• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人氨基肽酶N在豬丁型冠狀病毒感染HEK293細(xì)胞中的作用

    2022-05-30 07:33:00趙玉佳宋代麗張路文李施倩文翼平杜森焱顏其貴文心田曹三杰黃小波
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞系宿主結(jié)構(gòu)域

    趙玉佳,陳 汭,宋代麗,張路文,肖 黛,李施倩,文翼平,伍 銳,趙 勤,杜森焱,顏其貴,文心田,曹三杰,2,3,黃小波,2,3*

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心,成都 611130;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與獸醫(yī)診斷技術(shù)四川科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,成都 611130;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家級(jí)動(dòng)物類實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,成都 611130)

    丁型冠狀病毒(deltacoronavirus)是新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒科(),丁型冠狀病毒屬()成員,可以感染哺乳動(dòng)物和禽類。2009年,Woo等發(fā)現(xiàn)3種禽丁型冠狀病毒:夜鶯冠狀病毒HKU11、畫(huà)眉冠狀病毒HKU12和文鳥(niǎo)冠狀病毒HKU13。2012年,Woo等在豬和鳥(niǎo)群中鑒定出7種新型丁型冠狀病毒,對(duì)豬冠狀病毒HKU15-44和HKU15-155毒株13、和基因序列分析顯示其與亞洲豹貓冠狀病毒相似性高達(dá)99.8%,說(shuō)明PDCoV在野生小型哺乳動(dòng)物和豬之間可能存在跨種傳播。2014年,美國(guó)暴發(fā)豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)感染。隨后,韓國(guó)、加拿大、泰國(guó)、越南、日本和中國(guó)等國(guó)家也報(bào)道PDCoV引起的仔豬腹瀉性疾病。當(dāng)前,已報(bào)道的PDCoV毒株全基因組序列相對(duì)保守,序列分析表明,PDCoV可能起源于麻雀丁型冠狀病毒(sparrow deltacoronavirus,SpCoV)。此外,美國(guó)報(bào)道的4種新型SpCoV與PDCoV親緣關(guān)系更為密切,表明PDCoV在豬和禽類之間也可能發(fā)生跨種傳播。

    PDCoV是引起豬腸道疾病的主要病原,可感染各年齡階段的豬,感染仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水和死亡等臨床癥狀,影響全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。人工接種PDCoV還可感染牛、雞和火雞等多種動(dòng)物。體外試驗(yàn)證實(shí),病毒也可感染豬源細(xì)胞(LLC-PK、PK15、ST、IPEC和IPI-2I)、人源細(xì)胞(Huh7和Hela)、禽源細(xì)胞(LMH和DF-1)、牛源細(xì)胞(PBK和PBH)、猴源細(xì)胞(Vero-CCL81)和犬源細(xì)胞(MDCK)等多種細(xì)胞,顯示PDCoV具有廣泛的跨宿主傳播風(fēng)險(xiǎn)。

    氨基肽酶N(aminopeptidase N,APN),又稱CD13,是一種膜結(jié)合的金屬蛋白酶,可與冠狀病毒S蛋白結(jié)合,介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞。甲型冠狀病毒中,傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、貓冠狀病毒(feline coronavirus,F(xiàn)CoV)、犬冠狀病毒(canine coronavirus,CCoV)和人冠狀病毒229E(human coronavirus 229E,HCoV-229E)被鑒定出以APN作為功能受體。此外,APN作為冠狀病毒受體具有種屬特異性。有研究表明,HCoV-229E以hAPN作為受體,而不能以豬APN(porcine APN,pAPN)作為受體。貓APN(feline APN,fAPN)可與TGEV、CCoV、HCoV-229E和FCoV結(jié)合。但是,APN在PDCoV入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中是否發(fā)揮受體功能存在爭(zhēng)議。Li等構(gòu)建APN基因敲除細(xì)胞證明APN是PDCoV感染多種動(dòng)物細(xì)胞的功能受體,病毒可通過(guò)S蛋白的S1結(jié)構(gòu)域與APN的催化區(qū)域發(fā)生互作。Wang等也證明,pAPN在PDCoV入侵細(xì)胞中發(fā)揮受體功能。與之相反,部分研究結(jié)果卻證明,APN不是PDCoV的受體。也有研究顯示,APN雖不是PDCoV的關(guān)鍵受體,但其能影響PDCoV的早期感染和增殖過(guò)程。另外,Stoian等卻認(rèn)為APN是PDCoV感染細(xì)胞的一個(gè)非必需細(xì)胞受體。

