常見大豆制品中蛋白質(zhì)的體外消化特性

陽 倩，馮廣鑫，馮煒婷，李彥磊，楊曉泉

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食物蛋白與膠體研究中心，廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

植物蛋白作為飲食中蛋白質(zhì)來源之一，因其健康、清潔及環(huán)境友好而受到全世界廣泛關(guān)注[1-5]。然而，與動物蛋白質(zhì)相比，植物蛋白消化率低，必需氨基酸組成不完整，目前還不可作為人類唯一營養(yǎng)源[6-7]。由于植物白蛋白結(jié)構(gòu)致密，具有大量的二硫鍵和自結(jié)合能力，故存在一定的抗消化性[8]。此外，一些常見植物蛋白缺乏某些必需氨基酸，且含有酶抑制劑、皂苷和單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子[9]，限制了其生物利用率。因此，為了改善植物源蛋白的營養(yǎng)特性，可以通過結(jié)合來自互補(bǔ)植物源的蛋白質(zhì)來滿足必需氨基酸的需求；也可以通過增加攝入量來彌補(bǔ)其較低的蛋白質(zhì)消化率[6]。然而，這些都需要對植物蛋白的消化過程有更多的了解。

體外模擬消化的方法被廣泛應(yīng)用于食物的胃腸道行為研究[10-13]。盡管體內(nèi)（人類或動物中）研究仍被認(rèn)為是解決飲食相關(guān)問題的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但體外模擬消化的方法具有速度更快、成本更低、勞動強(qiáng)度更低、沒有倫理限制的優(yōu)勢[14]。因此，需要建立能模擬人體消化過程中發(fā)生生理過程的體外消化模型，以替代體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。這些模型要考慮相關(guān)的消化條件，主要包括消化酶的種類和濃度、胃和腸階段的pH值、消化時(shí)間和鹽濃度等[12]。但由于不同文獻(xiàn)中體外消化模型在參數(shù)的設(shè)置上存在顯著差異，阻礙了不同研究比較結(jié)果和推斷普遍結(jié)果的可能性。靜態(tài)體外消化模型（INFOGEST）組織的主要目的之一是固定模擬消化食物的條件，并盡可能統(tǒng)一消化模型，建立共識協(xié)議。該共識協(xié)議于2014年首次發(fā)布[14]，最近又進(jìn)行了更新——INFOGEST 2.0[15]。INFOGEST組織旨在對靜態(tài)消化方法的流程和參數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化統(tǒng)一，固定膳食與消化液的比例以及固定每一消化階段的pH值。食物樣品經(jīng)口腔消化、胃消化和腸消化3 個(gè)階段。其中，模擬消化液、酶、膽汁、pH值和消化時(shí)間等參數(shù)是基于現(xiàn)有的生理數(shù)據(jù)。該方法可用于分析消化產(chǎn)物（如多肽/氨基酸、脂肪酸、單糖）和評估食物基質(zhì)中微量營養(yǎng)素的釋放，評估食物消化的終點(diǎn)。雖然體外模型不能完全體現(xiàn)出體內(nèi)消化的復(fù)雜性，但其已被證明能有效替代動物和人體模型，并已作為篩選工具來解決與飲食相關(guān)的問題，例如蛋白質(zhì)消化、生物利用度、生物活性化合物的釋放和食物的結(jié)構(gòu)變化等[12,16-17]。

