fā)揮重要作用的一系列研究，不同物種大量的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，而且證實(shí)其具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，經(jīng)過剪接，具有polyA尾巴與啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)[38-39]，參與細(xì)胞增殖與分化[40]、表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等[41-43]。大多數(shù)lncRNA在組織分化發(fā)育中具有特異性的時(shí)空表達(dá)[44-45]。lncRNA有4種產(chǎn)生模式(圖2)[46]：①蛋白質(zhì)編碼基因突變導(dǎo)致框架結(jié)構(gòu)斷裂，從而產(chǎn)生lncRNA(圖2A)；②同一序列復(fù)制2次，使相鄰的ncRNA產(chǎn)生重復(fù)序列(圖2B)；③轉(zhuǎn)座原件序列插入之后，可產(chǎn)生具有功能的lncRNA(圖2C)；④非編碼基因通過逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制，也會(huì)產(chǎn)生lncRNA(圖2D)。

圖2 形成lncRNA的主要模式[46]Fig.2 The origins of lncRNAs[46]

2.2 lncRNA在絨山羊毛囊發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)及靶向調(diào)控機(jī)制

通過不同的研究方法對(duì)lncRNA進(jìn)行篩選及功能驗(yàn)證，揭示了lncRNA多樣化的作用機(jī)制。截至目前，發(fā)現(xiàn)影響毛囊發(fā)育的lncRNA有很多，但大部分lncRNA的作用主要是通過調(diào)控毛囊相關(guān)的信號(hào)通路以及相關(guān)基因的甲基化等來實(shí)現(xiàn)的。如應(yīng)用lncRNA微陣列技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，Wnt通路中一些差異表達(dá)的lncRNA可能通過表觀遺傳修飾來調(diào)節(jié)Wnt通路抑制因子-1(WIF-1)和BMP，從而抑制毛乳頭細(xì)胞中的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，降低毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)毛囊重建的能力。其中，lncRNA-000133、lncRNA-H19、lncRNA-HOTAIR在絨山羊毛囊發(fā)育生長期的表達(dá)水平顯著高于休止期[38]。通過對(duì)其靶基因的啟動(dòng)子甲基化分析表明，lncRNA-H19、lncRNA-HOTAIR、lncRNA-000133這3個(gè)靶基因的啟動(dòng)子區(qū)在休止期高度甲基化可促使其在絨山羊次級(jí)毛囊中的表達(dá)受到抑制。對(duì)羊絨周期性生長特異性lncRNA的篩選研究發(fā)現(xiàn)，生長期和休止期有6 127個(gè)lncRNAs表達(dá)，其中54個(gè)表達(dá)存在顯著差異，有32個(gè)上調(diào)，22個(gè)下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)的lnc5479進(jìn)行靶向敲除發(fā)現(xiàn)其與毛囊的生長期密切相關(guān)，并且參與角蛋白的形成[47]，該結(jié)果為進(jìn)一步探究lncRNA的功能和特異的lncRNA在調(diào)控絨山毛囊發(fā)育及絨毛生長中的作用提供了理論依據(jù)。有研究報(bào)道，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在次級(jí)毛囊休止期和生長期有13個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，其中l(wèi)ncRNA-599618、lncRNA-599556等6個(gè)lncRNAs均在毛囊生長期的Wnt信號(hào)通路中高表達(dá)，lncRNA-599528等4個(gè)lncRNAs在休止期高表達(dá)，這表明生長期高表達(dá)的6種lncRNAs可能與Wnt信號(hào)通路協(xié)同作用，促進(jìn)毛囊基板形成及次級(jí)毛囊細(xì)胞(HFSC)的激活、分化和增殖，從而促進(jìn)絨毛纖維生長，而休止期高表達(dá)的lncRNA可能抑制HFSC的分化，從而使毛囊處于休眠狀態(tài)[48]，該結(jié)果為進(jìn)一步揭示lncRNA在其他哺乳動(dòng)物皮膚毛囊中的周期轉(zhuǎn)換機(jī)制提供了借鑒。隨著多組學(xué)研究的發(fā)展，有研究采用多組學(xué)方法系統(tǒng)地鑒定了絨山羊毛囊生長期與退行期中表達(dá)的1 122個(gè)已知的lncRNAs和403個(gè)新的lncRNAs，通過差異分析尋找到173個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs。聯(lián)合miRNA研究，建立lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在毛囊退行期lnc108635596通過miR-873介導(dǎo)靶基因TGF-β1和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)[25]，說明lncRNA和miRNA在絨山羊絨毛生長過程中共同作用，并作為miRNA的海綿調(diào)節(jié)與毛囊的發(fā)生發(fā)育及凋亡相關(guān)的基因表達(dá)。從競(jìng)爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)角度研究，篩選出絨山羊生長期次級(jí)毛囊中4個(gè)顯著上調(diào)的lncRNAs，9個(gè)顯著下調(diào)的lncRNAs[49]，所構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)表明，在山羊絨毛生長過程中，lncRNA475074可能通過與miR-653-3p競(jìng)爭調(diào)控端粒聚合酶3(TANK3)的表達(dá)。因此，ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的建立為進(jìn)一步研究絨山羊次級(jí)毛囊中l(wèi)ncRNA的功能提供了條件。還有研究指出，lncRNA與褪黑激素有密切關(guān)系，褪黑激素通過上調(diào)lncRNAMTC的表達(dá)來激活NF-κB信號(hào)通路，并對(duì)lncRNAMTC對(duì)應(yīng)的靶基因的表達(dá)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，lncRNAMTC的靶基因腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3)表達(dá)明顯下調(diào)[50]，而TNFAIP3(A20)基因的下調(diào)有利于激活NF-κB信號(hào)通路[51]。也有證據(jù)證明，lncRNA5322通過調(diào)控miR-21介導(dǎo)PI3K-Akt信號(hào)通路，上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的表達(dá)促進(jìn)毛囊干細(xì)胞的增殖和表皮分化[52]。由此可見，lncRNA不僅在絨山羊毛囊細(xì)胞的增殖、凋亡和分化及絨毛生長中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，而且在其他物種如細(xì)毛羊、小鼠等哺乳動(dòng)物的毛囊發(fā)育中也起到同樣的作用[41]，通過參與調(diào)控毛囊生長相關(guān)靶基因的表達(dá)與多種信號(hào)通路NF-κB、Wnt、PI3K-Akt等互作發(fā)揮生物學(xué)功能。但目前對(duì)于lncRNA調(diào)控絨山羊毛囊發(fā)育及絨毛生長相關(guān)的研究主要集中在相關(guān)lncRNA的篩選、鑒定等方面，其調(diào)控機(jī)制仍不明確。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，深入揭示lncRNA調(diào)控絨山羊毛囊發(fā)育及絨毛生長分子機(jī)制成為必然，從而為絨山羊絨毛品質(zhì)的提高提供新的研究方向。