    為驗(yàn)證hAPN在PDCoV復(fù)制中的作用,本研究首先證實(shí)PDCoV可感染HEK293細(xì)胞,再進(jìn)一步構(gòu)建hAPN基因敲除細(xì)胞系和hAPN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,驗(yàn)證hAPN在PDCoV復(fù)制中的作用。通過(guò)同源建模和分子對(duì)接模擬PDCoV S 蛋白與hAPN蛋白的相互作用,為闡述PDCoV的細(xì)胞入侵機(jī)制和跨種傳播提供新的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞、病毒和主要試劑

    HEK293、HEK293T和ST細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存;PDCoV四川分離株CHN-SC2015(GenBank收錄號(hào):MK355396.1)由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。pCMV-SPORT6-ANPEP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存;兔抗ACTB多克隆抗體(AC026),HRP-羊抗兔IgG(AS014),HRP-羊抗鼠IgG(AS003):武漢Abclonal公司;鼠抗ANPEP單克隆抗體(sc-166105):Santa Cruz公司;兔抗PDCoV N多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

    1.2 PDCoV感染HEK293細(xì)胞

    將PDCoV以MOI=0.1接種60 mm培養(yǎng)皿中的HEK293細(xì)胞,37 ℃吸附1 h,PBS洗2遍,加維持液繼續(xù)培養(yǎng)。于0、12、24、36和48 h取樣,通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)PDCoV感染HEK293細(xì)胞后的病毒含量;將PDCoV感染HEK293細(xì)胞24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次后,連續(xù)傳至4代,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)PDCoV在HEK293細(xì)胞上的增殖情況,TCID檢測(cè)不同代次的病毒滴度。

    1.3 hAPN基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定

    參考hAPN基因(NC_000015)序列,利用網(wǎng)絡(luò)在線工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA(表1)。合成的sgRNA經(jīng)退火處理,連接到B Ⅰ酶切的線性化載體lenti CRISPR v2,構(gòu)建同時(shí)表達(dá)Cas9和sgRNA的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。用Lipofectamine 3000將質(zhì)粒按重組質(zhì)粒∶psPAX2∶pMD2.G=5∶3∶2的比例共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,48 h后收上清。待T25細(xì)胞瓶中HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至50%時(shí),感染慢病毒,36 h后,用含1 μg·mL嘌呤霉素(puromycin)的完全培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選;有限稀釋法挑選hAPN基因敲除細(xì)胞系,將其命名為hAPN。通過(guò)測(cè)序、RT-qPCR和Western blot鑒定hAPN在HEK293細(xì)胞上的敲除情況。

    表1 相關(guān)引物序列

    1.4 細(xì)胞活性鑒定

    按照10·孔的細(xì)胞數(shù)將野生型細(xì)胞(hAPN)和敲除細(xì)胞(hAPN)接種96孔細(xì)胞板,24 h后,避光條件下,每孔加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃孵育1 h,測(cè)定450 nm的吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%,As:試驗(yàn)孔(hAPN細(xì)胞孔);Ac:對(duì)照孔(hAPN細(xì)胞孔);Ab:空白孔(培養(yǎng)基)。

