荷斯坦牛高、低乳脂率牛乳代謝組分析

王 影，文 亮，母 童，馮小芳，劉佳敏，張 娟，溫 萬(wàn)，顧亞玲*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，銀川 750000；3.寧夏畜牧工作站，銀川 750001)

乳腺是哺乳動(dòng)物特有的器官，其內(nèi)部具有大量能夠泌乳的腺泡。腺泡外圍排列著單層乳腺上皮細(xì)胞(mammary epithelial cells, MECs)，腺泡腔位于腺泡中央，主要負(fù)責(zé)將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳汁。乳汁中的成分包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、維生素、礦物質(zhì)和生物活性因子等，在生產(chǎn)上主要提供犢牛生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗體。其中，乳脂肪是牛乳中能量的攜帶者，主要有兩個(gè)來(lái)源：分別為脂肪酸的從頭合成和血液中長(zhǎng)鏈脂肪酸的攝取。研究表明，牛乳中的各項(xiàng)成分受遺傳、地理位置、生活環(huán)境、哺乳期和營(yíng)養(yǎng)水平等諸多因素影響，其中乳脂的變化受營(yíng)養(yǎng)水平調(diào)控影響最為顯著。且牛乳對(duì)人類及動(dòng)物都是非常重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，人類對(duì)于牛乳的脂肪及蛋白具有特殊需求，因此，對(duì)乳脂合成的研究在奶牛育種改良過(guò)程中仍然是重中之重。

繼1999年Nicholson等提出“metabonomics”的概念后，代謝組學(xué)逐漸應(yīng)用于人類、動(dòng)物、植物的生理學(xué)、遺傳學(xué)、藥物研究以及疾病機(jī)理等多個(gè)相關(guān)領(lǐng)域的小分子代謝物測(cè)定。代謝組學(xué)可以通過(guò)對(duì)代謝產(chǎn)物的分析來(lái)確定外源刺激因素對(duì)機(jī)體的影響，代謝物作為基因與物體表觀之間的橋梁，可以更加直觀地揭示所研究基因的功能。Sundekilde 等通過(guò)對(duì)牛乳的代謝物和體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count，SCC)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)牛乳SCC升高時(shí)，代謝物乳酸、丁酸、異亮氨酸、乙酸和β-羥丁酸增加，馬尿酸和富馬酸減少，這些代謝物可作為牛乳質(zhì)量鑒定的潛在標(biāo)志物，也可進(jìn)一步用于乳房炎的診斷。侯昆在牛乳中添加青蒿素，研究牛乳代謝及調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)青蒿素可能通過(guò)抑制磷脂酰膽堿和溶血磷脂含量的增加，顯著下調(diào)α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝和甘油磷脂的代謝通路，進(jìn)而影響奶牛乳腺中脂質(zhì)代謝。付力立對(duì)圍產(chǎn)前期奶牛補(bǔ)飼酵母硒，發(fā)現(xiàn)有97種顯著差異代謝物存在于初乳與常乳中，且從初乳過(guò)渡到牛乳時(shí)，代謝物的變化可以改變犢牛對(duì)氨基酸、促氮代謝物及能量的獲取。

目前，我國(guó)荷斯坦牛乳中乳脂指標(biāo)仍未達(dá)到人類機(jī)體需求的含量，且代謝組學(xué)對(duì)牛乳不同乳脂水平研究報(bào)道較少。因此本研究篩選出乳脂率具有極端差異的荷斯坦奶牛各13頭，收集乳樣進(jìn)行代謝組學(xué)分析，篩選顯著差異代謝物及高乳脂潛在標(biāo)志性差異代謝物，為研究奶牛泌乳過(guò)程提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集 新鮮牛乳樣品采自寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)茂盛牧場(chǎng)，試驗(yàn)牛飼喂相同的平衡全混合日糧(表1)。選擇體重與月齡相近，處于泌乳中后期(180～210 d)的第一胎次荷斯坦牛245頭。采集每頭奶牛早、中、晚(4∶3∶3混合)3個(gè)班次的乳樣于50 mL專用集奶杯中(另外將所有奶樣再分裝一份至1.8 mL凍存管中，液氮速冷30 s，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱用于代謝組測(cè)序)，隨即送往吳忠農(nóng)牧局進(jìn)行奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定(dairy herd improvement，DHI)，篩選體細(xì)胞數(shù)在20萬(wàn)個(gè)·mL以內(nèi)，乳脂率在4.4%以上和3.0%以下的奶牛各13頭。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.1.2 主要儀器和試劑 儀器采用德國(guó)Thermo Fisher公司的Vanquish UHPLC系統(tǒng)與德國(guó)Thermo Fisher公司的Orbitrap Q ExactiveHF質(zhì)譜聯(lián)用儀。甲醇、甲酸、醋酸銨均為L(zhǎng)C-MS Grade純度(美國(guó)Thermo Fisher公司)，水(德國(guó)Merck公司)。