大豆起源于中國，在亞洲已有近5 000 年的種植史[18]。大豆是高品質(zhì)蛋白質(zhì)的豐富來源，含有人類需要的大部分氨基酸，不含膽固醇，飽和脂肪較少[19]。作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，大豆經(jīng)常出現(xiàn)在人們的餐桌上。數(shù)據(jù)顯示，2019年全年世界大豆消費(fèi)總量為3.519億 t，我國消費(fèi)量達(dá)1.082億 t，占世界大豆總產(chǎn)量的30.75%，同時(shí)我國的大豆的需求量也躍居世界首位[20]。然而，食品基質(zhì)中的大豆蛋白的消化性還不清楚。因此，本研究基于INFOGEST 2.0[15]評估常見大豆制品中蛋白質(zhì)的體外消化特性。具體來說，本實(shí)驗(yàn)對不同大豆制品的結(jié)構(gòu)（液體與固體）、加熱程度（微波、水煮、無熱處理）和食物基與蛋白基（天然食品制備與分離蛋白）進(jìn)行比較。本研究分析常見的6種大豆制品üü豆腐（氯化鈣豆腐、氯化鎂豆腐）、豆?jié){、微波大豆、水煮大豆、大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI），其中豆?jié){和鈣、鎂豆腐基本成分相同，但結(jié)構(gòu)不同；微波大豆和水煮大豆是由同樣的大豆經(jīng)過不同的熱處理而得，選用SPI為參考對照。本研究通過對不同大豆制品水解產(chǎn)物的分析探究其蛋白質(zhì)的消化性差異，以更好地了解在INFOGEST 2.0和不同烹飪方式的作用下大豆蛋白的水解與消化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆產(chǎn)地為遼寧省沈陽市；低溫脫脂豆粕由山東禹王實(shí)業(yè)有限公司提供。

α-唾液淀粉酶（100 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰液素（6 U/mg） 美國Sigma-Aldrich公司；牛膽鹽上海麥克林生化科技有限公司；凝固劑MgCl2和CaCl2（食品級） 連云港日豐鈣鎂有限公司；其他試劑均為分析純；所有實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

PB80Easy218破壁機(jī) 中國美的公司；ZEN3600納米粒度儀 上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司；Synergy Neo2多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰公司；M00665預(yù)制膠金斯瑞生物科技有限公司；1290超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制備

SPI：將脫脂豆粕與去離子水按照料液比1∶10（m/V）混合，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0并在室溫下300 r/min攪拌2 h，接著8 000 r/min離心20 min得到上清液，用1 mol/L HCl調(diào)整濾液pH值至4.5。隨后將濾液在6 000 r/min、4 ℃下離心15 min，棄去上清液，所得沉淀即為SPI；將沉淀取出，以料液比1∶10（m/V）加去離子水復(fù)溶，在持續(xù)攪拌下調(diào)整pH值至7.5，待完全溶解后裝入透析袋，在去離子水中于4 ℃下透析48 h，冷凍干燥，留樣備用。

豆?jié){的制備參考文獻(xiàn)[21]：浸泡：將清洗后的大豆與去離子水以質(zhì)量比1∶6于常溫下充分浸泡12 h，膨脹至原大豆體積2.2 倍左右；破壁：將瀝干后的濕大豆與去離子水以1∶4的質(zhì)量比混合，用破壁機(jī)在6檔下破壁5 min，然后用紗布過濾；煮制：把濾漿倒入不銹鋼鍋中置于電磁爐上加熱，煮制過程中不斷攪拌以防糊底，并將浮沫撇去，維持鍋內(nèi)漿液（94±2）℃，5 min后即得豆?jié){。

豆腐的制備參考文獻(xiàn)[22]：取豆?jié){制備方法中破壁處理5 min后的濾漿，待漿液溫度降至85 ℃，立即以質(zhì)量比25∶1加入0.03 mol/L MgCl2溶液或CaCl2溶液，迅速攪拌均勻，靜置30 min得到豆花；壓制成型：將靜置后的豆花倒入豆腐模具內(nèi)，物料上方放置鐵塊使多余的漿水流出以便成型，壓制4 h后即可得鎂豆腐或鈣豆腐。

水煮大豆：浸泡步驟同豆?jié){的制作。瀝干后在沸水中煮制25 min，撈出擦干表面水分后備用。

微波大豆：60 g大豆洗凈后瀝干放入微波專用盤中，再放入微波爐中加熱。模式設(shè)為高火，加熱2 min后取出，翻面，再放入微波爐中繼續(xù)加熱2 min。