    1.5 敲除hAPN對(duì)PDCoV復(fù)制的影響

    待60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中hAPN和hAPN長(zhǎng)滿單層后,PBS洗2遍,將PDCoV以MOI=0.1的劑量感染細(xì)胞,37 ℃孵育1 h,棄病毒液,每孔加入4 mL維持液,于24 h收集細(xì)胞懸液和蛋白,細(xì)胞懸液用RT-qPCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平;蛋白樣品用Western blot檢測(cè)N蛋白表達(dá)水平。

    1.6 過(guò)表達(dá)hAPN對(duì)PDCoV復(fù)制的影響

    針對(duì)hAPN基因的CDs區(qū)設(shè)計(jì)引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增后連接到載體pIRES2-EGFP,構(gòu)建hAPN過(guò)表達(dá)真核載體(命名為pIRES2-EGFP-hAPN)。待HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至50%時(shí),用Lipofectamine 3000分別轉(zhuǎn)染4 μg質(zhì)粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-hAPN至HEK293細(xì)胞;轉(zhuǎn)染24 h后,觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況;收集細(xì)胞和細(xì)胞蛋白,分別用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)hAPN表達(dá)。以MOI為0.1的PDCoV感染轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hAPN的HEK293細(xì)胞,同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP空載的HEK293細(xì)胞為對(duì)照,24 h后,收集細(xì)胞懸液和蛋白,細(xì)胞懸液通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平;蛋白樣品通過(guò)Western blot檢測(cè)N蛋白表達(dá)水平。

    1.7 同源建模與分子對(duì)接

    hAPN蛋白(PDB ID:4FYQ)、PDCoV S蛋白(PDB ID:6B7 N)和HCoV-229E S(PDB ID:6U7H)的整體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取(https://www.rcsb.org)。用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)手動(dòng)構(gòu)建PDCoV S蛋白和HCoV-229E S蛋白的單體結(jié)構(gòu)和受體結(jié)構(gòu)域(receptor binding domain,RBD),用PyMOL對(duì)hAPN、PDCoV S和HCoV-229E S蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析;用MEGA6、ESPrit 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)和PyMOL的align功能對(duì)PDCoV和HCoV-229E S蛋白的RBD進(jìn)行序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)。用分子對(duì)接方法模擬PDCoV S1蛋白與hAPN蛋白的相互作用。

    1.8 TCID50測(cè)定

    取100 μL病毒液,按照10倍梯度進(jìn)行倍比稀釋,共稀釋7個(gè)梯度,每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)重復(fù),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。待96孔細(xì)胞板中的ST細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后,PBS洗2遍,加入100 μL稀釋好的病毒液,37 ℃孵育1.5 h,棄病毒液,加入150 μL含5 μg·mL胰酶的維持液,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變,連續(xù)觀察4 d,按照Reed&Muench方法計(jì)算TCID。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié) 果

    2.1 PDCoV在HEK293細(xì)胞中的增殖情況

    將PDCoV以MOI=0.1感染HEK293細(xì)胞,收取0、12、24、36和48 h的樣品,RT-qPCR檢測(cè)病毒含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),病毒感染細(xì)胞12~36 h時(shí),病毒快速增殖,36 h達(dá)到頂峰;36~48 h,出現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖1A);此外,在0~24 h,病毒N蛋白表達(dá)水平也迅速增加(圖1C)。將PDCoV在HEK293細(xì)胞上連續(xù)傳至4代,RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)傳至第3代時(shí),只能檢測(cè)到很弱的條帶,而傳至第4代時(shí),檢測(cè)不到條帶(圖1B);Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PDCoV傳至2代時(shí),仍可檢測(cè)到很弱的病毒N蛋白表達(dá)水平(圖1D);TCID結(jié)果表明,PDCoV在HEK293細(xì)胞上第1代滴度約為4.36 lg TCID·mL,傳至2代時(shí),病毒滴度稍微下降,約為3 lg TCID·mL(圖1E),表明PDCoV可感染HEK293細(xì)胞,但是不能在HEK293細(xì)胞上穩(wěn)定傳代。

