貴州喀斯特地區(qū)紅茶中茶黃素含量的測定

吳華秀 吳新文 毛敏霞 黃永橋

摘 要：目的：建立高效液相色譜法測定紅茶中茶黃素含量的分析方法。方法：樣品用70%甲醇為提取溶液，在75 ℃水浴中提取15 min，提取2次，流動相為2%的乙酸水溶液和乙腈-乙酸乙酯（42∶3），波長280 nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果：方法線性良好（R2>0.999），加標(biāo)回收率為95.9%～98.2%，精密度良好（RSD≤4.7%）。對貴州喀斯特地區(qū)12個茶樹品種紅茶及其他地區(qū)10種紅茶中的茶黃素含量進行測定，不同品種紅茶中4種茶黃素的含量存在一定差異，貴州喀斯特地區(qū)紅茶的茶黃素平均含量較其他地區(qū)要高。結(jié)論：貴州喀斯特地區(qū)對茶黃素總量有一定的影響。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;茶黃素;紅茶;喀斯特地區(qū)

Determination of Theaflavin in Black Tea in Karst Areas of Guizhou

WU Huaxiu， WU Xinwen， MAO Minxia， HUANG Yongqiao*

（Guizhou Testing Technology Research and Application Center， Guiyang 550014， China）

Abstract： Objective： To establish an analytical method for the determination of theaflavin in black tea by high performance liquid chromatography （HPLC）. Method： The sample was extracted twice with 70% methanol as the?extraction solution in a 75℃ water bath for 15 min. The mobile phase was 2% acetic acid aqueous solution and acetonitrile ethyl acetate （42：3）， wavelength of 280 nm， and quantitative determination by external standard method. Result： The linearity of the method was good（R2>0.999）， the recovery was 95.9%～98.2%， and the precision was good（RSD ≤4.7%）. The contents of theaflavins in 12 tea varieties of black tea in karst areas of Guizhou and 10 kinds of black tea in other areas were determined. There were certain differences in the contents of 4 kinds of theaflavins in different varieties of black tea. The average content of theaflavins in black tea in karst area of Guizhou was higher than that in other areas. Conclusion： The total amount of theaflavins had a certain effect in karst areas of Guizhou.

Keywords： high performance liquid chromatography; theaflavin; black tea; karst areas

茶黃素具有抗氧化、抑菌、抗炎、防癌、抗腫瘤以及防治心血管疾病等功能[1]。其是由多酚類及其衍生物氧化縮合而成，是一類具有苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)的化合物的總稱，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的茶黃素有12種，其中茶黃素TF、茶黃素單沒食子酸酯TF-3-G、茶黃素單沒食子酸酯TF-3-G和茶黃素雙沒食子酸酯TFDG是4種最主要的茶黃素[2]。茶黃素是紅茶中的主要成分，對紅茶的色香味及品質(zhì)起著決定性的作用。紅茶中茶黃素含量的高低與用于制作紅茶的茶樹品種所生長的環(huán)境有很大的關(guān)系，以碳酸巖為主的地質(zhì)環(huán)境更有利于紅茶的生產(chǎn)[3-5]。

目前有關(guān)茶黃素的測定一般有分光光度法[6]、毛細管電泳法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]、高效液相色譜法[11-17]等。在國標(biāo)和各類文獻[6-17]中對紅茶樣品中茶黃素的提取和測定方法條件參數(shù)都各不相同，有利有弊。本文采用高效液相色譜法測定紅茶中的茶黃素含量，通過對提取溶劑、提取時間、提取溫度等條件進行試驗，優(yōu)化并規(guī)范了測定紅茶中茶黃素的前處理方法，再對流動相進行對比分析，找到最優(yōu)的色譜條件，避免了實際樣品帶來的雜質(zhì)干擾問題，滿足測定紅茶中茶黃素的定性和定量要求，保證了茶黃素含量分析的準(zhǔn)確性。采用該方法對全國10種紅茶及貴州喀斯特山區(qū)12個茶樹品種紅茶中的茶黃素含量進行測定，為分析貴州喀斯特山區(qū)紅茶品質(zhì)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

貴州生產(chǎn)加工的12個茶樹品種紅茶;其他地區(qū)品種紅茶（正山小種紅茶、祁門工夫、滇紅工夫、川紅工夫、寧紅工夫、閩紅工夫、湖紅工夫、宜紅工夫、越紅工夫以及九曲紅梅）均購于貴陽市各大型超市。

乙腈（色譜純），德國Merck公司;甲醇（分析純）、乙酸乙酯（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;冰乙酸（色譜純）、茶黃素（TF）、茶黃素單沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素單沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素雙沒食子酸酯（TFDG）（純度均大于98%）以及0.22 ?m PTFE針式濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司。