1.1.3 牛乳樣品處理 將牛乳樣品從-80 ℃冰箱取出，置于室溫條件下進(jìn)行解凍，解凍后的樣品取其100 μL置于極壓管中，加入400 μL的80%甲醇水溶液0.1%甲酸預(yù)冷重懸；渦旋震蕩后，冰浴靜置5 min，15 000×、4 ℃離心20 min；去除上層乳脂，取一定量的上清加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇含量為53%；移至新的Eppendorf管中，15 000×、4 ℃離心20 min，最后取上清液進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 方法

1.2.1 UHPLC-MS條件確定、UPLC色譜條件與質(zhì)譜條件 采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UHPLC-MS)對(duì)樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，該方法具有更高效和超高的分離度、速度和靈敏度。同時(shí)也具有一定的高分辨率和高選擇優(yōu)勢(shì)，能夠得到精準(zhǔn)的質(zhì)譜圖和相對(duì)分子量。本研究使用Vanquish UHPLC系統(tǒng)與Orbitrap Q ExactiveTM HF質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)兩組奶樣進(jìn)行代謝組學(xué)分析。UHPLC-MS分析：1 μL樣品在Hypesil Goldcolumn(C18)色譜柱上(100×2.1 mm, 1.9 μm)。正極性模式的洗脫液為洗脫液A(0.1% FA在水中)和洗脫液B(甲醇)。負(fù)極性模式洗脫液為洗脫液A(5 mol·L乙酸銨，pH 9.0)和洗脫液B(甲醇)。Q ExactiveHF質(zhì)譜儀采用正/負(fù)極性模式，噴霧電壓3.2 kV，毛細(xì)管溫度320 ℃，鞘氣流量40 arb, aux氣流量10 arb。質(zhì)譜條件：Orbitrap Q ExactiveTM HF質(zhì)譜儀采用 ESI掃描模式，質(zhì)荷比掃描范圍為：100～1 500 m·z；Spray Voltage: 3.2 kV; Sheath gas flow rate: 40 arb; Aux Gasflow rate: 10 arb; Capillary Temp:320 ℃；Polarity: positive; negative; MS/MS 二級(jí)掃描為data-dependent scans。乳樣的色譜梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 乳樣的色譜梯度洗脫程序

1.2.2 代謝組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析處理 UHPLC-MS生成的原始數(shù)據(jù)(.raw)文件導(dǎo)入Discoverer 3.1(CD3.1, Thermo Fisher)搜庫(kù)軟件進(jìn)行處理，對(duì)每個(gè)代謝物進(jìn)行峰校準(zhǔn)、峰采集和定量。然后，將峰值強(qiáng)度歸一化為總光譜強(qiáng)度。利用歸一化后的數(shù)據(jù)，根據(jù)加性離子、分子離子峰和碎片離子對(duì)分子式進(jìn)行預(yù)測(cè)。將峰值與mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和MassList數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配比對(duì)，得到準(zhǔn)確的定性和相對(duì)定量結(jié)果。使用統(tǒng)計(jì)軟件R 3.4.3、Python 2.7.6和CentOS 6.6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 HF與LF組差異代謝物的篩選分析 使用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件metaX進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。采用單因素分析(-test)計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性(-value)。根據(jù)(O)PLS-DA模型變量的變量權(quán)重值(variable importance for the projection，VIP)輔助篩選標(biāo)志代謝物。選擇VIP>1，<0.05，F(xiàn)C≥2或FC≤0.5的代謝物作為差異代謝物。受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線能夠進(jìn)一步考察差異代謝物對(duì)高、低乳脂組樣品的辨別能力，依據(jù)ROC曲線下的面積(area under curve，AUC)判斷差異代謝物的識(shí)別能力。根據(jù)所獲得的代謝物通過(guò)KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、HMDB((https://hmdb.ca/metabolites)以及LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lipidmaps.org/)進(jìn)行注釋和代謝產(chǎn)物途徑分析。