3 絨山羊毛囊發(fā)育中circRNA的研究進(jìn)展

3.1 circRNA的發(fā)現(xiàn)及形成

circRNA是Diener[53]于1971年在植物類病毒中首次發(fā)現(xiàn)，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一類新型的內(nèi)源性ncRNA[54]，由單個(gè)mRNA前體通過外顯子和內(nèi)含子的5′-端與3′-端反向剪接而成，存在于高等真核生物細(xì)胞內(nèi)[55]，富含在miRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用，即通過內(nèi)源性競(jìng)爭機(jī)制，解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平。circRNA表達(dá)比其他ncRNA穩(wěn)定，有組織特異性和物種保守性的特點(diǎn)[56]，不易被RNA外切酶降解，但可通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)的介導(dǎo)降解[57]。circRNA按來源可分為外顯子circRNA(exon circRNA)、內(nèi)含子circRNA(intron circRNA)、外顯子與內(nèi)含子結(jié)合的circRNA(exon-intron circRNA)以及基因間circRNA(interegenic circRNA)[58]。但大多數(shù)為外顯子circRNA[59]。circRNA的功能多樣，除了作為miRNA海綿調(diào)控靶基因表達(dá)外[60]，還可與RNA結(jié)合蛋白(RBP)形成RNA-蛋白復(fù)合物，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，甚至少數(shù)的circRNA可以編碼、翻譯為蛋白質(zhì)[61-62]。circRNA的產(chǎn)生有2種模型，包括套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化模型和內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化模型(圖3)。由于RNA發(fā)生部分折疊RNA前體在轉(zhuǎn)錄過程中拉近相鄰的外顯子，使得下游外顯子的剪接供體(splice donor，SD)的3′-端和上游外顯子的剪接受體(splice acceptor，SA)的5′-端結(jié)合，致使外顯子跳躍(exon skipping)，產(chǎn)生包含外顯子的內(nèi)部拼接套索，去除內(nèi)含子序列形成具有2個(gè)外顯子的circRNA。RNA前體上2個(gè)不相鄰的內(nèi)含子互補(bǔ)配對(duì)，使得與該內(nèi)含子相連的2個(gè)外顯子相互接近，下游外顯子的剪接供體3′-端和上游外顯子的剪接受體5′-端結(jié)合，反向剪接形成套索，再切除內(nèi)含子，形成circRNA[57](圖3)。

圖3 索尾插接(Backsplicing)形成模型和circRNA形成機(jī)制[57]Fig.3 Backsplicing formation model and circRNA formation mechanism[57]

