即食發(fā)酵肉制品熟化機(jī)制研究進(jìn)展

李銀輝，王曄茹，孟媛媛，趙 偉，檀利軍，劉海泉,3,4，謝慶超,3,5,*，趙 勇,3,5,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100022；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306；4.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；5.上海海洋大學(xué)食品質(zhì)量安全檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

即食發(fā)酵肉制品是以畜禽肉為原料在自然或人工條件下經(jīng)特定微生物和酶的作用，加工制成的一類可即食的產(chǎn)品。它們的共同特點(diǎn)是處理時(shí)間長(zhǎng)，且干燥后質(zhì)量損失較大。其加工過(guò)程包括原料肉的預(yù)處理、發(fā)酵和干燥3 個(gè)階段。發(fā)酵過(guò)程中，主要進(jìn)行微生物代謝，而在干燥階段會(huì)形成特殊的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味[1]。經(jīng)過(guò)發(fā)酵和干燥，原料肉經(jīng)歷了由生到熟的轉(zhuǎn)變，故本文將這兩個(gè)階段概括為熟化階段。熟化過(guò)程不僅耗能低，并且賦予了肉制品獨(dú)特的功能特性、感官特性和營(yíng)養(yǎng)特性。

即食發(fā)酵肉制品主要分為即食發(fā)酵火腿和香腸兩大類，雖然兩者形態(tài)有差異，但其熟化過(guò)程中理化性質(zhì)的變化及其熟化機(jī)制是類似的[2]。在熟化過(guò)程中，酶和微生物將蛋白質(zhì)和脂質(zhì)水解氧化形成了大量小分子物質(zhì)（如游離氨基酸、游離脂肪酸、醛、酮等）；微生物發(fā)酵劑消耗肌肉中的碳水化合物并產(chǎn)生有機(jī)酸，pH值降低至4.5～5.5，由于干燥脫水以及鹽的作用，肌肉中水分活度（aw）降低，一定程度上保證了產(chǎn)品的安全性，同時(shí)酸可以使肌肉中的鹽溶性蛋白質(zhì)變性，產(chǎn)生的凝膠結(jié)構(gòu)有助于形成即食發(fā)酵肉制品特殊的質(zhì)構(gòu)；腌制劑中硝酸鹽和亞硝酸鹽通過(guò)與肌紅蛋白結(jié)合形成亞硝酸肌紅蛋白，提升了即食發(fā)酵肉制品的色澤[3]。

即食發(fā)酵肉制品的熟化過(guò)程中，酶、微生物和腌制劑對(duì)形成其獨(dú)特的品質(zhì)、風(fēng)味和色澤等起到重要作用。目前即食發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)大都是經(jīng)驗(yàn)性的，因此全面了解其熟化過(guò)程中理化性質(zhì)的變化以及熟化因素的作用機(jī)制對(duì)其生產(chǎn)加工具有指導(dǎo)意義。本文系統(tǒng)地闡述其熟化過(guò)程中的成分變化以及影響熟化的因素及其作用機(jī)制，以期為更加深入地了解和探究此類產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 即食發(fā)酵肉制品熟化過(guò)程中的成分變化

即食發(fā)酵肉制品熟化過(guò)程中發(fā)生了一系列高度復(fù)雜的生化反應(yīng)。在此過(guò)程中，蛋白質(zhì)水解形成多肽和游離氨基酸；蛋白質(zhì)凝膠的生成使即食發(fā)酵肉制品形成了獨(dú)特的質(zhì)構(gòu)；脂質(zhì)在酶的作用下發(fā)生水解形成游離脂肪酸。游離氨基酸和脂肪酸對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的形成有重要影響，其中游離脂肪酸經(jīng)過(guò)氧化生成醛、酮、醇和酯等風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸以及美拉德反應(yīng)也是風(fēng)味和滋味物質(zhì)的主要來(lái)源。

1.1 蛋白質(zhì)的變化

1.1.1 蛋白質(zhì)的水解及其影響因素

蛋白質(zhì)水解是即食發(fā)酵肉制品熟化過(guò)程的主要生化反應(yīng)之一。熟化過(guò)程中，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的含量呈下降趨勢(shì)，韋友兵等[4]發(fā)現(xiàn)薩拉米香腸的肌漿蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)從21.22%降低至11.35%，肌原纖維蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)從19.5%降低至8.77%。大分子的蛋白質(zhì)水解成小分子物質(zhì)更有利于人體吸收，同時(shí)生成的各種生物活性肽，賦予了產(chǎn)品特殊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性[5]。其中，與降血壓相關(guān)的活性肽——血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制劑研究最為廣泛。Mora等[6]研究表明伊比利亞發(fā)酵火腿中的肽段包含已知的ACE抑制片段，該研究者將此肽段作用于自發(fā)性高血壓大鼠，結(jié)果表明8 h后大鼠的收縮壓顯著降低12 mm Hg。最近，一項(xiàng)臨床研究評(píng)估了發(fā)酵火腿的消費(fèi)與心血管效應(yīng)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵火腿可以減輕炎癥反應(yīng)和改變血栓形成狀態(tài)。另外，有研究表明西班牙發(fā)酵火腿中具有可以影響糖代謝的生物活性肽，攝入該火腿后受試者血糖水平有所下降[7]。

