正交試驗優(yōu)選肋柱花中獐牙菜苦苷的提取工藝研究

額尼榮貴　于紅珍　巴根那　付明海

【摘 要】 目的：確定蒙藥肋柱花中獐牙菜苦苷的最優(yōu)提取工藝條件。方法：以獐牙菜苦苷作為指標性成分，采用HPLC法和正交試驗來驗證獐牙菜苦苷的最佳提取工藝，選取乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)4個因素，設計L9（3⁴）正交試驗，確定肋柱花中獐牙菜苦苷的最佳提取工藝。結果：肋柱花中獐牙菜苦苷的最佳提取工藝為乙醇提取濃度60%，料液比1∶10，回流提取1次，每次提取2 h。結論：優(yōu)化得到的肋柱花獐牙菜苦苷提取工藝參數(shù)合理可行，質量穩(wěn)定可控。

【關鍵詞】 肋柱花;獐牙菜苦苷;正交試驗;提取工藝

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2022）15-0030-05

Optimization of Extraction Process of Swertiamarin fromLomatogonium rotatumby Orthogonal Design

ENI Ronggui^1，2YU Hongzhen¹BA Genna¹FU Minghai^1，2*

1.School of Mongolian Medicine， Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao 028000，China;2.NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicine（Mongolian Medicine），? Tongliao 028000，China

Abstract：Objective To determine the optimal extraction conditions of swertiamarin fromLomatogonium rotatum（L.）Fries ex Nym. Methods swertiamarin was chosen as the examined component， HPLC and orthogonal design were used to optimize the extraction process ofLomatogonium rotatum. The L9（3⁴）orthogonal test was designed to determine the optimal extraction process of swertiamarin fromLomatogonium rotatumby four extraction conditions ethanol concentration， ethanol volume， extraction time and extraction frequency. Results The optimal extraction conditions of swertiamarin were as follows： ethanol concentration 60%， solid-liquid ratio 1∶10， reflux extraction once for 2 hours each time. Conclusion The optimized extraction parameters of swertiamarin fromLomatogonium rotatumwere reasonable and feasible， the quality was stable and controllable.

Key words：Lomatogonium rotatum; Swertiamarin; Orthogonal Design; Extraction Process

肋柱花Lomatogonium rotatum（L.）Fries ex Nym.是防治各種肝膽疾病的特色傳統(tǒng)內服蒙藥材，蒙語名為哈比日跟地格達，全草入藥。味極苦，性寒、鈍、糙、輕、燥，具有去除體內“協(xié)日”、清除內熱、健胃、愈傷的功效。用于“協(xié)日”熱、疫癘、流感、肝膽熱、中暑頭熱、皮膚紅腫發(fā)黃等，在蒙醫(yī)臨床上主要用于治療肝膽類消化系統(tǒng)疾病^[1]。肋柱花廣泛分布于我國的內蒙古、西藏、青海、甘肅、新疆等地的山坡及叢林中^[2]。1998年收錄于衛(wèi)生部藥品標準蒙藥分冊，與山苦荬等配伍制成利膽二十八味散，用于降解膽囊“協(xié)日”熱^[3]。另，因其具有清肝膽熱作用，可以作為君藥配伍組成諸如地格達-15、地格達-20、地格達-25等方劑，用于治療肝膽熱、目膚紅腫發(fā)黃、膽痞和“協(xié)日”滯瘀等導致臟器損傷的臨床常見病癥^[4]。此外，肋柱花與黃連、梔子、瞿麥配伍組成蒙藥方劑肋柱花四味湯（又稱地格達-4），用于咽痛、肝膽熱、血熱相搏、口渴煩躁等病癥^[2]。據(jù)統(tǒng)計肋柱花入藥蒙藥方劑共有24種，其中肋柱花以君藥入藥方劑有3種，以臣藥入藥4種，以佐藥入藥16種，以使藥入藥1種，是有別于其他民族醫(yī)藥用藥習慣的特色蒙藥道地藥材^[4]?，F(xiàn)代研究^[5-8]發(fā)現(xiàn)，肋柱花主要藥理作用有保肝護膽、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗菌、減肥消脂作用。其化學成分主要以黃酮類、三萜類、環(huán)烯醚萜及裂環(huán)烯醚萜為主^[9]。裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物是一類具有保護肝臟、降低體內血脂血糖、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、對神經系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)有保護作用的天然活性分子^[10]。獐牙菜苦苷屬環(huán)烯醚萜類化合物，是肋柱花主要苦味活性成分?，F(xiàn)代藥理研究^[11-12]表明，獐牙菜苦苷具有保護肝臟、調節(jié)血脂異常、抗糖尿病、抗炎鎮(zhèn)痛和降脂等多種藥理作用，可能是肋柱花藥材的主要藥效指標性成分。而目前對肋柱花活性成分的提取工藝和質量控制研究仍未見報道。文獻顯示，乙醇濃度、提取液用量、提取次數(shù)和時間是影響環(huán)烯醚萜類提取物的重要因素，可直接影響有效成分在提取物中的提取效果。因此，本文以獐牙菜苦苷作為活性指標成分，結合HPLC法和乙醇濃度、提取液用量、提取時間、提取次數(shù)等4個單因素考察結果，設計正交L9（3⁴）試驗，確定肋柱花中獐牙菜苦苷的最佳提取工藝，為特色蒙藥材肋柱花進一步應用和開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器 本研究所用的主要儀器有Agilent 1260 Infinity ii液相色譜儀，SQP型十萬分之一分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），KQ-800E型超聲波清洗器，SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵，KDM型調溫電熱套。