在模擬消化前，固體大豆制品（鎂豆腐、鈣豆腐、水煮大豆、微波大豆）已用小型粉碎機(jī)磨碎至顆粒粒徑約3 mm，模擬口腔食糜粒徑。SPI沒有做任何的熱處理，用去離子水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%（與豆奶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)相近）的溶液作為待消化的樣品。所有樣品制備當(dāng)天進(jìn)行體外模擬消化。

1.3.2 體外模擬消化

采用INFOGEST 2.0[15]進(jìn)行6種大豆制品的靜態(tài)體外消化模擬，并稍作修改。配制模擬唾液、胃液、腸液儲備液，模擬消化時(shí)加入酶、膽鹽、CaCl2溶液、去離子水等，儲備液分別稀釋1.25 倍得到模擬唾液、模擬胃液、模擬腸液（表1）。

表1 模擬消化液（唾液、胃液、腸液）成分Table 1 Compositions of simulated digestion fluids (saliva, gastric fluid, intestinal fluid)

5 g的樣品在5 mL的模擬唾液（含75 U/mL唾液淀粉酶）中消化2 min。再加入10 mL模擬胃液（含2 000 U/mL胃蛋白酶）并用5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為3.0，消化0、30、60、120 min。最后加入20 mL模擬腸液（含10 mmol/L牛膽鹽和100 U/mL胰液素），用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，消化0、30、60、120 min。

消化前，所有的儲備液和去離子水等試劑均已預(yù)熱至37 ℃，酶液現(xiàn)用現(xiàn)配，并置于冰中保存，在樣品與儲備液混合后再添加。所有的體外消化實(shí)驗(yàn)均在50 mL圓底離心管中進(jìn)行，水平放置于恒溫?fù)u床中（37 ℃、100 r/min）。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用單獨(dú)管進(jìn)行消化。1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0以終止胃消化；100 ℃水浴煮制5 min以終止腸消化。以等質(zhì)量去離子水代替食物作為胃、腸空白組。結(jié)束消化后，所有樣品立即置于液氮中冷凍10 min。解凍后所有的胃、腸消化液在4 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液于－20 ℃保存?zhèn)溆?，剩余沉淀部分凍干并用于后續(xù)電泳分析。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

在還原條件下，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對消化上清液和沉淀的水解物進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE可以對完整蛋白和分子質(zhì)量大于5 kDa的蛋白片段進(jìn)行鑒定和半定量。樣品制備：取1.3.2節(jié)消化后備用的上清液和沉淀，40 μL上清液或0.02 g溶于40 μL去離子水的沉淀與10 μL的上樣緩沖液混勻，在100 ℃煮沸5 min。制樣完畢后，在12%預(yù)制膠中加入20 μL/孔樣品，凝膠電泳于恒壓模式下進(jìn)行，開始時(shí)電壓保持在80 V，進(jìn)入分離膠后增至120 V。在含50%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇、10%（體積分?jǐn)?shù)）冰醋酸的1 g/L考馬斯亮藍(lán)R-250溶液中染色45 min，然后于洗脫液（含50%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇、10%（體積分?jǐn)?shù)）冰醋酸）中脫色過夜（約12 h）。

1.3.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定分子質(zhì)量

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）分析體外模擬消化模型下6種大豆制品腸消化液隨時(shí)間變化的水解作用。這種技術(shù)可鑒定分子質(zhì)量較小的肽（分子質(zhì)量小于3 kDa）。將胃腸消化上清液用超純水稀釋至所需的蛋白質(zhì)量濃度（50 μg/mL）備用。色譜分析條件：A液為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液；B液為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-乙腈水溶液（乙腈體積分?jǐn)?shù)為84%）。質(zhì)譜分析條件：電噴霧離子源，毛細(xì)管溫度為180 ℃，載氣流速4.0 L/min，電噴霧電壓3.5 kV，掃描范圍50～3 000 Da，掃描速率26 000 Da/s。篩選質(zhì)荷比大于50，相對豐度大于0.2%的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析鑒定。