3.2 circRNA在絨山羊毛囊發(fā)育中時(shí)空表達(dá)及靶向調(diào)控機(jī)制

circRNA可以作為miRNA的海綿，其與mRNA競(jìng)爭miRNA的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)，circRNA在絨山羊毛囊發(fā)育中的作用機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。在絨山羊次級(jí)毛囊的毛干中鑒定出circRNA-1926，經(jīng)過分析驗(yàn)證，揭示circRNA-1926可通過miR-148a/b-3p的介導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶19(CDK19)基因的表達(dá)，促進(jìn)絨山羊毛囊干細(xì)胞向次級(jí)毛囊分化[63-64]，表明circRNA可通過miRNA的介導(dǎo)調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)來調(diào)控毛囊發(fā)育。為探究不同物種特異表達(dá)的circRNA，通過比較分析遼寧絨山羊和內(nèi)蒙古絨山羊中的轉(zhuǎn)錄組序列，鑒定出絨山羊皮膚中存在13 320個(gè)circRNAs，其中差異表達(dá)的有32個(gè)。 經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證得到4個(gè)circRNAs，即circRNA128、circRNA3620、circRNA4154和circRNA6854[65]。通過高通量測(cè)序獲得45、55、65和75 d絨山羊胚胎毛囊中circRNA的表達(dá)譜，鑒定出21 784個(gè)circRNAs，通過GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析表明，與毛囊發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路為Notch信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路，將75和45 d的circRNA與miRNA和mRNA數(shù)據(jù)庫結(jié)合，構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)出102對(duì)相互作用的circRNA-miRNA和126對(duì)miRNA-mRNA；通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證了其中的circRNA3236和chi-miR-27b-3p、circRNA3236和chi-miR-16b-3p具有靶向關(guān)系[66]，表明circRNA和特定的miRNA具有靶向關(guān)系，circRNA可通過miRNA調(diào)控靶基因表達(dá)。另外，在對(duì)湖羊的circFTO和circCSPP1與miR-148a和miR-10a的靶向關(guān)系研究中也得到了驗(yàn)證，即此2個(gè)circRNAs可通過結(jié)合miRNA正向調(diào)節(jié)靶基因BMP7的表達(dá)而促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞的增殖，從而影響毛囊的生長發(fā)育[67]。由此可見，不管是絨山羊胎兒皮膚毛囊中circRNA的表達(dá)譜的建立還是circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，均為今后有關(guān)circRNA調(diào)控絨山羊毛囊發(fā)育機(jī)制的研究提供了方法和思路。這些研究結(jié)果對(duì)于后續(xù)進(jìn)行絨山羊皮膚毛囊發(fā)育中circRNA的作用及其所在信號(hào)通路研究奠定了基礎(chǔ)。但由于circRNA-miRNA-mRNA形成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)在毛囊生長發(fā)育中的研究還處于起始階段其調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，因此circRNA在絨山羊毛囊生長發(fā)育中的相關(guān)信號(hào)通路及靶基因功能還需進(jìn)一步深入研究。

4 小 結(jié)

ncRNA的發(fā)現(xiàn)及其功能的探究，為基因組無法詮釋的復(fù)雜性的生物發(fā)育機(jī)制提供了新的思路。由于目前對(duì)ncRNA在絨山羊毛囊發(fā)育方面的研究甚少，缺乏相應(yīng)功能的數(shù)據(jù)庫，且研究大部分集中于篩選和鑒定及一些調(diào)控通路的網(wǎng)絡(luò)的建立，技術(shù)比較單一，而且絕大部分如miRNA、lncRNA、circRNA的功能及其重要的調(diào)控機(jī)制仍不夠清晰。因此，在以后的ncRNA研究中，利用毛囊單細(xì)胞測(cè)序、芯片等技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組化、RNA干擾、過表達(dá)、原位雜交進(jìn)行亞細(xì)胞定位、CRISPR/Cas9、酶聯(lián)免疫等實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證，結(jié)合全基因組序列及蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)更多有關(guān)絨山羊毛囊發(fā)育的ncRNA，建立毛囊發(fā)育3個(gè)發(fā)育階段的ncRNA數(shù)據(jù)庫和ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深度挖掘調(diào)控毛囊發(fā)育的節(jié)點(diǎn)ncRNA和信號(hào)通路，同時(shí)通過表型遺傳探究主要的信號(hào)通路(如Wnt/β-cantenin)與其他通路的關(guān)聯(lián)性及受體與配體的相互作用，對(duì)揭示毛囊生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制起重要作用。相信隨著研究的深入及生物技術(shù)的日益發(fā)展，一些與絨山羊毛囊發(fā)育相關(guān)的未知ncRNA將逐漸被發(fā)現(xiàn)，其功能也會(huì)被深度解析。