苦蕎酒中總黃酮含量的測定

安軍

摘 要：本文采用分光光度法測定苦蕎酒中的總黃酮含量。在弱堿性條件下，苦蕎酒中的黃酮類物質(zhì)與顯色劑中的三價鋁離子結(jié)合生成具有特征峰的有色絡(luò)合物，在510 nm處測其吸光度，在0～205.682 ?g，該絡(luò)合物的吸光度與黃酮類的含量成正比。通過精密度、重復(fù)性、回收率和檢出限等相關(guān)實驗均符合分析標(biāo)準(zhǔn)要求，得出苦蕎酒中總黃酮含量的檢測方法。實驗結(jié)果表明，該方法操作簡便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞：苦蕎酒;總黃酮;分光光度法

Determination of Total Flavonoids in Tartary Buckwheat Wine

AN Jun

（Hainan Yedao Wine Development Co.， Ltd.， Haikou 570100， China）

Abstract： In this paper， the content of total flavonoids in tartary buckwheat wine was determined by spectrophotometry. Under weak alkaline conditions， flavonoids in tartary buckwheat wine combined with trivalent aluminum ions to form a colored complex with characteristic peaks. Its absorbance was measured at 510 nm. At 0～205.682 ?g， the absorbance of the complex was directly proportional to the content of flavonoids. Through the precision， repeatability， recovery， detection limit and other related experiments， the detection method of total flavonoids in tartary buckwheat wine was obtained. The experimental results show that the method is simple， sensitive， accurate and reliable.

Keywords： tartary buckwheat wine; total flavonoids; spectrophotometry

苦蕎麥具有較高的營養(yǎng)價值，含有蛋白質(zhì)、生物類黃酮、多種維生素、纖維素和18種氨基酸等多種成分。此外，它還是一味藥用價值較高的中藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，苦蕎麥具有降血糖、降血脂、抗疲勞和增強免疫的功能，這都與其中所含的黃酮類化合物有關(guān)[1]。本文通過方法學(xué)相關(guān)系列實驗，采用分光光度法對苦蕎酒中的總黃酮含量進行檢測，為苦蕎酒中總黃酮的相關(guān)研究提供參考[2]。

1 材料與方法

1.1 儀器

電子天平XS205（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;紫外-可見分光光度計TU-1810（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;超純水機MUL-9000（B）-1-10（南京總馨純水設(shè)備有限公司）;移液槍（200 ?L、1 000 ?L、5 mL，上海寶予德科學(xué)儀器有限公司）;渦旋混勻儀ZX4（意大利VELP）;超聲波清洗器KQ-300VDB（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 溶液配制

①40%乙醇溶液。量取40 mL無水乙醇，定容至100 mL，混勻。②5%亞硝酸鈉溶液。稱取5.0 g亞硝酸鈉，用水溶解，定容至100 mL，混勻。③10%硝酸鋁溶液。稱取10.0 g硝酸鋁，用水溶解，定容至100 mL，混勻。④4%氫氧化鈉溶液。稱取4.0 g氫氧化鈉，用水溶解，定容至100 mL，混勻。⑤200 mg/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取10.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品至50 mL容量瓶中，加入40%乙醇溶液充分溶解后，定容、混勻。本方法中的水為GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水。

1.3 測定方法

1.3.1 檢測波長的選擇

準(zhǔn)確稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)11.13 mg（100080-201811，92.4%，中國食品藥品檢定研究院）于50 mL容量瓶中，用40%乙醇定容并搖勻。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL置于10 mL具塞比色管中，加入0.3 mL5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min，在波長400～600 nm下進行掃描，確定最佳吸收波長。

1.3.2 工作標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL，分別置于10 mL具塞比色管中，分別添加40%乙醇至1 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。于波長510 nm處測定吸光度值，同時以40%乙醇為空白測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品的測定

準(zhǔn)確吸取苦蕎酒樣品1.0 mL，置于10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，于波長510 nm處測定其吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出總黃酮含量。

1.3.4 總黃酮含量的計算

總黃酮含量的計算公式為

（1）

式中：C為苦蕎酒中總黃酮的含量，?g/mL;A為樣品吸光度;X為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距;B為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長的確定

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，置于10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法操作，最后搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于400～600 nm波長下測定吸收曲線。結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在510 nm處有最大吸收，因此選擇510 nm作為測定波長。