1.3.5 游離氨基濃度的測定

參照Church等[23]的方法，使用鄰苯二甲醛（orthophthalaldehyde，OPA）方法測定消化上清液中的游離氨基濃度，以表征總蛋白的水解程度進(jìn)行定量。OPA在1,4-二巰基蘇糖醇的存在下與游離氨基形成黃色化合物，其在340 nm波長處有特征吸收，用分光光度計(jì)測定其340 nm波長處吸光度。游離氨基濃度根據(jù)10 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制不同濃度（0～10 mmol/L）的L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定，結(jié)果用L-亮氨酸當(dāng)量表示，單位為mmol/L。

1.3.6 粒徑分布測定

胃腸消化液的粒徑分布由納米粒度分析儀測定，測定范圍為0.4～8 630.0 nm。樣品加入測定池中，平衡120 s后進(jìn)行測定。以水為溶劑，折射率為1.333。每個(gè)樣品測試3 次，采用Zetasizer軟件分析不同粒徑的體積分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)，采用鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平為P＜0.05。每個(gè)樣品平行測定3 次，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。采用Origin 2019b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬消化后樣品的SDS-PAGE結(jié)果

體外消化研究是理解影響植物蛋白水解的重要方法，以期最大程度地優(yōu)化植物蛋白的營養(yǎng)價(jià)值。蛋白質(zhì)體外消化模型主要以蛋白質(zhì)的消化率為參數(shù)，而蛋白質(zhì)消化率作為評價(jià)食物營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，是指食物中被消化吸收的蛋白質(zhì)占總蛋白含量的比例。蛋白質(zhì)消化率越高，消化后產(chǎn)生的氨基酸含量越多，營養(yǎng)價(jià)值越高[24]。蛋白質(zhì)的可消化性和消化產(chǎn)物性質(zhì)與其營養(yǎng)價(jià)值密切相關(guān)。為了考察不同加工方式對大豆蛋白體外消化情況，本研究應(yīng)用INFOGEST 2.0模擬消化，并對6種大豆蛋白制品的不同消化階段取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，通過電泳條帶變化判斷樣品的消化水解情況。

大量研究表明，用不同加工方式處理具有相同氨基酸組成的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)胃腸道消化物可消化性和營養(yǎng)有效性差異的主要原因是空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[25-27]。Waibel等[28]研究表明，當(dāng)加熱溫度過高時(shí)，半胱氨酸、胱氨酸會發(fā)生脫硫反應(yīng)，肽鍵斷裂，形成硫化氫、二甲基硫化物、磺基丙氨酸等，造成氨基酸的嚴(yán)重破壞。然而，對于由四級結(jié)構(gòu)組成的蛋白質(zhì)分子而言，蛋白質(zhì)亞基是由一條多肽鏈折疊成的三級結(jié)構(gòu)球蛋白[29]。

