抗纖益心方通過調(diào)節(jié)RhoA/ROCK2信號通路改善擴張型心肌病大鼠心肌纖維化*

楊鳳鳴，邊汝濤，王振濤

河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以心室擴大并伴有收縮功能障礙為特征的非缺血性心肌病，臨床以心力衰竭為主要表現(xiàn)，并可出現(xiàn)心律失常、猝死等并發(fā)癥[1]?；颊卟∏槌蔬M行性加重，常因心力衰竭癥狀加重而反復(fù)住院，約50%的患者可在5年內(nèi)出現(xiàn)死亡，臨床預(yù)后差。目前，本病治療方案同其他原因引起的心力衰竭相似，以β受體阻滯劑、利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等藥物為主，尚無特異性治療藥物[2]。

抗纖益心方是河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院王振濤教授根據(jù)DCM的病機特點研制的有效方藥，方藥組成：黃芪30 g，紅參12 g，丹參15 g，茯苓15 g，升麻9 g，益母草15 g，澤蘭15 g，麥冬12 g，白術(shù)15 g。方中重用黃芪以補宗氣，紅參善補脾胃又可大補元氣，白術(shù)可運脾強胃，進而維持胃納脾運正常，輔以升麻升陽舉陷；因DCM患者病機復(fù)雜，常有瘀血、水濕停留，故加入茯苓、益母草、丹參、澤蘭等化瘀利水，佐以麥冬防止過燥傷陰。前期研究表明，本方不僅可以改善DCM患者心功能，促進心室逆重構(gòu)[3]，還可以減輕DCM大鼠心肌組織病理損傷，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性改善膠原合成和降解之間的平衡，降低心肌間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達水平[4-6]，但其抑制心肌纖維的機制仍不明確。研究表明，Ras 同源蛋白家族成員A (ras homologous family member A，RhoA)及調(diào)控因子Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶2(rho associated coiled coil forming protein kinase 2，ROCK2)在心肌纖維化中發(fā)揮重要的作用[7]，本研究以RhoA/ROCK2 信號通路為切入點，建立DCM大鼠模型，探討抗纖益心方抑制心肌纖維化的可能作用機制，為臨床治療DCM提供新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物4周齡SPF 級Wistar雄性大鼠80只，體質(zhì)量為(50±18)g，購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證編號：SYXK(京)-2016-0006，飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院實驗動物中心，恒溫恒濕，溫度控制在(22±2) ℃，濕度為50%～60%，12 h/12 h明暗交替。所有動物實驗操作均符合相關(guān)管理準則并通過河南省中醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查(審查批號：2019-03-07)。

1.2 藥物與試劑抗纖益心方顆粒(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，批號：17010092)；卡托普利(上海信誼藥廠有限公司，規(guī)格：每片20 mg，批號：63470904)；呋喃唑酮(天津力生制藥股份有限公司，規(guī)格：每片0.1 g，批號：1905012)。HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1120、G1340)；可溶性生長刺激表達基因2蛋白(soluble growth stimulating factor 2，sST2)試劑盒、半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E13789h、CSB-EL012887RA)；β-actin、RhoA抗體、ROCK2抗體、肌球蛋白磷酸酶靶標亞基1(myosin phosphatase target subunit 1，MYPT1)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號：60008-1-LG、10749-1-AP、21645-1-AP、22117-1-AP)；磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶標亞基1(phospho-MYPT1，p-MYPT1)抗體(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：4563T)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的兔抗山羊lgG、HRP標記的山羊抗小鼠lgG(武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：GB23204、GB23301)。