2.2 顯色條件的優(yōu)化

2.2.1 總黃酮在不同溶劑中吸收情況

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL于3個10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，最后搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于波長510 nm處測定其吸光度值，詳見表1。結(jié)果表明，在相同實驗條件下總黃酮在40%乙醇溶劑中吸光度最大。

2.2.2 顯色劑硝酸鋁濃度的選擇

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL于5個10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入不同質(zhì)量濃度（2%、5%、10%、15%和20%）硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于波長510 nm處測定其吸光度值，結(jié)果見表2。隨著硝酸鋁濃度的增加，吸光度快速增加，在濃度為10%時達到最大值，此后再增加濃度，吸光度值緩慢下降，因此選擇硝酸鋁濃度為10%。

2.2.3 顯色劑硝酸鋁用量的選擇

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL于5個10 mL比色管中，按照1.3.2中的方法，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液并搖勻，靜置6 min，再加入不同體積（0.1 mL、

0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL）10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，用40%乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min。以試劑空白為參比，于波長510 nm處測定其吸光度值。如表3所示，隨著硝酸鋁使用量的增加，吸光度值迅速增大，在加入量0.3 mL時到達最大值，此后再增大加入量，吸光度呈現(xiàn)下降趨勢并逐漸趨于穩(wěn)定，因此選擇硝酸鋁用量為0.3 mL。

2.3 工作標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

按照1.3.2中的方法，得到回歸方程：Y=0.001 33X+0.001 21，其中斜率a=0.001 33，截距b=0.001 21，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。由試驗結(jié)果可知，蘆丁在0～205.682 ?g呈良好的線性關(guān)系，詳見表4。

2.4 檢出限與測定下限

根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ 168—2020）[3]的技術(shù)要求，結(jié)合回歸方程

Y=0.001 33X+0.001 21，可計算出檢出限為7.5 ?g，測定下限為30 ?g。

2.5 精密度

選取兩種苦蕎酒樣品，每份各1.0 mL，按照1.3.2中的方法連續(xù)測定6次，詳見表5。結(jié)果顯示RSD值為3.54%，說明該方法精密度高。實驗過程中，發(fā)現(xiàn)兩種苦蕎酒經(jīng)顯色劑顯色后，其絡(luò)合物顏色分別為淡紅色和橙黃色。

2.6 穩(wěn)定性

取苦蕎酒樣品1.0 mL，按照1.3.2中的方法將樣品制備完成后，于不同時間測其吸光度，觀察2 h內(nèi)吸光度變化趨勢（見表6）。結(jié)果表明，該方法在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性

由兩名實驗人員取兩種苦蕎酒樣品，每種6份各1.0 mL，按照1.3.2中的方法測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出總黃酮含量（見表7）。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性較好。

2.8 加標(biāo)回收率

取兩種苦蕎酒樣品，按照1.3.2中的方法進行加標(biāo)回收率檢測，平行測定3次。實驗結(jié)果表明，該方法的回收率為88.88%～98.28%，滿足分析要求（見表8）。

3 討論與結(jié)論

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、苦蕎酒經(jīng)顯色劑顯色后，其絡(luò)合物顏色分別為淡紅色和橙黃色，是由于黃酮類化合物泛指這種兩個苯環(huán)通過中央三碳鏈相互連接而成的一系列化合物，而黃酮類化合物的顏色根據(jù)中間吡喃環(huán)的不同氧化水平和兩側(cè)A、B環(huán)上連接的各種取代基而分為不同的黃酮類型[4-5]。只有物質(zhì)中含有鄰二酚羥基，并且鄰二酚羥基沒有取代基時，該法才在510 nm處有最大吸收。通過上述實驗可以得出，該方法能快速準(zhǔn)確地檢測苦蕎酒中總黃酮的含量，操作簡單，其精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等各項指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的分析檢測要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

參考文獻

[1]祁學(xué)忠，吉鎖興，王曉燕，等.苦蕎黃酮及其降血糖作用的研究[J].科技情報開發(fā)與經(jīng)濟，2003，13（8）：111-112.

[2]韓旭，吳宏萍，吳麗華，等.兩種方法測定苦蕎酒中總黃酮含量的比選[J].釀酒，2019，46（3）：79-81.

[3]中華人民共和國生態(tài)環(huán)境部.分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則：HJ 168—2020[S].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2020.

[4]鄭裕國，王遠(yuǎn)山，薛亞平，等.抗氧化劑的生產(chǎn)及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[5]尹愛群，穆惠軍，江雪欣，等.黃酮類化合物研究進展[J].中國藥事，2005，19（11）：689-692.