研究認(rèn)為蛋白經(jīng)過胃蛋白酶的初步水解，產(chǎn)生分子質(zhì)量較大的多肽[30]，故在SDS-PAGE的胃消化階段可見大量條帶（圖1和圖2）。未經(jīng)過加熱處理的SPI在胃消化開始時(shí)（0 min）顯示出19～117 kDa的典型多肽蛋白結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)槠涓缓杷园被幔瑥亩纬奢^為緊密的分子結(jié)構(gòu)，使其對胃蛋白酶作用的抵抗性較強(qiáng)。7S（50 kDa和70 kDa附近）在胃消化階段表現(xiàn)出對胃蛋白酶有抗性，但未在腸消化中被檢測到，11S（20 kDa和30～34 kDa附近）則在胃消化開始后很快消化完全；水煮大豆條帶都主要分布在10～35 kDa，條帶顏色較深，沉淀中蛋白含量高（圖1D），說明經(jīng)胃蛋白酶后產(chǎn)生大量小分子蛋白，由于蒸煮的溫和條件誘導(dǎo)的熱變性及較弱的氧化引起蛋白質(zhì)部分展開，使胃蛋白酶更容易地進(jìn)入水解位點(diǎn)；與其他底物不同的是，微波大豆在整個(gè)胃消化期間都很穩(wěn)定，條帶相比其他樣品較少且變化不大，沉淀中可溶性成分少（圖1E），說明微波大豆經(jīng)胃消化后蛋白迅速被酶解，可能是微波自內(nèi)而外的加熱方式破壞了蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)以及亞基的空間構(gòu)象，促進(jìn)蛋白水解。豆?jié){電泳圖中也分布有分子質(zhì)量19～117 kDa的條帶，但相比較于SPI其顏色呈淺色且密集程度更低，由豆?jié){消化沉淀的電泳圖（圖2D）可知，胃消化過程中有大量蛋白聚集形成了沉淀，導(dǎo)致豆?jié){消化液上清液的蛋白濃度較低，這可能是由于高溫使蛋白嚴(yán)重變性，引起蛋白質(zhì)發(fā)生熱聚集，重新包埋了原本已暴露的酶結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)變形的蛋白質(zhì)不易于酶結(jié)合，減弱了酶對蛋白質(zhì)的消化降解作用[31]；鈣豆腐與鎂豆腐條帶分布幾乎相同，但相比于鈣豆腐，鎂豆腐在分子質(zhì)量40～70 kDa處的條帶更明顯，90 kDa處條帶在胃消化30 min（泳道2）后消失，40 kDa處條帶在胃消化120 min（泳道1～4）過程中逐逐漸消失（圖2B），由此可知，90 kDa處條帶經(jīng)過胃消化迅速水解，40 kDa處條帶逐漸水解。同時(shí)，豆腐沉淀的電泳圖（圖2E、F）中也都顯示存在不同程度的蛋白聚集，聚集程度鎂豆腐大于鈣豆腐，但兩者均小于豆?jié){，說明胃階段兩種豆腐消化程度均大于豆?jié){，且鈣豆腐比鎂豆腐更易消化；胃腸消化后，不論是SPI還是經(jīng)不同加熱處理的大豆制品的消化液，電泳圖大體上與空白（泳道C）相近，大豆蛋白均被徹底消化為短肽。說明在胃蛋白酶作用下部分消化的蛋白質(zhì)經(jīng)胰液素催化后充分水解。

圖1 SPI、水煮大豆、微波大豆的體外模擬消化物上清液和沉淀的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) patterns of supernatants and precipitates from in vitro simulated digestion products of SPI, boiled soybean, and microwaved soybean

圖2 豆?jié){、鎂豆腐、鈣豆腐的體外模擬消化物上清液和沉淀的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 2 SDS-PAGE patterns of supernatants and precipitates from in vitro simulated digestion products of soybean milk, Mg-tofu and Ca-tofu

2.2 體外模擬消化后樣品中的肽分子質(zhì)量分布

SDS-PAGE從分子質(zhì)量層面表征了各大豆制品的蛋白水解程度，但腸消化中蛋白被徹底消化，無法進(jìn)一步比較水解程度，而LC-MS可以檢測出低分子質(zhì)量肽（＜3 kDa）。LC-MS分析不同腸消化時(shí)間肽的分子質(zhì)量，結(jié)果如圖3所示。樣品經(jīng)胃腸消化后，蛋白質(zhì)在胃蛋白酶和胰液素的作用下分解成小分子肽段和游離氨基酸，6種底物的肽分子質(zhì)量中位數(shù)均分布在（1.00±0.25）kDa內(nèi)，即由大約6～8 個(gè)氨基酸組成的小分子肽段，處于該分子質(zhì)量范圍的肽片段更容易被吸收[32]。表明在腸消化中蛋白質(zhì)水解強(qiáng)烈，且經(jīng)過不同時(shí)間的腸消化，所有底物幾乎完全消化為小肽，而SDS-PAGE未能識別出這樣的小肽。