Agilent 1290高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器），美國Agilent公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省常州市金壇區(qū)水北科普實驗儀器廠;LT2002電子天平，常熟市天量儀器有限公司;離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司;Milli-Q超純水機，美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取4種茶黃素化合物標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，甲醇溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度均為1.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃保存。分別取4種茶黃素化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備液各2.00 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成200.00 ?g·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動相A：2%乙酸水溶液;流動相B：乙腈+乙酸乙酯（42+3）;柱溫：40 ℃;進樣量：10 ?L;DAD檢測器波長：280 nm;梯度洗脫：0～16 min，15% B;16～25 min，20% B;25～35 min，20%→24% B;35～37 min，24%→15% B;37～40 min，15% B。

1.2.3 樣品前處理

稱0.5 g（精確至0.001 g）樣品，加入10 mL 70%甲醇水溶液，在80 ℃水浴中提取10 min，取出冷卻至室溫，離心，取上清液，于25 mL容量瓶中，重復(fù)提取1次，合并上清液于容量瓶中，加70%甲醇溶液定容至刻度，混勻，過膜，上機測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑濃度對茶黃素提取率的影響

試驗發(fā)現(xiàn)使用一定濃度的甲醇溶液為提取溶劑時，在一定溫度的水浴中直接提取的前處理方法的提取效率更高。本文選擇50%、60%、70%、80%、90%以及100%的甲醇溶液，在相同溫度水浴中提取10 min，提取2次，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，不同濃度的甲醇對茶黃素的提取率影響較大，甲醇濃度太低時，茶黃素在溶劑中的溶解度較低，提取速率變慢，造成茶黃素的提取率偏低;隨著甲醇濃度的提高，茶黃素的提取率不斷提高。甲醇濃度在60%～80%時，茶黃素的含量基本保持不變，當(dāng)甲醇濃度達到90%后，由于水分含量太低，不利于樣品快速軟化溶解，導(dǎo)致茶黃素提取困難，提取率開始降低，同時隨著甲醇濃度的提高，樣品雜質(zhì)干擾也越來越嚴(yán)重。因此，甲醇濃度為70%時，既能保證較高的提取率，樣品雜質(zhì)干擾也較少。

2.1.2 提取溫度對茶黃素提取率的影響

提取溫度的高低會直接影響茶黃素的提取效率，試驗選擇70%的甲醇為提取溶劑，分別在60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃以及85 ℃水浴中提取10 min，提取2次，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)提取溫度達到80 ℃時，繼續(xù)提高提取溫度，茶黃素提取率無明顯增加，這是由于提取溫度過高，提取溶劑會沸騰，不利于試驗的進行。另外，溫度過高會加速茶黃素的氧化分解，不利于試驗的控制。綜合考慮，提取溫度選擇80 ℃時為最佳。

2.1.3 提取時間對茶黃素提取率的影響

提取時間的長短直接影響茶黃素的提取效果，試驗選擇70%的甲醇為提取溶劑，在80 ℃的水浴中分別提取5 min、10 min、15 min、20 min、25 min以及30 min，提取2次，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，提取時間低于10 min時，茶黃素提取不充分，茶黃素提取率低;提取時間達到10～15 min時，茶黃素含量增長緩慢，隨著提取時間的繼續(xù)延長，提取效率逐漸降低。因此，提取時間選擇15 min為最佳。

2.2 樣品前處理正交設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對試驗有影響的提取溶劑濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）這3個因子進行L9（33）正交試驗，以茶黃素總含量為考察指標(biāo)，正交試驗因素水平表見表1，正交試驗結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)極差分析（R）分析可知，影響紅茶中姜黃素總含量的因素大小為A>C>B，即提取溶劑濃度和提取時間是影響紅茶中茶黃素提取率的關(guān)鍵性因子，而提取溫度對其的影響最小。從表2可以看出，茶黃素總含量最高的組合為A3B3C2，結(jié)果為0.849%;由K值分析得到的最佳組合為A3B2C3，即用70%的甲醇為提取溶劑，在75 ℃的水浴中提取15 min，提取2次，得到最佳條件下，茶黃素總含量為0.853%，高于組合A3B3C2。因此，試驗得到的最佳組合為A3B2C3。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 流動相的選擇與優(yōu)化