蛋白質(zhì)的水解受多種因素的影響。首先，不同類型發(fā)酵產(chǎn)品蛋白質(zhì)水解指數(shù)不同，發(fā)酵火腿中水解指數(shù)高達(dá)24%～40%，發(fā)酵香腸中水解指數(shù)可達(dá)到17%左右[4,8]。其次，蛋白質(zhì)種類也是影響其蛋白質(zhì)水解率的因素之一，López等[9]采用肽組學(xué)方法對(duì)阿根廷市售發(fā)酵香腸中的蛋白質(zhì)水解過(guò)程及其生成的多肽進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)香腸中肌漿蛋白比肌原纖維蛋白更容易被水解。此外，不同的加工條件蛋白質(zhì)的水解速率也不同，高含水量的香腸蛋白質(zhì)水解速率較高。由于鹽分和水分在肌肉中的轉(zhuǎn)移路徑不同，肌肉的半膜肌和股二頭肌的幾何位置對(duì)火腿熟化過(guò)程中蛋白質(zhì)水解速率也有很大影響[10]。

1.1.2 蛋白質(zhì)的氧化

蛋白質(zhì)的適度氧化有利于蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的識(shí)別，提高蛋白質(zhì)的水解率。但是過(guò)度氧化會(huì)產(chǎn)生一些不良效果（包括氨基酸降解、蛋白質(zhì)溶解度降低、酶失活和蛋白質(zhì)消化率降低等），導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)劣化（例如變色、異味、質(zhì)地缺陷以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降）[11]。蛋白質(zhì)的氧化有兩種方式，一種是由自由基（如超氧陰離子自由基、羥自由基（·OH）和過(guò)氧化硝基陰離子（ONOO－）等）直接引起，遵循自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程；另一種是由氧化應(yīng)激的副產(chǎn)物（加工過(guò)程中產(chǎn)生的氧化脂質(zhì)或其他促氧化劑）間接引起。氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾是蛋白質(zhì)氧化的主要特征，氧化過(guò)程中氨基酸殘基的側(cè)鏈?zhǔn)艿焦?，并轉(zhuǎn)化為羰基衍生物。自由基與氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，氨基酸的反應(yīng)敏感度表現(xiàn)出較大的差異，其中自由基對(duì)半胱氨酸的含硫活性中心敏感性較強(qiáng)，氧化形成二硫鍵促進(jìn)了蛋白質(zhì)之間的相互交聯(lián)[12]。此外，常見(jiàn)的蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)還包括芳香族氨基酸側(cè)鏈與脂肪族發(fā)生羥基化、堿性氨基酸脫氨生成羰基化合物等[13]。目前關(guān)于蛋白質(zhì)氧化機(jī)制方面取得了一定的進(jìn)展，但在即食發(fā)酵肉制品中蛋白質(zhì)氧化對(duì)于其熟化具體作用、蛋白質(zhì)氧化前后的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化以及如何精準(zhǔn)地控制氧化的強(qiáng)度等都仍需進(jìn)一步的探索。

1.1.3 質(zhì)構(gòu)的形成

質(zhì)構(gòu)是評(píng)價(jià)即食發(fā)酵肉制品質(zhì)量的主要感官特征之一[14]。熟化過(guò)程中質(zhì)構(gòu)的變化主要表現(xiàn)為最終產(chǎn)品硬度的增加、咀嚼性增強(qiáng)、彈性下降以及嫩度降低[15-17]。其中蛋白質(zhì)變性并生成凝膠是產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)形成的主要原因，蛋白質(zhì)凝膠是蛋白質(zhì)發(fā)生降解和變性而產(chǎn)生的稠密光滑的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，可以增加肌肉組織間的硬度和黏合性，從而改變?nèi)庵破返馁|(zhì)構(gòu)。其形成可分為3 個(gè)主要步驟：首先是在鹽的作用下鹽溶性蛋白質(zhì)析出，進(jìn)而酸化形成蛋白質(zhì)凝膠，最后在干燥過(guò)程中進(jìn)一步強(qiáng)化蛋白質(zhì)凝膠[16-17]。

影響質(zhì)構(gòu)的因素眾多，包括原料、含鹽量和pH值等。Steen等[18]研究了不同的原料肉和翻滾時(shí)間對(duì)火腿質(zhì)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)原料肉的品質(zhì)與產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)關(guān)系顯著。鹽減弱了蛋白質(zhì)附近基團(tuán)離子之間的靜電吸引，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的展開(kāi)和解離，使產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)進(jìn)一步形成[2]，Coll-Brasas等[19]研究表明減少鹽的添加量會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品硬度和黏附性降低。同時(shí)，質(zhì)構(gòu)還受pH值影響，不同的酸度通過(guò)影響蛋白質(zhì)凝膠的形成，會(huì)使最終產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)出現(xiàn)較大差異。