2 結(jié) 果

2.1 乳樣UHPLC-MS的代謝組學(xué)質(zhì)譜圖分析

采用UHPLC-MS代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)HF和LF組荷斯坦奶牛的差異代謝物，將正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的QC樣本質(zhì)譜總離子流圖(total ion chromatography，TIC)進(jìn)行疊加，獲得TIC重疊圖(圖1)，圖譜可以觀察到各譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊且基線穩(wěn)定，說(shuō)明試驗(yàn)過(guò)程中的數(shù)據(jù)可靠。

A、B.分別為HF組正、負(fù)離子模式下TIC重疊圖譜；C、D.分別為L(zhǎng)F組正、負(fù)離子模式下TIC重疊圖譜

2.2 HF與LF組奶樣代謝輪廓模式識(shí)別

使用監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析來(lái)評(píng)估組間樣本差異，在正離子模式下，PLS-DA得分圖RY=0.88、QY=0.46(圖2A)；在負(fù)離子模式下PLS-DA得分圖RY=0.89、QY=0.43(圖2B)，此模型RY均高于0.5，QY值介于0.4～0.5，表明此模型的解釋率高，預(yù)測(cè)能力可接受。進(jìn)一步對(duì)正、負(fù)離子模式數(shù)據(jù)PLS-DA模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)，可知，在正離子模式下Q截距=-0.52(QIntercept<0)(圖2C)，負(fù)離子模式下Q截距=-0.53(QIntercept<0)(圖2D)，表明PLS-DA模型未過(guò)度擬合，說(shuō)明LF組與HF組奶樣代謝物存在差異。

A、B.分別為正、負(fù)離子模式下PLS-DA得分圖；C、D.分別為正、負(fù)離子模式下PLS-DA置換檢驗(yàn)圖

2.3 差異代謝物的篩選

本研究共注釋到343種代謝產(chǎn)物，其中正離子模式下228種，負(fù)離子模式下對(duì)115種。將PLS-DA的VIP值(VIP>1)和單變量統(tǒng)計(jì)分析(<0.05)作為顯著性差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出60種顯著差異代謝物，其中正離子模式下有41種(表3)，負(fù)離子模式下有19種(表4)。

表3 LC-MS鑒定牛乳高、低水平乳脂顯著差異代謝物(正離子模式)

表4 LC-MS/MS鑒定牛乳高、低水平乳脂潛在標(biāo)志代謝物(負(fù)離子模式)

運(yùn)用Python-3.5.0與R-3.4.3軟件對(duì)正、負(fù)離子模式下60種顯著差異代謝物進(jìn)行聚類和富集分析，由聚類熱圖可知(圖3A、B)，HF和LF組數(shù)據(jù)分別能夠很好的聚集在一起，說(shuō)明試驗(yàn)樣本組內(nèi)無(wú)明顯差異，且相似代謝物聚集效果良好。KEGG富集分析圖(圖3C、D)顯示，代謝物主要富集在?；撬岷蛠喤；撬岽x、類固醇激素生物合成、卵巢類固醇生成、氨基酰-tRNA生物合成、代謝途徑和膽汁分泌途徑。