1.3 儀器Acuson Cypress型西門子超聲儀(德國西門子公司)；FC-51119150型酶標儀(賽默飛儀器有限公司)；HD-330型生物切片機(湖北惠達儀器有限公司)；ICES-003型高倍顯微鏡(日本尼康公司)；170-4070型垂直電泳儀、170-8265型凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 模型建立、分組與給藥4周齡SPF 級Wistar雄性大鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機數(shù)字表法選取10只作為正常組，其余70只參照本課題組前期造模方法，用呋喃唑酮溶液(700 mg·L-1)自飲水喂養(yǎng)建立DCM模型[8-9]。10周后行超聲心動圖檢測，與正常組比較，造模大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)顯著升高(P<0.01)，左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular short axis shortening rate，LVFS)顯著降低(P<0.01)為造模成功。將45只造模成功大鼠隨機分為模型組、抗纖益心方高、中、低劑量組及卡托普利組，每組9只。根據(jù)人與實驗動物用藥劑量換算方法[10]，大鼠的等效劑量相當(dāng)于人的 6.3 倍，抗纖益心方顆粒成人每日用量17.2 g，成年人體質(zhì)量按60 kg計算，抗纖益心方高、中、低劑量組大鼠按3.6 g·kg-1、1.8 g·kg-1、0.9 g·kg-1的劑量灌胃，卡托普利組大鼠灌胃劑量為 10.125 mg·kg-1，正常組、模型組灌胃等體積的生理鹽水。藥物干預(yù)同時，除正常組，其余組大鼠繼續(xù)飲用呋喃唑酮溶液以保證致病因素的持續(xù)存在。藥物連續(xù)干預(yù)4周，末次給藥后禁食不禁水12 h，采用體積分數(shù)4%水合氯醛以8 mL·kg-1劑量腹腔注射麻醉，麻醉成功后進行各指標檢測。

2.2 心臟功能檢測將大鼠仰臥位固定于大鼠板上，選擇合適角度通過M型超聲心動圖在左側(cè)胸骨旁檢測LVEDD、LVESD，選取3個不同心動周期結(jié)果取平均值，采用Teichholtz法[11]，計算大鼠LVEF和LVFS。

2.3 病理組織學(xué)檢查腹主動脈取血后迅速開胸摘取心臟，在預(yù)冷的無菌生理鹽水中沖洗殘留血液，切取部分左心室組織用體積分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定。將固定好的心室組織包埋脫水后以5 μm厚度行石蠟切片，根據(jù)試劑盒提供的方法行HE染色和Masson染色，隨機選擇5個視野進行觀察，光學(xué)顯微鏡下觀察各組心肌組織中肌紅蛋白、細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)及心肌纖維化情況并記錄，并計算每張切片心肌中膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)[12]。

2.4 ELISA法檢測血清中sST2和Gal-3的水平超聲檢測后，在無菌工作臺用無菌手術(shù)剪打開腹腔，分離出腹主動脈進行取血，每只約2 mL，室溫靜置30 min，3 000 r·min-1離心15 min，取上清即為血清。按照試劑盒說明書檢測血清中sST2和Gal-3的水平。

2.5 Western Blot法檢測心肌組織中RhoA、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1蛋白表達水平將心室組織在RIPA裂解緩沖液中勻漿，離心后提取總蛋白上清液。BCA法蛋白定量后電泳分離總蛋白，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂蛋白奶粉 37 ℃ 封閉，4 ℃過夜孵育一抗(RhoA、ROCK2、MYPT1及p-MYPT1稀釋比例分別為：12 000、11 500、12 000、1500)。洗滌后二抗孵育 1.5 h(特異性兔抗山羊IgG抗體145 000稀釋；山羊抗小鼠IgG抗體16 000稀釋)?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒顯影，Image Lab凝膠圖像系統(tǒng)分析各條帶的光密度值，以β-actin為內(nèi)參標化各樣品蛋白電泳條帶的光密度值，以正常組蛋白表達水平為基準進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 抗纖益心方對DCM大鼠心臟功能的影響在藥物干預(yù)過程中，模型組大鼠死亡2只，抗纖益心方中、低劑量組大鼠各死亡1只，正常組和卡托普利組大鼠因灌胃操作不當(dāng)各死亡1只。超聲心動圖檢查大鼠心臟功能發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠LVEDD、LVESD顯著升高(P<0.01)，LVEF、LVFS顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組和卡托普利組大鼠LVEDD、LVESD顯著降低(P<0.05)，LVEF、LVFS顯著升高(P<0.05)，而抗纖益心方低劑量組大鼠的心功能改善不明顯。見表1。