目前關(guān)于即食發(fā)酵肉制品的質(zhì)構(gòu)形成與蛋白質(zhì)水解程度、肌肉纖維的組織狀態(tài)變化（如粗絲和細(xì)絲、Z盤和胞間蛋白相關(guān)變化）以及蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)變化之間的相互關(guān)聯(lián)研究較少。可以采用掃描電子顯微鏡、低場(chǎng)核磁共振、激光粒度儀等觀察即食發(fā)酵肉制品中肌肉纖維的組織狀態(tài)并分析蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)，以解釋最終產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)的形成過(guò)程。

1.2 脂質(zhì)的變化

脂質(zhì)是原料肉的主要成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在25%～55%之間。熟化過(guò)程中脂質(zhì)的水解和氧化與即食發(fā)酵肉制品的感官特性密切相關(guān)[20]。脂質(zhì)含量的不同會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)的差異，在切片方面，當(dāng)肌肉中的脂質(zhì)含量超過(guò)5%時(shí)，即食發(fā)酵火腿就會(huì)表現(xiàn)出大理石花紋結(jié)構(gòu)[21]；在色澤方面，隨著肌肉內(nèi)脂質(zhì)含量的增加，產(chǎn)品切片的紅度和亮度會(huì)降低[22]；同時(shí)產(chǎn)品的風(fēng)味形成與脂質(zhì)的含量之間也有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。

伴隨著脂質(zhì)的水解，游離脂肪酸的含量增加，在熟化結(jié)束時(shí)，即食發(fā)酵肉制品中游離脂肪酸質(zhì)量占肌肉中總脂質(zhì)的8%～20%。不同類型的產(chǎn)品脂質(zhì)分解的速率存在較大差異，發(fā)酵火腿中，游離脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10 個(gè)月內(nèi)從1%～2%上升到10%～12%，與發(fā)酵火腿相比發(fā)酵香腸中脂質(zhì)的水解速度較快，游離脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1 個(gè)月內(nèi)可由1%～2%上升到4%～5%[23]。劉姝韻等[24]發(fā)現(xiàn)5種云南火腿脂肪酸的含量存在較大差別，但其組成比例較為相似，故不同產(chǎn)品之間品質(zhì)的差別可能部分是脂質(zhì)水解程度的差異造成的。

在氧化性物質(zhì)的作用下，水解生成的大量游離脂肪酸會(huì)被進(jìn)一步氧化，適度的脂質(zhì)氧化對(duì)多汁性、嫩度和風(fēng)味有積極的影響。其氧化形式主要有酶促氧化和自由基氧化，其中酶促氧化是指在內(nèi)源脂肪氧合酶催化下，多不飽和脂肪酸被氧化的反應(yīng)；自由基氧化包括引發(fā)、延伸和終止3 個(gè)步驟，引發(fā)是由自由基和其他一些氧化引發(fā)劑（包括活性氧和單線態(tài)氧等）所致，從脂肪酸中的亞甲基碳上除去一個(gè)氫以形成烷基，這一過(guò)程優(yōu)先作用于多不飽和脂肪酸。延伸步驟是自由基與氧反應(yīng)生成過(guò)氧基，而后從另一種脂肪酸中提取氫，形成過(guò)氧化氫。在終止步驟中過(guò)氧化氫分解，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)生成[25]。Li Binbin等[26]指出脂質(zhì)氧化與蛋白質(zhì)氧化關(guān)系密切，脂質(zhì)氧化可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化。

評(píng)價(jià)脂質(zhì)氧化的進(jìn)程一般用過(guò)氧化值（peroxide value，POV）和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值，POV和TBA值在即食發(fā)酵肉制品熟化過(guò)程中發(fā)生顯著變化。Koutina等[27]研究了帕爾瑪火腿的脂質(zhì)變化，并指出半膜肌中肌內(nèi)脂肪的脂質(zhì)氧化進(jìn)程比股二頭肌中快，在成熟的9 個(gè)月內(nèi)股二頭肌中POV增加，然后迅速下降，而半膜肌中的POV在成熟3 個(gè)月后即達(dá)到最大值。

1.3 風(fēng)味物質(zhì)的形成

化學(xué)反應(yīng)和微生物代謝反應(yīng)是即食發(fā)酵肉制品產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)主要方式，化學(xué)反應(yīng)包括脂肪酸氧化反應(yīng)、美拉德反應(yīng)以及蛋白質(zhì)的水解；微生物代謝反應(yīng)可進(jìn)一步分為碳水化合物發(fā)酵、氨基酸降解反應(yīng)、脂質(zhì)β氧化作用。風(fēng)味物質(zhì)形成的化學(xué)反應(yīng)和微生物代謝反應(yīng)示意圖如圖1所示。

圖1 即食發(fā)酵肉制品風(fēng)味物質(zhì)的形成反應(yīng)[28]Fig. 1 Reaction for the formation of flavor substances in ready-to-eat fermented meat products[28]