文獻表明[12]，在流動相中加入乙酸乙酯對目標(biāo)物的分離度有較大影響。通過改變乙酸乙酯的濃度可以調(diào)節(jié)4種茶黃素的分離度、峰形及保留時間，通過優(yōu)化最后選擇A：2%乙酸水溶液、B：乙腈+乙酸乙酯（42+3）作為流動相時，目標(biāo)物分離度、峰形等均為最佳。標(biāo)準(zhǔn)溶液及實際樣品圖譜如圖4所示，分析時間為40 min，縮短了分析時間，實際樣品測定中雜質(zhì)干擾小、出峰順序及保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰順序及保留時間保持一致。

色譜峰1～4分別為茶黃素、茶黃素單沒食子酸酯、茶黃素單沒食子酸酯和茶黃素雙沒食子酸酯。

2.3.2 色譜柱的選擇

流動相的pH值在2左右，ZORBAX SB-C18能耐受的pH值范圍為1～8，在保證具有良好的分離度和峰型的同時，該色譜柱能耐受較低pH值的流動相，在分析樣品時可以保證色譜柱不被損壞，保證色譜柱的正常使用壽命，所以最后選擇該色譜柱。

2.3.3 檢測波長的選擇

用DAD檢測器對4種茶黃素進行光譜掃描，4種茶黃素均在波長為280 nm左右處有最大吸收值，4種茶黃素的響應(yīng)值最佳，干擾較小。因此，選擇280 nm作為4種茶黃素的檢測波長。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢出限

配制質(zhì)量濃度為2.00～200.00 ?g·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積和濃度計算回歸方程，結(jié)果見表3，在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.999;通過S/N=3計算得出茶黃素（TF）、茶黃素單沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素單沒食子酸酯（TF-3-G）以及茶黃素雙沒食子酸酯（TFDG）的檢出限結(jié)果。

2.5 精密度及加標(biāo)回收試驗

選擇3個添加水平進行加標(biāo)回收試驗，每個水平做6次加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表4，平均回收率均在95.9%～98.2%，精密度在1.5%～4.7%，說明該方法具有較好的重復(fù)性與準(zhǔn)確性。

2.6 紅茶樣品的測定

2.6.1 貴州茶樹品種紅茶中茶黃素的含量

采用建立的分析方法對貴州12種茶樹品種的27批次紅茶進行茶黃素含量的測定，結(jié)果見表5。不同品種紅茶中4種茶黃素及茶黃素總量的含量存在一定差異。其中，TF含量為0.01%～0.17%，TF-3-G含量為0.10%～0.26%，TF-3-G含量為0.04%～0.14%，TFDG含量為0.16%～0.64%。TFDG含量高于其他3種茶黃素，金牡丹二葉中4種茶黃素及茶黃素總量均為最高，分別為0.17%、0.26%、0.14%、0.43%及1.00%;丹桂-2和古樹-1的茶黃素總量含量最低，均為0.46%。

2.6.2 其他地區(qū)10種紅茶中茶黃素的含量

采用建立的分析方法對其他10種紅茶中茶黃素的含量進行測定，結(jié)果見表6。湖紅工夫中茶黃素總量高于其他幾種紅茶，為0.73%;九曲紅梅中茶黃素總量最低，為0.38%;寧紅工夫和湖紅工夫中TFDG的含量為10種紅茶中最高，為0.37%。

綜上，不同品種紅茶中4種茶黃素及茶黃素總量的含量存在一定差異，貴州茶樹品種紅茶中茶黃素總量在0.46%～1.00%，其他地區(qū)紅茶品種茶黃素總量在0.38%～0.73%，且貴州茶樹品種紅茶中平均茶黃素總量高于其他地區(qū)紅茶品種;TFDG含量高于其他3種茶黃素，TF含量均為最低，金牡丹二葉中茶黃素總量含量最高，九曲紅梅中茶黃素總量含量最低，419-3茶中TFDG含量為所測紅茶中最高，為0.64%。

3 結(jié)論

通過對前處理方法和儀器條件進行優(yōu)化，建立了高效液相色譜測定紅茶中茶黃素的分析方法，方法線性和精密度良好，可用于實際樣品檢測。采用該方法對貴州茶樹品種紅茶中和其他地區(qū)紅茶品種中茶黃素的含量進行測定，通過分析發(fā)現(xiàn)全國10種紅茶中4中茶黃素的含量在0.38%～0.73%，平均含量為0.57%;貴州喀斯特山區(qū)12個茶樹品種紅茶中，4種茶黃素的含量在0.46%～1.00%，平均含量為0.67%。結(jié)果表明，不同品種紅茶中4種茶黃素及茶黃素總量的含量存在一定差異，貴州喀斯特山區(qū)中的茶樹生產(chǎn)出來的紅茶比其他地區(qū)10種紅茶中茶黃素總量的平均含量要高出0.10%，這可能與貴州喀斯特山區(qū)以碳酸巖為主的地質(zhì)背景有關(guān)。

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