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    胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒質量分析

    2022-05-30 03:26:08曲守方胡澤斌孫楠黃傳峰黃杰
    分子診斷與治療雜志 2022年4期
    關鍵詞:嵌合體整倍體高通量

    曲守方 胡澤斌 孫楠 黃傳峰 黃杰

    染色體非整倍體(Chromosome Aneuploidies)是指相對于人正常的46 條染色體而言,某一條或幾條染色體數目增加或減少,與嬰幼兒期顯著的發(fā)病率和死亡率有著密切的關系。其中唐氏綜合征(Trisomies 21)、愛德華氏綜合征(Trisomies 18)和帕陶氏綜合征(Trisomies 13)是臨床上最常見的染色體非整倍體疾?。?-3]。產前診斷金標準方法是以創(chuàng)傷性的手術取材方法結合實驗室細胞遺傳學診斷對胎兒染色體進行核型分析,但有創(chuàng)取樣容易導致破水、羊膜腔炎、陰道出血、胎兒刺傷甚至是流產等問題[4]。

    隨著母體游離胎兒DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)的發(fā)現和高通量測序技術的發(fā)展成熟,無創(chuàng)胎兒染色體疾病產前檢測(Noninvasive Prenatal Testing,NIPT)成為可能[5]。中國食品藥品檢定研究院于2014年研制高通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體(T21、T18 和T13)國家參考品,用于NIPT 試劑盒的上市前的注冊檢測。2021年國家藥品監(jiān)督管理局批準胎兒染色體非整倍體21 三體、18 三體和13 三體檢測試劑盒(高通量測序法)行業(yè)標準的發(fā)布,用于規(guī)范該類產品的標準。本研究使用國家藥品監(jiān)督管理局批準的胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒,對產品技術要求中的陰性參考品符合率、檢測限、微缺失微重復參考品符合率和嵌合體參考品符合率等項目進行考察,評價市場上使用的NIPT 試劑盒質量。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    高通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體(T21、T18 和T13)國家參考品,中國食品藥品檢定研究院提供。

    胎兒染色體非整倍體(T13/T18/T21)檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)(簡稱試劑盒A)和Next-Seq CN500 基因測序儀,杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司提供。

    胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)(簡稱試劑盒B)和Next-Seq550AR 基因測序儀,安諾優(yōu)達基因科技(北京)有限公司提供。

    胎兒染色體非整倍體(T13、T18、T21)檢測試劑盒(可逆末端終止測序法)(簡稱試劑盒C)和NextSeq550AR 基因測序儀,杭州杰毅麥特醫(yī)療器械有限公司提供。

    胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒(聯合探針錨定聚合測序法)(簡稱試劑盒D)和BGISEQ-500 基因測序儀,華大生物科技(武漢)有限公司提供。

    胎兒染色體非整倍體21 三體、18 三體和13 三體檢測試劑盒(半導體測序法)(簡稱試劑盒E)和DA8600 半導體測序儀,廣州市達瑞生物技術股份有限公司提供。

    胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒(半導體測序法)(簡稱試劑盒F)和BioelectronSeq 4000測序儀,東莞博奧木華基因科技有限公司提供。

    1.2 方法

    1.2.1 血漿游離DNA 提取

    采用試劑盒說明書推薦的核酸提取試劑,提取國家參考品的血漿游離DNA。

    1.2.2 文庫的制備

    采用6 家胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒,對血漿游離DNA 進行文庫構建。先將血漿游離DNA 片段末端修復,然后在DNA 片段末端進行接頭連接(或者繼續(xù)進行PCR 擴增),獲得文庫。使用核酸提取或純化試劑對文庫進行純化,測定各個文庫的濃度,并進行文庫的質量檢測。

    1.2.3 測序

    將定量的文庫,按照試劑盒規(guī)定的比例進行混合。將混合文庫加到測序芯片上,使用胎兒染色體非整倍體(T13/T18/T21)檢測試劑盒配套的基因測序儀檢測。

    1.2.4 數據分析

    使用試劑盒說明書指定的數據分析軟件,進行序列比對及數據統(tǒng)計分析。計算13 號、18 號、21 號染色體的Z 值。根據試劑盒的參考值范圍和Z 值大小,進行樣本染色體非整倍體的判定,如果樣本的染色體Z 值大于等于或者大于試劑盒的相應染色體參考值,判定為該染色體非整倍體。

    2 結果

    2.1 陰性參考品符合率

    對于胎兒游離DNA 10%濃度的國家陰性參考品,包括29 個非21、18 和13 三體的其他染色體非整倍體樣本和6 個染色體正常的陰性樣本,6 個不同試劑盒結果顯示均未檢出21 三體、18 三體和13三體。對于其他染色體非整倍體樣本,試劑盒C不僅報告試劑盒范圍內的21、18 和13 號染色體非整倍體的結果,Z 值均小于3.2;而且報告對性染色體和試劑盒范圍外的其他染色體非整倍體的結果,對于25 個其他染色體非整倍體樣本檢出了21個相應染色體非整倍體陽性,4 個性染色體非整倍體樣本檢出了2 個陽性。見圖1。