如前所述蛋白質(zhì)和脂質(zhì)經(jīng)過(guò)水解，產(chǎn)生的部分游離氨基酸和脂肪酸是形成風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)。其中脂質(zhì)產(chǎn)生的多種揮發(fā)性化合物（烷烴、醛、醇、酯和羧酸等）是特征風(fēng)味形成的主要因素[29]。脂質(zhì)中揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生通常需要兩步，第一步是脂質(zhì)在脂肪酶或磷脂酶的作用下生成游離脂肪酸，第二步是游離脂肪酸經(jīng)過(guò)氧化生成不同種類的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[30]。脂質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的羰基化合物與氨基酸進(jìn)行美拉德反應(yīng)，生成Strecker醛、α-酮酸和胺等物質(zhì)可作為反應(yīng)底物，產(chǎn)生揮發(fā)性化合物[31-32]。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的多肽也與特定的風(fēng)味有關(guān)，Rodríguez-Nu?ez等[33]研究表明，火腿中1 500～1 700 Da的多肽與呈味有關(guān)。

碳水化合物的發(fā)酵除產(chǎn)酸外，還產(chǎn)生大量風(fēng)味物質(zhì)和滋味物質(zhì)，如丙酮、3-羥基-2-丁酮、乙醇、乙酸和丁酸等[34]；發(fā)酵劑中的微生物群可以降解氨基酸，其中凝固酶陰性葡萄球菌和酵母菌降解氨基酸使其變?yōu)橄鄬?duì)應(yīng)的醛并產(chǎn)生揮發(fā)性較強(qiáng)的風(fēng)味化合物[35]；游離脂肪酸也可以通過(guò)脂質(zhì)β氧化反應(yīng)降解，產(chǎn)生短鏈脂肪酸和酮酸，β-酮酸通過(guò)脫羧反應(yīng)降解為甲基酮，并進(jìn)一步降解為仲醇。此外，不同的發(fā)酵肉制品中所使用的香料有所不同，最終產(chǎn)品所形成的特征滋味和風(fēng)味也有所差異。

2 即食發(fā)酵肉制品熟化終點(diǎn)的判斷

即食發(fā)酵肉制品熟化不足時(shí)產(chǎn)品的品質(zhì)和風(fēng)味不佳，而熟化過(guò)度時(shí)又易氧化過(guò)度導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，所以需要準(zhǔn)確判斷熟化終點(diǎn)。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，熟化終點(diǎn)的判斷大都是基于經(jīng)驗(yàn)性的，為實(shí)現(xiàn)集約化大規(guī)模生產(chǎn)，根據(jù)熟化過(guò)程中理化性質(zhì)的變化，研究者們?cè)噲D尋找一種標(biāo)志物或檢測(cè)方法來(lái)判斷熟化終點(diǎn)。常見(jiàn)有下列3種判斷方法。

根據(jù)蛋白質(zhì)水解變化率及產(chǎn)生的代謝物進(jìn)行判斷：馬曉鐘等[36]研究表明蛋白質(zhì)水解指數(shù)能夠直觀且快速地評(píng)價(jià)金華火腿的發(fā)酵程度。Degnes等[37]使用由靶向生成物（如氨基酸、多肽等）和非靶向生成物（如次黃嘌呤）所構(gòu)成的代謝物譜的變化來(lái)指示火腿的熟化程度，并為代謝物譜建立快速的定量分析方法。Gallego等[38]研究了西班牙火腿加工過(guò)程中在不同時(shí)間位于肌節(jié)Z線的LIM域結(jié)合蛋白的降解。用質(zhì)譜鑒定出不同時(shí)期的多種肽鏈，其中部分肽段具有作為發(fā)酵火腿加工生物標(biāo)志物的潛力。對(duì)于不同的品牌或類型的產(chǎn)品有著不同的蛋白質(zhì)水解率，且代謝產(chǎn)物的量也存在著差異，故實(shí)際生產(chǎn)中要根據(jù)具體產(chǎn)品的特性制定相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

采用數(shù)學(xué)模型分析熟化過(guò)程中不同時(shí)期的代謝產(chǎn)物進(jìn)行判斷：Bello等[39]提出了使用數(shù)學(xué)模型方法區(qū)分熟化過(guò)程中的不同階段，并確定了所涉及的各種參數(shù)，包括水分活度、發(fā)酵微生物種群（乳酸桿菌科、微球菌科）和代謝產(chǎn)物（乳酸、乙酸、總游離脂肪酸、總游離氨基酸）等。發(fā)酵香腸在干燥過(guò)程中水分會(huì)散失，采用數(shù)學(xué)模型描述香腸重量損失和含水量隨時(shí)間的變化，可用于判定香腸的熟化程度。