A、B.分別為正、負(fù)離子模式下聚類熱圖；C、D.分別為正、負(fù)離子模式下KEGG富集氣泡圖

根據(jù)<0.5且FC>2.0及<0.5且FC<0.5可知，HF組奶樣中有15種代謝物含量高于LF組，有6種代謝物含量低于LF組。為進(jìn)一步篩選標(biāo)志性差異代謝物，通過(guò)ROC曲線評(píng)判潛在的生物標(biāo)記物，對(duì)60個(gè)顯著差異代謝物進(jìn)行分類識(shí)別能力考察。AUC為ROC曲線下方的面積，AUC值越接近于1，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性越高。AUC值為0.5～0.8時(shí)，模型具有預(yù)測(cè)價(jià)值，但預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較低；AUC值為0.8～0.9時(shí)，有一定預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，此時(shí)代謝物是識(shí)別兩組樣品的主要指標(biāo)；AUC值為0.9及以上時(shí)，有較高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，識(shí)別效果非常好。本試驗(yàn)篩選出AUC>0.8的差異代謝物共18種，其正離子模式下12種(圖4A)：DL-2-(乙酰氨基)-3-苯基丙酸(DL-2-(acetylamino)-3-phenylpropanoic acid)、PC(14:0e/9:0)、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤(1-methylguanine)、月桂酸甘油酯(Monolaurin)、乙基-1-(3-硝基-2-噻吩基)哌啶-4-羧酸乙酯(ethyl 1-(3-nitro-2-thienyl)piperidine-4-carboxylate)、N-苯乙酰谷氨酰胺(N-phenylacetylglutamine)、麥芽糖醇(Maltol)、5,6-二羥基吲哚-2-羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)、5-甲基-DL-色氨酸(5-methyl-dl-tryptophan)、Lysopa 16:0、表睪酮(Epitestosterone)、5-羥基吲哚-3-乙酸(5-hydroxyindole-3-acetic acid)。負(fù)離子模式下6種(圖4B)：PA(16:0/18:3)、δ-生育酚(delta-tocopherol)、膽酸(Cholic acid)、L-組氨酸(L-histidine)、皮質(zhì)醇(Hydrocortisone)、N-油酰甘氨酸(N-oleoyl glycine)。其中 AUC>0.85的差異代謝物有4種：N-油酰甘氨酸、皮質(zhì)醇、δ-生育酚、PC(14:0e/9:0)。

A、B.分別為正、負(fù)離子模式下ROC曲線圖

3 討 論

荷斯坦牛乳是目前市場(chǎng)覆蓋面積最廣、種類最多的乳制品，乳脂作為其主要成分，是人類食物營(yíng)養(yǎng)的重要來(lái)源。目前國(guó)內(nèi)荷斯坦牛乳脂含量約為3.6%(低于娟姍牛5.2%)，因此對(duì)荷斯坦牛乳脂進(jìn)行研究是非常有必要的。代謝組學(xué)作為近年來(lái)分子生物學(xué)領(lǐng)域代謝物分析的強(qiáng)有力工具，具有高度準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)和判斷能力，目前應(yīng)用于多個(gè)相關(guān)領(lǐng)域的小分子代謝物測(cè)定。對(duì)于不同品種的乳汁而言，丹麥Sundekilde 等運(yùn)用NMR技術(shù)對(duì)荷斯坦牛和娟姍牛的牛乳進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)肉堿、膽堿和檸檬酸鹽可作為區(qū)分荷斯坦牛與娟姍牛的標(biāo)志代謝物。Yang等進(jìn)一步對(duì)中國(guó)荷斯坦奶牛、娟姍牛、牦牛、水牛、山羊、駱駝和馬的乳代謝研究發(fā)現(xiàn)，差異代謝物膽堿和琥珀酸可區(qū)分荷斯坦牛和其它產(chǎn)乳動(dòng)物的乳制品。