    A.RT-qPCR檢測(cè)PDCoV在HEK293細(xì)胞上的增殖情況;B.RT-PCR檢測(cè)PDCoV在HEK293細(xì)胞上的傳代;C.Western blot檢測(cè)PDCoV感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的N蛋白表達(dá)水平;D.Western blot檢測(cè)PDCoV感染HEK293細(xì)胞不同代次的N蛋白表達(dá)水平;E.TCID50檢測(cè)PDCoV感染HEK293細(xì)胞不同代次的病毒滴度

    2.2 hAPN基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建和鑒定

    用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建hAPN基因敲除細(xì)胞系,通過(guò)測(cè)序、RT-qPCR和Western blot檢測(cè)hAPN在HEK293細(xì)胞上的敲除情況。測(cè)序結(jié)果顯示,hAPN細(xì)胞系在PAM序列前出現(xiàn)明顯的重疊峰,且存在23個(gè)堿基的連續(xù)缺失(圖2A);RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,在hAPN細(xì)胞上幾乎檢測(cè)不到hAPN基因表達(dá)(圖2B、C),表明hAPN在HEK293細(xì)胞上缺失成功。細(xì)胞活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),hAPN和hAPN的活性無(wú)差異(圖2D),表明敲除hAPN對(duì)HEK293細(xì)胞活性無(wú)影響。

    A.hAPNWT和hAPNKO細(xì)胞中hAPN基因的序列測(cè)定;B.RT-qPCR檢測(cè)hAPNKO細(xì)胞的hAPN基因mRNA水平(***.P<0.001);C.Western blot檢測(cè)hAPNKO細(xì)胞的hAPN蛋白表達(dá)水平;D.CCK-8檢測(cè)hAPNWT和hAPNKO細(xì)胞的細(xì)胞活性(ns.P>0.05)

    2.3 敲除hAPN可降低PDCoV復(fù)制

    為驗(yàn)證hAPN敲除對(duì)PDCoV復(fù)制的影響,將PDCoV以MOI=0.1感染hAPN和hAPN細(xì)胞,24 h后,測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平和N蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明,hAPN基因敲除后,導(dǎo)致基因mRNA水平下調(diào)約75%(圖3 A),N蛋白表達(dá)水平下降約66%(圖3 B),證實(shí)hAPN敲除能夠顯著抑制PDCoV復(fù)制。

    A.RT-qPCR檢測(cè)敲除hAPN后PDCoV M基因mRNA水平(***.P<0.001);B.Western blot檢測(cè)敲除hAPN后PDCoV N蛋白表達(dá)水平

    2.4 過(guò)表達(dá)hAPN可促進(jìn)PDCoV復(fù)制

    為進(jìn)一步驗(yàn)證hPAN過(guò)表達(dá)對(duì)PDCoV復(fù)制的影響,構(gòu)建hAPN真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hAPN,轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中,24 h后,可以觀察到明顯的綠色熒光(圖4 A)。RT-qPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),hAPN在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)(圖4 B、C)。將pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-hAPN分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h后,接種PDCoV,病毒感染24 h后,RT-qPCR和Western blot檢測(cè)表明,過(guò)表達(dá)hAPN導(dǎo)致M基因mRNA水平上調(diào)2.7倍,N蛋白表達(dá)水平上調(diào)1.7倍(圖4 D、E),表明過(guò)表達(dá)hAPN促進(jìn)PDCoV復(fù)制。

    A.熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)(標(biāo)尺=100 μm);B.RT-qPCR檢測(cè)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hAPN后hAPN基因mRNA水平(***.P<0.001);C.Western blot檢測(cè)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hAPN后hAPN蛋白表達(dá)水平;D.RT-qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)hAPN后M基因mRNA水平(***.P<0.001);E.Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)hAPN后N蛋白表達(dá)水平。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖

    2.5 hAPN與PDCoV S蛋白的互作分析

    為分析hAPN和PDCoV S蛋白的互作關(guān)系,從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取hAPN和PDCoV S的三聚體結(jié)構(gòu)(圖5 A、G);PDCoV S蛋白的單體結(jié)構(gòu)及其主要結(jié)構(gòu)域包括C-末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain,CTD)、N-末端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)、融合肽(fusion peptide,F(xiàn)P)、七肽重復(fù)序列(heptad repeat,HR)(圖5 B)。HCoV-229E和PDCoV S1 RBD,包含6個(gè)β-折疊和3個(gè)短而不連續(xù)的環(huán)組成的受體結(jié)合基序(receptor binding motifs,RBM)(圖5 C、D)。序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)PDCoV和HCoV-229E S1 RBD具有相似的空間結(jié)構(gòu),表明PDCoV RBD與hAPN的結(jié)合可能類似HCoV-229E RBD和hAPN的結(jié)合(圖5 E、F)。分子對(duì)接結(jié)果表明,PDCoV S1 RBD能夠結(jié)合hAPN結(jié)構(gòu)域Ⅱ,主要是S1蛋白的RBM1氨基酸殘基TYR、THR、THR、PHE和MET通過(guò)氫鍵與hAPN的氨基酸殘基PHE、GLN、ARG和SER結(jié)合(圖5 G、H)。

    A.PDCoV S 蛋白整體結(jié)構(gòu);B.PDCoV S 蛋白單體結(jié)構(gòu);C.HCoV-229E S1 RBD;D.PDCoV S1 RBD;E.HCoV-229E和PDCoV S1 RBD結(jié)構(gòu)比對(duì);F.HCoV-229E和PDCoV S1 RBD序列比對(duì);G~H.分子對(duì)接模擬PDCoV S1 RBD和hAPN蛋白的互作。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖

    3 討 論

    PDCoV是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種豬冠狀病毒,人工接種PDCoV能夠感染豬、牛、雞和火雞等多種動(dòng)物。PDCoV感染仔豬后引起明顯的腹瀉癥狀,而感染小雞后腹瀉癥狀較輕,接種PDCoV的小牛甚至未出現(xiàn)腹瀉和其他臨床癥狀。Lednicky等在兒童血清樣品中檢測(cè)到變異的PDCoV,首次報(bào)道了PDCoV可感染人。鑒于PDCoV在豬群的廣泛流行和跨宿主傳播風(fēng)險(xiǎn),研究宿主細(xì)胞蛋白在PDCoV復(fù)制中的作用具有重要意義。過(guò)表達(dá)hAPN、fAPN、pAPN、cAPN顯著增加細(xì)胞對(duì)PDCoV的易感性。APN在不同腸段中的差異表達(dá)與PDCoV腸道組織嗜性也密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)敲除hAPN降低PDCoV復(fù)制,而過(guò)表達(dá)hAPN促進(jìn)PDCoV復(fù)制,表明hAPN是影響PDCoV復(fù)制的重要宿主細(xì)胞因子,豐富了PDCoV跨種傳播和致病機(jī)制理論。

    S蛋白是冠狀病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白,在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中,S蛋白構(gòu)象的變化能促進(jìn)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合。此外,宿主細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境和蛋白水解酶對(duì)S蛋白的活化也是病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合所必需的。胰蛋白酶可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞之間的融合而促進(jìn)PDCoV增殖,但在病毒入侵細(xì)胞的過(guò)程中不發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,PDCoV通過(guò)胰蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞膜表面入侵ST和IPI-2I細(xì)胞的效率明顯高于內(nèi)吞體途徑。HEK293細(xì)胞是由剪切過(guò)的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)染的人胚腎細(xì)胞形成的細(xì)胞系,HEK293 T細(xì)胞是能夠穩(wěn)定表達(dá)SV40 T抗原的HEK293衍生細(xì)胞系。PEDV可以感染HEK293細(xì)胞,且與Vero細(xì)胞上的增殖特點(diǎn)相似。此外,黃病毒科成員,日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)和黃熱病毒(yellow fever virus,YFV)也可感染HEK293T細(xì)胞。由于HEK293細(xì)胞貼壁能力弱,對(duì)胰蛋白酶的耐受程度較弱,本研究在不添加胰蛋白酶的情況下,發(fā)現(xiàn)PDCoV可在HEK293細(xì)胞至少傳至2代,表明PDCoV可不依賴于胰蛋白酶入侵HEK293細(xì)胞。