圖3 大豆制品體外模擬消化后的肽分子質(zhì)量分布Fig. 3 Molecular mass distribution of peptides after simulated digestion of soybean products in vitro

豆?jié){、鈣豆腐消化液中多肽的分子質(zhì)量中位數(shù)隨時(shí)間的推移趨于穩(wěn)定，而鎂豆腐消化液中多肽的分子質(zhì)量中位數(shù)在60 min后開始下降，120 min時(shí)與鈣豆腐消化液中多肽的分子質(zhì)量中位數(shù)相近。SPI、水煮大豆、微波大豆消化液中多肽的分子質(zhì)量中位數(shù)大致趨勢為SPI＞水煮大豆＞微波大豆，但其隨時(shí)間變化的規(guī)律不明顯。

2.3 體外模擬消化后上清液中游離氨基濃度

OPA法被廣泛用于測定蛋白質(zhì)的游離氨基濃度，與SDS-PAGE結(jié)合可以更好地表征消化過程中蛋白質(zhì)水解程度。OPA法可以對胃和腸消化液中的初級游離氨基進(jìn)行定量，以反映蛋白質(zhì)的消化程度。游離氨基濃度越高表示蛋白質(zhì)消化水解的程度越大。一般來說，伯胺基團(tuán)的數(shù)量隨著胃和腸道消化的進(jìn)行而增加。然而，總蛋白消化的速度和程度在不同加熱處理的底物中存在差異（圖4）。

圖4 大豆制品體外模擬胃（A）和腸（B）消化過程中上清液的游離氨基濃度變化Fig. 4 Changes in free amino group concentrations of supernatants from soybean products during in vitro simulated gastric (A) and intestinal (B) digestion

與胃消化初期相比，各處理樣品胃消化末期游離氨基濃度顯著增加（P＜0.05），且經(jīng)微波加熱的樣品的游離氨基濃度明顯高于其他處理的樣品，SPI游離氨基濃度全程較低，而水煮大豆介于兩者之間。在胃消化初期，豆?jié){、鎂豆腐和鈣豆腐游離氨基濃度無明顯差異，而隨著胃消化的開始，豆腐的游離氨基濃度顯著增加，且鈣豆腐的增加效果更明顯，這樣的趨勢持續(xù)到了胃消化結(jié)束。由圖4A可知，不同熱處理?xiàng)l件對大豆蛋白胃消化有促進(jìn)作用，熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、結(jié)構(gòu)伸展，進(jìn)而使包藏于分子內(nèi)部的活性基團(tuán)及酶結(jié)合位點(diǎn)暴露，增加了對蛋白酶的敏感性和表面疏水性，因此易被胃蛋白酶消化降解，導(dǎo)致水解程度增加[31]。

與胃階段相比，各處理樣品腸消化階段游離氨基濃度顯著增加，說明蛋白質(zhì)消化主要在腸道中進(jìn)行，與SDS-PAGE（圖1、2）中胃消化后仍有大量蛋白或肽類，而腸消化后除消化酶外無可見條帶的結(jié)果相印證。小腸是人體的主要營養(yǎng)物質(zhì)吸收部位，而作為內(nèi)肽酶的胰蛋白酶可以沿其底物的一級結(jié)構(gòu)在氨基酸鏈的中間切割肽鍵，因此胰蛋白酶的加入能大幅度提高大豆蛋白水解度，并產(chǎn)生大量的小分子活性肽[33]。值得注意的是，胃消化中游離氨基濃度不同的兩種豆腐在腸消化末期的游離氨基濃度沒有明顯差異，但均高于豆?jié){。說明兩種豆腐的消化程度相近，且均高于豆?jié){。不同熱處理的底物水解程度在腸消化末期中也有與胃消化末期相近的趨勢。