本研究通過(guò)代謝組揭示乳脂率具有極端差異的牛乳潛在標(biāo)志性差異代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異代謝物N-油酰甘氨酸、皮質(zhì)醇、δ-生育酚、PC(14:0e/9:0)在HF中上調(diào)，PA(16:0/16:0)、LPS 21:0、PA(16:0/18:3)、N-甲?；虬彼?、HexCer-NS(d16:1/23:0)在HF中下調(diào)。Chaturvedi等研究表明，N-油酰甘氨酸具有獨(dú)立轉(zhuǎn)化為油酰胺的生物活性，且Arafat等于1989年就發(fā)現(xiàn)油酰胺是正常人血清中存在的5種主要脂肪酸酰胺之一。目前，關(guān)于油酰胺生物合成途徑存在兩種假說(shuō)，其中主要的一種假說(shuō)認(rèn)為肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶(recombinant peptidylglycine alpha amidating monooxygenase, PAM)是油酰胺生物合成介質(zhì)，而Merkler等證明PAM能夠催化初級(jí)脂肪酸的形成，脂肪酸和甘油進(jìn)一步組成三酰甘油酯，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，N-油酰甘氨酸在高乳脂牛乳中含量更高，提示N-油酰甘氨酸能夠促進(jìn)乳脂的形成。在本試驗(yàn)中，HF組皮質(zhì)醇顯著高于LF組，皮質(zhì)醇是一種由哺乳動(dòng)物腎上腺中的腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生的類固醇激素，屬于糖皮質(zhì)激素，又名氫化可的松，其作用主要促進(jìn)碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪的新陳代謝，同時(shí)也起著抗炎作用，促進(jìn)糖原、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的分解進(jìn)而降低大多數(shù)身體細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平；皮質(zhì)醇通過(guò)促進(jìn)草酰乙酸合成葡萄糖來(lái)刺激糖異生，再通過(guò)刺激肝內(nèi)糖原合成來(lái)抵消血糖增加，調(diào)節(jié)整個(gè)血液中葡萄糖含量；在人乳中發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇對(duì)母乳的中鏈和中間鏈脂肪酸有影響，這些脂肪酸可能來(lái)源于內(nèi)源性從頭合成，這表明母親的飲食中碳水化合物與脂肪的比例很高；Lee 等研究表明，糖皮質(zhì)激素參與調(diào)節(jié)脂肪代謝；Linderborg等研究表明，在富含三?；视偷闹|(zhì)中，牛奶中的皮質(zhì)醇水平比月桂酸含量高，以上研究表明皮質(zhì)醇與脂肪代謝有關(guān)。Kiyose等研究發(fā)現(xiàn)，δ-生育酚在到達(dá)肝之前被乳糜微粒結(jié)合到脂肪組織中，后在肝中進(jìn)行代謝。δ-生育酚是維生素E的組成成分之一，維生素E作為一種脂溶性維生素，在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中是不可或缺的，同時(shí)也是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)主要的親脂抗氧化劑，可清除脂質(zhì)過(guò)氧自由基，破壞脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈增殖反應(yīng)。有研究表明，維生素E添加在日糧中可以有效減少肉雞腹脂率、提升鵝胸肌粗脂肪率、影響豬肉大理石花紋、改善鼠脂肪含量和甘油三酯代謝、改善魚(yú)的血脂代謝及調(diào)節(jié)脂肪代謝酶活性等；Barzegar-Amini等發(fā)現(xiàn)，維生素E可以通過(guò)抑制脂肪肝的產(chǎn)生和降低肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激來(lái)調(diào)節(jié)脂蛋白水平，預(yù)防血脂異常，維生素 E 缺乏則會(huì)增加脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致磷脂周轉(zhuǎn)增加，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高乳脂率牛乳中δ-生育酚含量高于低乳脂，推測(cè)δ-生育酚對(duì)乳脂率具有一定的生理作用，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)運(yùn)用UHPLC-MS技術(shù)對(duì)高、低不同乳脂率牛乳進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果共檢測(cè)到60種顯著性差異代謝物，其中N-油酰甘氨酸、皮質(zhì)醇、δ-生育酚、PC(14:0e/9:0)可作為高乳脂率牛乳潛在標(biāo)志性差異代謝物。本研究結(jié)果可為奶牛乳脂代謝提供基礎(chǔ)資料。