采用特定的儀器進(jìn)行輔助判斷：Fulladosa等[40]開(kāi)發(fā)了一種對(duì)發(fā)酵火腿表面進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析的儀器，主要原理是不同球形探針在3 個(gè)解剖位置上進(jìn)行單軸壓縮，用于模擬人手指的施力作用并記錄力和時(shí)間曲線來(lái)表征火腿的彈性參數(shù)，以判斷熟化終點(diǎn)。Prevolnik等[41]采用了近紅外光譜數(shù)據(jù)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)判定發(fā)酵火腿的成熟。使用光譜儀在400～2 500 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，通過(guò)2D Kohonen人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將樣本進(jìn)行分析，構(gòu)建熟化分類模型并選擇一個(gè)錯(cuò)誤率最低的模型用于判定熟化程度。近紅外光譜的應(yīng)用具有成本低、快速和對(duì)產(chǎn)品無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)，然而肉類樣品的異質(zhì)性和水分在紅外區(qū)域的高吸光度會(huì)導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果的偏差?？梢詫⒔t外光譜、雙能X射線吸收儀以及質(zhì)構(gòu)分析儀等其他檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，不僅可以檢測(cè)肉制品中的化學(xué)成分和肉質(zhì)屬性，還可以探究其組成如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的比例等，從而更好地標(biāo)定熟化終點(diǎn)。

3 即食發(fā)酵肉制品熟化過(guò)程中各影響因素的作用機(jī)制

在熟化過(guò)程中，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物經(jīng)微生物和酶的作用，部分轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，進(jìn)而影響了即食發(fā)酵肉制品的外觀、風(fēng)味和質(zhì)地。在熟化過(guò)程中發(fā)生的主要生化變化如圖2所示。

圖2 即食發(fā)酵肉制品熟化過(guò)程中發(fā)生的主要生化變化[1]Fig. 2 Major biochemical changes during the ripening process of ready-to-eat fermented meat products[1]

3.1 內(nèi)源酶的作用

3.1.1 內(nèi)源脂酶的作用

脂質(zhì)相關(guān)酶類主要包括脂肪酶和磷脂酶類。熟化過(guò)程中甘油三酯（triglycerides，TG）、磷脂在脂肪酶和磷脂酶的作用下進(jìn)行部分水解生成相應(yīng)的游離脂肪酸和甘油[42]。脂肪酶可分為酸性脂酶（溶酶體酸性脂酶，最適pH 4～5）、中性脂酶（激素敏感脂肪酶（hormonesensitive lipase，HSL），最適pH 7.0～7.5）、堿性脂酶（脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL），最適pH 8～9）[43]。發(fā)酵香腸中亞油酸是釋放最多的脂肪酸，其次分別是油酸、硬脂酸和棕櫚酸等，脂肪酸含量的差異可能與脂肪酶的專一性有關(guān)[44]。磷脂也是即食發(fā)酵肉制品熟化過(guò)程的主要水解底物。磷脂酶可分為5 類：磷脂酶A1、A2、B、C和D，熟化過(guò)程中磷脂酶一直保持較高的活力，且產(chǎn)生大量不飽和脂肪酸[4,45]。但是關(guān)于磷脂酶水解的作用方式及機(jī)理的研究較少。

酶解過(guò)程中脂肪ATGL主要降解TG，最先水解sn-1處的脂肪酸；HSL在中性條件下活躍于細(xì)胞質(zhì)中，水解TG和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）；單酰甘油脂肪酶（monoacylglycerol lipase，MGL）活性最強(qiáng)，水解1或2位的單酰甘油，所以在組織中沒(méi)有單酰甘油的積累[46]。他們之間具有一定的反應(yīng)催化順序，即TG在ATGL的作用下水解為DAG和1分子脂肪酸，再由HSL繼續(xù)催化，將DAG轉(zhuǎn)化為單酰甘油（monoacylglycerol，MAG）和1分子脂肪酸；最后由MGL發(fā)揮催化作用，將MAG分解為甘油和脂肪酸。為保證機(jī)體內(nèi)水解平衡，DAG和MAG還可通過(guò)二?；视王；D(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）和單?；视王；D(zhuǎn)移酶（monoacyglycerol acyltransferases，MGAT）發(fā)生酯化過(guò)程再次生成TG[47]。反應(yīng)過(guò)程如圖3所示。

圖3 TG水解過(guò)程[47]Fig. 3 Triglyceride hydrolysis process[47]

3.1.2 內(nèi)源蛋白酶的作用

蛋白質(zhì)的水解主要是通過(guò)內(nèi)源蛋白酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這類酶在肉的嫩化和即食發(fā)酵肉制品的風(fēng)味形成方面具有重要作用。即食發(fā)酵肉制品熟化過(guò)程中，內(nèi)源蛋白酶將蛋白質(zhì)和多肽水解為小肽并釋放出氨基酸，其又可分為內(nèi)肽酶和外肽酶，內(nèi)肽酶主要有組織蛋白酶B、L和鈣蛋白酶，外肽酶主要有氨基肽酶和羧肽酶。蛋白水解通常分為兩步：首先，內(nèi)肽酶分解完整的蛋白質(zhì)生成多肽；其次，生成的多肽被外肽酶進(jìn)一步降解，釋放出單個(gè)氨基酸、二肽和三肽，并伴隨有風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[43]。