    圖1 試劑盒C 陰性參考品的結果Figure 1 Results of national negative reference by kit C

    2.2 檢測限

    對于72 個胎兒游離DNA 5%濃度的T21、T18和T13 樣本(包括高GC PCR 產物和膽紅素的干擾樣本)和50 個胎兒游離DNA 3.5%濃度的T21、T18 和T13 樣本的國家檢測限參考品,5%濃度的國家檢測限參考品結果顯示試劑盒均能正確檢出相應染色體三體,準確檢出率均是100%;3.5%濃度國家檢測限參考品結果顯示試劑盒B 檢出48個,準確檢出率為96%;其余試劑盒均檢出50 個,準確檢出率是100%。見圖2。

    圖2 國家檢測限參考品結果(3.5%)Figure 2 Results of national limit reference(3.5%)

    2.3 微缺失微重復參考品符合率

    對于胎兒游離DNA 10%濃度的國家微缺失微重復參考品,包括2 個18 號染色體微重復的樣本和8 個其他染色體微缺失的樣本,18 號染色體微重復的樣本結果顯示試劑盒均能正確檢出18 三體高風險,18 號染色體的Z 值均大于試劑盒的陽性判斷值,同時13 三體低風險和21 三體低風險,見圖3;而另外8 個其他染色體微缺失的樣本結果顯示試劑盒均未檢出21 三體、18 三體和13 三體。

    圖3 18 號染色體國家微重復參考品的結果Figure 3 Results of national microduplication reference with chromosome 18

    2.4 嵌合體參考品符合率

    對于70%和30%嵌合比例的國家嵌合體參考品,試劑盒能夠全部正確檢出相應染色體三體,相應染色體的Z 值均大于試劑盒的陽性判斷值,表明試劑盒能夠正確檢測出一定嵌合比例的嵌合體樣本。見圖4。

    圖4 國家嵌合體參考品的結果Figure 4 Results of national chimera reference

    3 討論

    隨著出生缺陷防控的需求和優(yōu)生優(yōu)育意識的增強,產前篩查和診斷越來越受到重視。與傳統(tǒng)的絨毛活檢、羊水穿刺或者臍靜脈血穿刺等介入性檢測相比,NIPT 因其操作便捷、安全性高和準確率高等多方面的優(yōu)勢受到青睞[6-7]。從目前注冊檢測的試劑盒情況可以看到,胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒的發(fā)展呈現多家生產企業(yè)、多種高通量測序平臺(聯合探針錨定聚合測序法、可逆末端終止測序法和半導體測序法)和多種檢測方法(如全基因組低深度的高通量測序法、基于SNP 位點的靶向測序技術和基因芯片技術等)的特點。隨著行業(yè)技術水平的提高,NIPT 針對于胎兒染色體異常的檢測也由21 號、18 號和13 號染色體三體進一步擴展至性染色體數目異常、其他的常染色體數目異常以及各種染色體微缺失/微重復等[8-10]。

    本研究參考擬實施的推薦性行業(yè)標準YY/T 1801-2021 胎兒染色體非整倍體21 三體、18 三體和13 三體檢測試劑盒(高通量測序法),使用國家參考品對批準上市的胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒的質量進行評價[11-12]。研究報道cffDNA 含量低于4%時,NIPT 檢測可能失敗或出現假陰性結果[13]?,F有的商業(yè)NIPT 分析需要至少4%的胎兒比例[14-15]。因此國家檢測限參考品設置了5%和3.5%胎兒DNA 濃度的不同21 號、18 號和13 號染色體三體樣本,用于對試劑盒的檢測限性能評價。隨著檢測技術的提高,國家參考品的檢測限要求對胎兒DNA 濃度3.5%的檢測限參考品由至少10 個以上的檢出提高到必須有25 個以上的檢出。3.5%濃度的國家檢測限參考品的檢測結果表明試劑盒的正確檢出率均大于50%。國家嵌合體參考品設置了70%和30%嵌合比例的不同三體樣本,用于對試劑盒的嵌合體檢測性能的評價。嵌合體參考品的檢測結果表明試劑盒均能正確檢出30%嵌合比例的三體樣本。18 號染色體國家微重復參考品包含了18 號染色體20 Mb 以上重復,要求試劑盒均能檢出18 號染色體三體,結果表明試劑盒能夠滿足要求。本次研究結果顯示抽檢的產品均無不合格的產品。但是通過對國家參考品的檢測結果進行分析時,發(fā)現有的產品的軟件解讀結果存在著超出檢測范圍的內容,包括對性染色體非整倍體和試劑盒范圍外的其他染色體非整倍體的檢測結果,并不符合批準的試劑盒對胎兒染色體非整倍體疾病21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征進行產前輔助判斷的范圍,建議應對產品的分析軟件進行相應的修改。本次抽檢到的產品在行業(yè)標準實施前都已獲得注冊證,企業(yè)都以各自的產品標準或產品技術要求作為其檢驗的執(zhí)行標準,但其產品標準或產品技術要求中檢測項目與行業(yè)標準還是存在一定的差異和問題,企業(yè)需要根據行業(yè)標準及國家參考品的要求,對自身的技術要求進一步完善,從而保證檢測試劑盒的有效性。

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