表1 各組大鼠心臟功能的比較

3.2 抗纖益心方對DCM大鼠心肌組織病理的影響HE染色顯示，正常組大鼠心肌細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠心肌腫大、紊亂、死亡，肌紅蛋白排列紊亂；抗纖益心方高、中劑量組和卡托普利組大鼠心肌細胞水腫減輕，肌紅蛋白排列改善明顯；而抗纖益心方低劑量組大鼠病理改善不明顯，仍有大量心肌細胞腫大、肌紅蛋白排列紊亂。Masson染色結(jié)果顯示，正常組大鼠心肌組織膠原蛋白沉積不明顯。與正常組比較，模型組大鼠心肌組織膠原蛋白過度沉積，心肌纖維化明顯，CVF顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組和卡托普利組大鼠心肌組織膠原蛋白沉積改善，心肌纖維化明顯減輕，CVF顯著降低(P<0.05)；而抗纖益心方低劑量組大鼠心肌組織膠原蛋白沉積改善不顯著。見圖1-圖2，表2。

表2 各組大鼠CVF結(jié)果的比較

注：A：正常組；B：模型組；C：抗纖益心方高劑量組；D：抗纖益心方中劑量組；E：抗纖益心方低劑量組；F：卡托普利組

注：A：正常組；B：模型組；C：抗纖益心方高劑量組；D：抗纖益心方中劑量組；E：抗纖益心方低劑量組；F：卡托普利組

3.3 抗纖益心方對DCM大鼠血清中sST2和Gal-3含量的影響與正常組相比，模型組大鼠血清中sST2和Gal-3含量明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，抗纖益心方高、中劑量組和卡托普利組大鼠血清中sST2和Gal-3含量降低(P<0.05)，抗纖益心方低劑量組大鼠血清中sST2和Gal-3的水平變化不顯著。見表3。

表3 各組大鼠血清中sST2和Gal-3含量的比較

3.4 抗纖益心方對DCM大鼠心肌組織中RhoA、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1蛋白表達水平的影響與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中RhoA、ROCK2蛋白表達水平顯著升高(P<0.01),MYPT1蛋白磷酸化水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組與卡托普利組RhoA、ROCK2蛋白表達水平降低(P<0.05)，MYPT1蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.05)；而抗纖益心方低劑量對各蛋白的表達量無明顯影響。見圖3，表4。

注：A：正常組；B：模型組；C：抗纖益心方高劑量組；D：抗纖益心方中劑量組；E：抗纖益心方低劑量組；F：卡托普利組

表4 各組大鼠RhoA、ROCK2、MYPT1及p-MYPT1蛋白表達的比較

4 討論

DCM根據(jù)臨床表現(xiàn)與中醫(yī)的“心脹”“喘證”“胸痹”等相對應(yīng)。既往研究認為，DCM多為心氣虧虛。本課題組通過長期理論研究和臨床觀察發(fā)現(xiàn)宗氣下陷為DCM的基本病機，在宗氣“貫心脈”理論指導(dǎo)下，研制了具有益氣活血的方藥抗纖益心方，在臨床使用中根據(jù)患者舌脈、心率、血壓等變化調(diào)整使用劑量，取得了良好的療效?？估w益心方作為中藥復(fù)方，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，其可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡、細胞能量代謝及部分與心肌纖維化相關(guān)的蛋白而發(fā)揮作用[13-14]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，抗纖益心方組成藥物中的黃芪甲苷、黃芪多糖、人參皂甙Re等有效成分具有抑制心肌纖維化作用[15-16]，這可能是本方發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