即食發(fā)酵肉制品熟化過(guò)程中組織蛋白酶是引起蛋白質(zhì)降解和風(fēng)味物質(zhì)形成的主要內(nèi)肽酶，目前已從肌肉中分離鑒定出近20種組織蛋白酶。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室條件下模擬發(fā)酵香腸的熟化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B、D和L起主要作用，Berardo等[48]確定了組織蛋白酶B和D在水解蛋白質(zhì)過(guò)程中的特異性水解位點(diǎn)以及共同水解位點(diǎn)。組織蛋白酶B作用于肌動(dòng)蛋白并產(chǎn)生相應(yīng)的肽，這些肽大部分是由蛋白質(zhì)的N端和C端釋放的，且多數(shù)為水溶性多肽；組織蛋白酶D能夠快速降解肌聯(lián)蛋白、肌球蛋白重鏈及M蛋白和C蛋白；組織蛋白酶L作用于整個(gè)熟化階段[49]。鈣蛋白酶只在腌制初期參與肌肉中蛋白水解，由于水分活度的降低和較低pH值，其活性會(huì)被抑制。

氨基肽酶和羧肽酶是將小分子肽繼續(xù)分解為游離氨基酸的主要外肽酶。氨基肽酶（包括精氨酰、丙氨酰和焦谷氨酰氨基肽酶等）在水解過(guò)程中具有一定的活性，由于氨基肽酶的水解具有底物特異性，根據(jù)相應(yīng)生成的游離氨基酸濃度，可以確定其對(duì)水解的貢獻(xiàn)程度[50]。王德寶[51]研究表明丙氨酰氨基肽酶是促進(jìn)游離氨基酸釋放的主要外肽酶，其活性占總氨基肽酶活性的83%，并顯示出較強(qiáng)的底物特異性。精氨酰氨基肽酶又稱氨基肽酶B，是骨骼肌中第二重要的氨基肽酶，有助于產(chǎn)生堿性氨基酸，如精氨酸和賴氨酸?，F(xiàn)今對(duì)羧肽酶在熟化過(guò)程作用及其機(jī)制的研究還有待深入。即食發(fā)酵肉制品中內(nèi)源酶的類型以及作用如表1所示。此外，酶的水解活性受多種因素影響，例如由于鹽的抑制作用，組織蛋白酶B和L的活性降低到原來(lái)的9.3%和13.7%；溫度升高有利于酶對(duì)肌肉蛋白質(zhì)的降解，與5 ℃下發(fā)酵的火腿相比，30 ℃下股二頭肌的蛋白水解程度顯著增強(qiáng)?；鹜缺ｕr中常用到的超高壓處理也會(huì)影響酶的水解活性，Rivas-Ca?edo等[52]發(fā)現(xiàn)用600 MPa高壓處理火腿6 min，氨基肽酶活性降低了50%以上。

表1 即食發(fā)酵肉制品中內(nèi)源蛋白酶類型和作用Table 1 Types and functions of endogenous proteases in ready-to-eat fermented meat products

3.2 外源酶的作用

不同種類的酶參與即食發(fā)酵肉制品熟化過(guò)程中不同的生化反應(yīng)，內(nèi)源酶的含量及其產(chǎn)生作用的影響因素十分復(fù)雜，因此常通過(guò)添加外源酶的方式來(lái)改善發(fā)酵工藝。國(guó)內(nèi)外關(guān)于添加外源酶在即食發(fā)酵肉制品中作用效果的研究進(jìn)展如表2所示。

表2 外源酶在即食發(fā)酵肉制品中的作用效果Table 2 Effects of exogenous enzymes in fermented meat products

3.3 發(fā)酵劑的作用

微生物發(fā)酵劑可以在一定程度上提高即食發(fā)酵肉制品的品質(zhì)。首先它們可以起到抗氧化作用，避免因過(guò)度氧化而對(duì)產(chǎn)品造成的不利影響。同時(shí)，抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，降低亞硝酸鹽和生物胺的含量，分解碳水化合物產(chǎn)生乳酸和其他有機(jī)酸從而降低pH值，提高產(chǎn)品的安全性。此外，還可以促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪的降解，加速風(fēng)味物質(zhì)的形成，提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

發(fā)酵肉制品中作為發(fā)酵劑的微生物主要包括葡萄球菌、乳酸桿菌、微球菌、酵母菌和霉菌等。乳酸菌在發(fā)酵酸化階段起著主導(dǎo)作用；酵母菌耐鹽，發(fā)酵能力強(qiáng)，一般生長(zhǎng)在發(fā)酵肉表面；在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中，酵母菌很少單獨(dú)使用，多與乳酸菌、微球菌等共同完成發(fā)酵[69]。市面上大多數(shù)發(fā)酵劑也多由兩種或多種混合菌種組成。