2.4 體外模擬消化后樣品的粒徑分布

根據(jù)Stokes定律[34]，沉降速度與蛋白粒子的半徑平方成正比，沉降速度越快即表示粒子越大，反之越小。大豆制品的胃消化液和腸消化液在各時(shí)間點(diǎn)的粒度分布分別如圖5、6所示。為了更好地比較樣品之間的粒徑，將消化后的樣品粒徑分為3 個(gè)部分：1～10 nm、10～100 nm和1 000～10 000 nm。

圖5 動態(tài)光散射測定大豆制品在體外模擬胃消化過程中的粒徑分布Fig. 5 Particle size distributions of in vitro gastric digestion products of soybean products at different time points, as determined by laser light scattering

圖6 動態(tài)光散射測定大豆制品在體外模擬腸消化過程中的粒徑分布Fig. 6 Particle size distribution of in vitro intestinal digestion products of soybean products at different time points, as determined by laser light scattering

胃消化后豆?jié){的粒徑大于鎂豆腐和鈣豆腐的粒徑，有明顯的雙峰分布趨勢。根據(jù)王麗麗[35]的研究，豆?jié){粒徑分布存在兩個(gè)峰的原因一方面是加熱使豆?jié){中小分子天然蛋白質(zhì)溶解度變大；另一方面是較強(qiáng)的熱處理促使蛋白發(fā)生聚集，形成較大顆粒。鎂豆腐與鈣豆腐初始粒徑相近，但隨時(shí)間變化先增加后減小，在胃消化末期的粒徑小于鈣豆腐。相比較于主峰分布于10～100 nm的SPI，水煮大豆和微波大豆的粒徑偏大且多峰，這與樣品的原始形態(tài)有關(guān)。

腸消化液的粒徑隨時(shí)間變化基本保持穩(wěn)定，進(jìn)入腸消化后，固體食物的食糜粒徑較相對應(yīng)的胃消化階段顯著減小。且多呈單峰分布。鎂豆腐和鈣豆腐的粒徑主要分布在1～10 nm，與膽鹽的尺寸相似，說明樣品中的蛋白已消化完全。而微波大豆和水煮大豆的粒徑分布在范圍更大的10～100 nm，且呈多峰分布。而液體樣品中，SPI粒徑分布從胃階段的10～100 nm增加至腸階段的1 000～10 000 nm，豆?jié){由胃階段的多峰分布轉(zhuǎn)為集中分布在1 000～10 000 nm。

3 結(jié) 論

本研究利用INFOGEST 2.0對常見大豆制品進(jìn)行體外模擬消化，探討在標(biāo)準(zhǔn)的靜態(tài)體外模擬消化模型下不同的加工處理對大豆蛋白的消化影響，在完整的蛋白質(zhì)、肽、小肽和游離氨基釋放水平上評估蛋白質(zhì)水解情況。結(jié)果表明，不同加工方式均能促進(jìn)大豆蛋白的消化。經(jīng)過胃消化階段后，幾種大豆制品中部分蛋白被消化。而腸消化后，大豆蛋白均被徹底消化為短肽。相較于SPI，微波加熱明顯提高了游離氨基濃度，水煮加熱則較為溫和。兩種不同鹽離子制成的豆腐在腸消化末期游離氨基濃度和分子質(zhì)量分布無明顯差異，消化程度均大于豆?jié){。表明不同鹽離子（Ca2＋、Mg2＋）制成的豆腐在完全消化后無明顯差別。這些樣品加熱后的變化可能展現(xiàn)出胃腸道消化過程中蛋白質(zhì)消化的差異。本研究有助于更好地了解在INFOGEST 2.0和不同加工方式的作用下大豆蛋白的水解與消化特性，可為人們膳食植物蛋白提供參考。