心室重構(gòu)是DCM的主要病理表現(xiàn)，而過度的心肌纖維化使心室收縮、舒張功能受損，是導(dǎo)致本病惡化的重要機制[17-18]。在DCM的早期，心肌細胞代謝異常可導(dǎo)致細胞凋亡、壞死，而心肌為了維持收縮功能導(dǎo)致纖維化增加，過度的心肌纖維化可增加心肌的硬度、降低心臟功能、改變心臟電生理結(jié)構(gòu)。心肌纖維化的主要特征在于膠原代謝的異常和心肌各型細胞比例的失調(diào)，而膠原代謝失調(diào)主要來源于心肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化和膠原蛋白的異常分泌，進而導(dǎo)致各型膠原比例失調(diào)。心肌纖維化受多種刺激因子調(diào)控，如血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、兒茶酚胺、生長轉(zhuǎn)化因子-β1等。研究表明，呋喃唑酮可通過抑制兒茶酚胺清除，導(dǎo)致心肌細胞腫脹、壞死，進而導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生[19]，能夠反應(yīng)DCM心室重構(gòu)的病理過程，故本研究選用呋喃唑酮復(fù)制的DCM大鼠模型用于抗纖益心方的機制研究?？ㄍ衅绽鳛橹委烡CM的基礎(chǔ)用藥，可改善并抑制心肌纖維化[20]，因此本實驗選擇卡托普利作為陽性對照藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，抗纖益心方可以改善心臟功能，抑制DCM大鼠心肌纖維化水平，改善心肌組織病理損傷，與前期研究結(jié)果一致[4-8]。

近年來，多種血清標志物用于預(yù)測心肌纖維化與不良事件之間潛在聯(lián)系，sST2和Gal-3作為心肌纖維化的生物標志物和心力衰竭、DCM患者預(yù)后評估的重要指標[21]。多項研究證實，抑制Gal-3水平會減緩心肌纖維化的進展。本研究發(fā)現(xiàn)，抗纖益心方可以降低模型大鼠血清中sST2和Gal-3含量，可能與改善心肌纖維化水平有關(guān)。此外，在DCM心肌中存在神經(jīng)體液系統(tǒng)的過度激活，而過度激活的RAS系統(tǒng)可升高心肌局部AngⅡ 水平，AngⅡ 作為重要的神經(jīng)體液因子，不僅對心血管系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)功能，還是多種病理活動的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ 可通過激活RhoA/ROCK2信號通路表達促進心肌纖維化的發(fā)生，但其機制仍需進一步探索。

RhoA屬于小Ras超家族中小分子G蛋白之一，生理狀態(tài)下參與平滑肌收縮、細胞分裂和細胞運動等。RhoA及下游效應(yīng)分子ROCK是細胞內(nèi)多種信號通路的中轉(zhuǎn)站[22]。ROCK包括兩個高度同源亞基，即ROCK1和ROCK2，兩者普遍存在于各種組織中。ROCK2過度激活可促進成纖維細胞轉(zhuǎn)分化，使膠原蛋白代謝失衡，從而引起心肌纖維化[23-24]。目前研究認為，ROCK2是平滑肌收縮功能中最重要的下游效應(yīng)靶蛋白，其表達水平可通過檢測其下游底物MYPT1磷酸化水平評估。因此，MYPTI與p-MYPTI的表達水平?？煞从砇OCK的活性[25]。RhoA/ROCK2信號通路在成纖維細胞增殖、轉(zhuǎn)分化中占有重要的地位，既可以直接促進肌成纖維細胞對膠原蛋白的分泌，也可以激活其他纖維化相關(guān)信號通路，因此，抑制RhoA/ROCK2信號通路過度上調(diào)是治療心肌纖維化的新靶點[26-27]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，DCM模型大鼠心肌組織中RhoA/ROCK2信號通路過度激活，而抗纖益心方可以通過調(diào)節(jié)RhoA/ROCK2信號通路中關(guān)鍵分子RhoA、ROCK2、p-MYPTI的表達水平抑制心肌纖維化。

綜上所述，抗纖益心方可能是通過調(diào)節(jié)RhoA/ROCK2信號通路的表達發(fā)揮改善DCM大鼠心肌纖維化的作用。本研究為臨床上DCM的治療提供理論依據(jù)，并為更好地了解抗纖益心方的作用機制提供新的信息。