1.2 主要藥品與試劑 肋柱花藥材采集于錫林郭勒盟（2020年9月25日），經內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院拉西那木吉拉教授鑒定為龍膽科肋柱花Lomatogonium rotatum（L.）Fries ex Nym的干燥全草（如圖1所示）。獐牙菜苦苷標準品（批號B21644 純度≥98%），購自原葉生物。甲醇，磷酸，無水乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 標準溶液的配置 精密稱取獐牙菜苦苷標準品2.18 mg裝置25 mL量瓶中加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度搖勻。超聲波脫氣 10 min 后再通過0.45 nm水系膜過濾，制成1 mL含0.0872 mg的溶液，進樣量為10 μL，以獐牙菜苦苷質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

2.2 色譜條件 采用高效液相色譜法;色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm）5-Micron;流動相：水-0.1%磷酸水溶液梯度洗0→70∶30，15→65∶35，25→50∶50;流速：1.0mL·min^-1;檢測波長：254 nm;柱溫：30 ℃。采用正交設計助手計算實驗結果及方差分析。

2.3 樣品中獐牙菜苦苷含量的測定 將肋柱花粉碎制成粉末，精確稱取肋柱花藥粉5 g，按照L9（3⁴）表格按照不同因素回流提取得浸膏并冷凍干燥。干燥粉末加適量甲醇溶解后，用 0.45 μL 濾膜過濾備用，按照色譜條件進行分析并計算苦味素的百分含量。

2.4 肋柱花獐牙菜苦苷提取工藝單因素實驗 藥材陰涼處晾干粉碎后，設計乙醇濃度×料液比×提取時間×提取次數(shù)4個因素的正交試驗，獲得獐牙菜苦苷的最佳提取工藝（表1）。

2.5 正交實驗及驗證 根據(jù)單因素實驗結果，選擇適宜的乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)并進行L9（3⁴）表設計正交實驗（表2）。

3 結果

3.1 肋柱花獐牙菜苦苷含量測定方法學驗證 由圖2～4可知，獐牙菜苦苷保留時間為6.775 min，得到回歸方程：y=641.66x+5.2603，線性范圍在0.213～1.298 mg/mL，相關系數(shù)為R²=0.9997;精密度實驗中RSD為0.26%，表明儀器的精密度良好;穩(wěn)定性實驗中24 h內獐牙菜苦苷含量測定結果的RSD為0.002%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定;重復性實驗中RSD為0.026%，表明重復性良好;加樣回收率實驗中RSD為0.084%。表明該法符合含量測定要求，綜上所述均滿足測定的要求。

3.2 肋柱花獐牙菜苦苷提取工藝單因素試驗

3.2.1 乙醇濃度的選擇 精密稱取肋柱花藥材粉末5份，每份5 g，乙醇用量20倍，提取次數(shù)3次，提取時間2.0 h，分別設50%、60%、70%、80%、90%乙醇 5個濃度進行提取，計算獐牙菜苦苷峰面積含量， 結果如圖4 A所示，獐牙菜苦苷含量在乙醇濃度為60%時達到峰值，故選擇60%乙醇為提取溶劑。

3.2.2 提取次數(shù)的選擇 精密稱取肋柱花藥材粉末5份，每份5 g，乙醇用量20倍，提取濃度50%，提取時間2.0 h，分別設1、2、3、4、5個次數(shù)進行提取，計算獐牙菜苦苷峰含量。如圖4 D所示，獐牙菜苦苷含量在次數(shù)2時達到峰值，故選擇2次。

3.2.3 提取時間的選擇 精密稱取肋柱花藥材粉末5份，每份5 g，乙醇用量20倍，提取濃度50%，提取次數(shù)為1次，分別設0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h等 5個時間進行提取，計算獐牙菜苦苷含量。如圖4 C所示，獐牙菜苦苷含量在時間2.0 h 時達到峰值，故選擇2.0 h為提取時間。