3.3.1 抗氧化作用

蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化程度對(duì)最終產(chǎn)品的品質(zhì)有重要影響，過(guò)度氧化會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。微生物發(fā)酵劑具有一定的抗氧化作用，其抗氧化作用機(jī)制主要有3種。1）分泌抗氧化物質(zhì)如抗氧化酶、醇類物質(zhì)等，以抵抗氧化作用；2）調(diào)節(jié)信號(hào)通路；3）通過(guò)清除自由基，從而避免其對(duì)細(xì)胞的侵害[70]。Yu Di等[71]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)配發(fā)酵劑植物乳桿菌CD101和葡萄球菌NJ201有助于延緩干發(fā)酵香腸的氧化。Yang Xin等[72]發(fā)現(xiàn)通過(guò)飼喂雛雞植物乳桿菌，雛雞腸黏膜內(nèi)Nrf2及下游HO-1基因的mRNA水平上調(diào)，有效減輕了霉菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)雛雞的不良影響。馮美琴等[73]通過(guò)接種植物乳桿菌和葡萄球菌來(lái)制作發(fā)酵香腸，結(jié)果表明添加發(fā)酵劑的一組生成了多種具有抗氧化作用的多肽并有清除自由基的能力。

3.3.2 保證產(chǎn)品安全性

熟化過(guò)程中，發(fā)酵劑能夠抑制致病微生物生長(zhǎng)、限制亞硝胺的形成及降低亞硝酸鹽含量，保證了產(chǎn)品安全性。發(fā)酵前期，乳酸菌快速生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生大量乳酸，肉制品的pH值降低，抑制腐敗和致病性微生物的生長(zhǎng)繁殖[74]。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素也可以抑制致病菌的生長(zhǎng)繁殖，de Castilho等[75]研究了細(xì)菌素UFVNPAC1對(duì)豬肉香腸中單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌效果，結(jié)果表明，在10 d內(nèi)單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌落數(shù)從3.0（lg（CFU/g））降至1.5（lg（CFU/g））。一些乳酸菌含有致病性微生物的抗性基因（如酒井乳桿菌、彎乳桿菌和屎腸球菌中含有抗性基因entA、entB和entP），而對(duì)致病菌產(chǎn)生一定的抗性。牛天嬌等[76]將植物乳桿菌PL-ZL001添加到發(fā)酵香腸中發(fā)現(xiàn)其可以抑制6種生物胺的積累。在香腸中分別接種5（lg（CFU/g））和7（lg（CFU/g））的沙克乳酸桿菌C2，結(jié)果表明亞硝酸鹽含量隨著接種濃度的增加而降低[77]。

3.3.3 對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的降解作用

微生物發(fā)酵劑產(chǎn)生的脂酶和蛋白酶可以使生肉中的蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生降解，生成氨基酸、酯、肽和短鏈揮發(fā)性脂肪酸等。同時(shí)，隨著必需氨基酸含量的增加以及益生菌的存在增強(qiáng)了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)保健作用[78]。田星等[79]研究表明添加發(fā)酵劑的產(chǎn)品在微生物菌群多樣性和風(fēng)味品質(zhì)等方面均明顯優(yōu)于自然發(fā)酵肉制品。微球菌科具有降解脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的作用，如肉質(zhì)葡萄球菌和木糖葡萄球菌能顯著促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪的水解，改善色澤，促進(jìn)風(fēng)味的形成[80]。Chen Qian等[81]將以片球菌、戊糖乳桿菌作為發(fā)酵劑進(jìn)行香腸發(fā)酵，結(jié)果表明發(fā)酵劑組的香腸中游離脂肪酸含量均高于自然發(fā)酵組。不同發(fā)酵劑的作用下香腸中游離脂肪酸的種類不變，只是含量有所差異，所以只是增加了脂質(zhì)的水解程度，并未改變水解模式[82]。同種發(fā)酵劑對(duì)不同的脂質(zhì)水解能力有所差異，王德寶等[83]用木糖葡萄球菌和清酒乳桿菌發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)此類發(fā)酵劑分解磷脂能力比分解中性脂質(zhì)強(qiáng)。

目前，對(duì)于微生物發(fā)酵劑的研究主要集中在微生物多樣性、特定微生物對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響、特征風(fēng)味的形成等方面。微生物發(fā)酵劑可以抑制即食發(fā)酵肉制品中亞硝胺等有害化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)生，但具體機(jī)制尚無(wú)研究報(bào)道，且在熟化過(guò)程中發(fā)酵劑與內(nèi)源酶的相互作用機(jī)制還有待明確。