3.2.4 提取溶劑量的選擇 精密稱取肋柱花藥材粉末5份，每份5 g，提取時間為2.0 h，提取濃度50%，提取次數(shù)為1次，分別設1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的料液比進行提取，計算獐牙菜苦苷含量。如圖4 B所示，獐牙菜苦苷含量在倍數(shù)1∶10時達到峰值，故選擇1∶10倍量乙醇提取。

3.3 正交實驗結果 正交實驗方案及結果見表3，方差分析表見表4。結果表明，從R值和表4方差分析得知提取時間的影響最為顯著。且提取最佳工藝為A2B1C2D1，即提取濃度60%，料液比1∶10，提取時間2.0 h，提取次數(shù)2。

4 討論

肋柱花屬于地格達類蒙藥，蒙語為哈比日干地格達，是一類特色道地蒙藥材，組方或單方用于治療肝膽疾病。以肋柱花為君藥的地格達-4湯更是應用廣泛，臨床療效顯著。肋柱花主要化學成分獐牙菜苦苷為環(huán)烯醚萜類化合物，是含量最高的有效成分之一，占總比30.98%，具有保護肝臟、調節(jié)血脂異常、抗糖尿病、抗炎鎮(zhèn)痛和降脂等作用^[7]。由于環(huán)烯醚萜通常以苷的形式存在，采用不同提取溶劑或者提取方法都對藥材中的物質有影響，環(huán)烯醚萜類易被水解，性質活躍，極性較大，易溶于水、乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇等，故常用含水乙醇進行提取。郭小存等^[13]在使用不同萃取法獲得了龍膽中總環(huán)烯醚萜苷的工藝后發(fā)現(xiàn)回流提取法顯著優(yōu)于其他方法，并以回流提取法為基礎，通過正交實驗確認了最佳的萃取工藝為提取溶劑70%乙醇，提取時間2 h，料液比1∶15。黎珊等^[14]通過設計的單因素和正交試驗，優(yōu)選出在雞蛋花中總環(huán)烯醚萜的最佳萃取工藝為提取溶劑60%乙醇，提取時間1 h，料液比1∶25。張軻等^[15]以平均回收率和總環(huán)烯醚萜的平均存在量為指標，經過正交試驗的驗證得出白花蛇舌草中總環(huán)烯醚萜苷的最佳萃取工藝是提取溶劑90%乙醇，料液比1∶8，提取時間2 h，提取次數(shù)2次。因此本實驗選擇乙醇濃度，提取用量，提取時間，提取次數(shù)4個因素進行單因素實驗分析，并采用正交實驗優(yōu)化肋柱花中獐牙菜苦苷最佳提取工藝。

從單因素實驗結果來看，乙醇濃度考察中峰面積在60%時達到峰值，隨后逐漸下降。該結果與上述環(huán)烯醚萜類化合物的乙醇提取濃度接近，表明此類化合物在60%乙醇提取時含量可能最高。此外，提取次數(shù)2次時達到峰值，隨著提取次數(shù)增多含量變少，故表明此類成分可能對熱不穩(wěn)定，加熱時間越長含量越少。提取時間在0.5～1.5 h之間呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，在2.0 h時達到峰值，表明在此時間段為最佳提取時長。料液比在1∶10時到達峰值，但隨著比重的增加含量逐漸降低。正交實驗結果得出最佳提取條件為乙醇提取濃度60%，料液比1∶10，回流提取1次，每次提取時間2 h。各因素影響力順序為提取時間>乙醇濃度>提取用量>提取次數(shù)，其中提取時間和提取濃度的影響最為顯著。但因為藥物成份的復雜性，即使同一藥材不同提取物中的環(huán)烯醚萜苷含量也會出現(xiàn)不同^[15]。環(huán)烯醚萜類及苷類的化學性質并不穩(wěn)定，回流加熱時間過長也會對肋柱花中獐牙菜苦苷含量有一定的影響^[16]。準確測定提取物中的含量以及篩選出準確專一的方法，還有待進一步完善。

5 結論

肋柱花作為蒙藥特色道地藥材，單用或組方使用在治療肝膽疾病具有顯著療效，但對其主要有效成分獐牙菜苦苷的最佳制備工藝研究較少。本實驗以獐牙菜苦苷的含量為指標，結合單因素考察和正交實驗，對影響肋柱花中獐牙菜苦苷萃取的因素與條件加以優(yōu)化，得到最佳提取工藝為乙醇提取濃度60%，料液比1∶10，回流提取1次，每次提取時間2 h，為進一步綜合開發(fā)利用肋柱花藥材打下了基礎。

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（收稿日期：2021-12-04 編輯：陶希睿）