3.4 腌制劑的作用

食鹽是即食發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中重要的輔料，不僅可以使產(chǎn)品具有一定的咸味，而且能增加其鮮亮程度以及保水能力，有助于產(chǎn)品形成理想的凝膠質(zhì)地和感官品質(zhì)[84]。不同類型的產(chǎn)品中鹽的含量不同，成熟火腿中食鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%～12%，香腸中食鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%左右[85]。食鹽的添加有助于使水分活度保持在較低的水平，從而抑制致病微生物的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期[86]，如在火腿的腌制階段，當(dāng)腿肉中的食鹽平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.32%時(shí)，23.9 ℃發(fā)酵4周后，其中的旋毛蟲(chóng)即失去活性[8]。低水分活度對(duì)脂肪水解酶、脂肪氧化酶和磷脂酶等的活性也有影響，從而對(duì)即食發(fā)酵肉制品中脂質(zhì)氧化分解以及風(fēng)味物質(zhì)的形成具有調(diào)節(jié)作用[87]，也有一些研究報(bào)告表明食鹽可以促進(jìn)氧化，因?yàn)樗茐牧思?xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性從而促進(jìn)肉類產(chǎn)品中氧化劑與不飽和脂質(zhì)之間的氧化反應(yīng)。此外，由Na＋引起的血紅素結(jié)合蛋白釋放的鐵元素可提高氧化速率[88]。

亞硝酸鹽和硝酸鹽常以鈉鹽或鉀鹽的形式添加于即食發(fā)酵肉制品中，有助于形成獨(dú)特的色澤以及保證產(chǎn)品安全性。其呈色機(jī)理為：硝酸鹽在微生物還原酶的作用下形成亞硝酸鹽；亞硝酸鹽在酸性條件下（微生物發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸）會(huì)形成亞硝酸，亞硝酸的性質(zhì)不穩(wěn)定，在常溫下分解產(chǎn)生NO；亞硝酸鹽經(jīng)還原性物質(zhì)（如還原劑NADH）降解產(chǎn)生自由基（如NAD·）；生成的自由基將肉中的高鐵肌紅蛋白還原，NO與其還原產(chǎn)物反應(yīng)生成玫瑰紅色的亞硝基肌紅蛋白，同時(shí)氯化鈉與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝基氯化物加速了亞硝酸肌紅蛋白的形成[89]。此外，亞硝酸鹽可以抑制肉毒梭菌，對(duì)即食發(fā)酵肉制品的生物安全性有一定的作用[90]。

4 結(jié) 語(yǔ)

即食發(fā)酵肉制品在熟化過(guò)程中理化性質(zhì)發(fā)生改變，形成了其獨(dú)特的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，本文重點(diǎn)闡述了熟化變化規(guī)律以及酶、發(fā)酵劑和腌制劑等的作用機(jī)制。熟化不是單一因素作用的結(jié)果，在即食發(fā)酵肉制品熟化的研究中有許多問(wèn)題亟待解決，主要體現(xiàn)在以下4 個(gè)方面：1）對(duì)于熟化終點(diǎn)的判斷依據(jù)，至今暫無(wú)相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。2）目前對(duì)于熟化過(guò)程中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的變化，大部分停留在定性判斷和定量層面，很少關(guān)注其自身微觀結(jié)構(gòu)的改變，如蛋白質(zhì)在熟化前后微觀結(jié)構(gòu)的差異。3）與熟化相關(guān)的酶類眾多且復(fù)雜，尚未完全確認(rèn)它們?cè)谑旎^(guò)程的專一性以及具體的反應(yīng)歷程。4）熟化的影響因素之間相互作用機(jī)制不明確，如發(fā)酵劑與腌制劑之間的相互作用機(jī)制等。

熟化過(guò)程中所發(fā)生的變化廣泛涉及食品研究的多種領(lǐng)域。通過(guò)整合相關(guān)研究數(shù)據(jù)，利用大數(shù)據(jù)模擬的方法可以更好地了解產(chǎn)品在熟化過(guò)程中的演變。將熟化過(guò)程中發(fā)生的熱力學(xué)轉(zhuǎn)變、脂解率和蛋白質(zhì)水解率、水分活度的變化和微生物的生長(zhǎng)情況等研究數(shù)據(jù)，整合到有效的模擬工具中，分析產(chǎn)品熟化過(guò)程中的每個(gè)階段，優(yōu)化出適宜的加工條件（鹽漬或發(fā)酵溫度等），使產(chǎn)品具有更好的同質(zhì)性并降低生產(chǎn)成本?？衫矛F(xiàn)代先進(jìn)技術(shù)，如采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究肌肉細(xì)胞、組織以及蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律，結(jié)合高效液相色譜法探究其水解底物的特異性以及相關(guān)酶類的作用位點(diǎn)和作用方式；并采用掃描電子顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)的變化。利用現(xiàn)代基因工程優(yōu)化發(fā)酵劑中微生物的功能，如在發(fā)酵劑菌株中插入相應(yīng)的致病菌抗性基因，以保證產(chǎn)品安全性。關(guān)于建立與熟化過(guò)程中相關(guān)酶類的純化方法并揭示其作用方式，也是今后的研究重點(diǎn)之一。通過(guò)對(duì)即食發(fā)酵肉制品的深入研究，為肉制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)，為消費(fèi)者提供優(yōu)質(zhì)美味的發(fā)酵產(chǎn)品。