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)是新發(fā)現(xiàn)的一種基因編輯工具,廣泛應(yīng)用于研究宿主因子在病毒復(fù)制中的作用。近年來(lái),CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被應(yīng)用于篩選調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的相關(guān)宿主因子。關(guān)于APN是否為PDCoV入侵宿主細(xì)胞的受體存在爭(zhēng)議。本研究為驗(yàn)證hAPN在PDCoV毒株CHN-SC2015復(fù)制中的作用,通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建hAPN敲除細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)hAPN敲除導(dǎo)致PDCoV基因mRNA水平下調(diào)約75%,N蛋白表達(dá)水平下降約66%。本研究還通過(guò)hAPN過(guò)表達(dá)驗(yàn)證其對(duì)病毒復(fù)制的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)hAPN可導(dǎo)致PDCoV基因mRNA水平上調(diào)2.7倍,N蛋白表達(dá)水平上調(diào)1.7倍,證實(shí)hAPN可明顯促進(jìn)PDCoV復(fù)制。

    冠狀病毒S蛋白主要由S1和S2結(jié)構(gòu)域組成,其中S1主要負(fù)責(zé)識(shí)別受體,而S2介導(dǎo)宿主細(xì)胞膜與病毒囊膜的融合。有研究表明,冠狀病毒S1 RBD可以與APN結(jié)合,介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞。HCoV-229E與hAPN的胞外域Ⅱ結(jié)合,而TGEV主要與pAPN的胞外域Ⅳ結(jié)合。pAPN結(jié)構(gòu)域Ⅶ(581—967 aa)在PEDV復(fù)制中發(fā)揮重要作用。在PDCoV研究中,Zhu等發(fā)現(xiàn)PDCoV S1-CTD蛋白可結(jié)合pAPN。本研究通過(guò)序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)PDCoV與HCoV-229E S1 RBD具有相似的空間結(jié)構(gòu),表明PDCoV可能與hAPN結(jié)合。因此,本研究通過(guò)分子對(duì)接方法模擬PDCoV S1 RBD與hAPN的結(jié)合,發(fā)現(xiàn)PDCoV S1 RBD能夠通過(guò)RBM1與hAPN結(jié)構(gòu)域Ⅱ結(jié)合。

    4 結(jié) 論

    PDCoV可以感染HEK293細(xì)胞,宿主細(xì)胞因子hAPN表達(dá)可促進(jìn)PDCoV復(fù)制。此外,PDCoV S1 RBD可通過(guò)RBM1氨基酸殘基TYR、THR、THR、PHE和MET與hAPN蛋白的氨基酸殘基PHE、GLN、ARG和SER結(jié)合,證實(shí)了hAPN是影響PDCoV復(fù)制的一個(gè)重要宿主細(xì)胞因子。

    猜你喜歡
    細(xì)胞系宿主結(jié)構(gòu)域
    病原體與自然宿主和人的生態(tài)關(guān)系
    科學(xué)(2020年3期)2020-11-26 08:18:22
    龜鱉類不可能是新冠病毒的中間宿主
    蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域劃分方法及在線服務(wù)綜述
    重組綠豆BBI(6-33)結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤作用分析
    STAT3對(duì)人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系增殖與凋亡的影響
    組蛋白甲基化酶Set2片段調(diào)控SET結(jié)構(gòu)域催化活性的探討
    表現(xiàn)為扁平苔蘚樣的慢性移植物抗宿主病一例
    人乳頭瘤病毒感染與宿主免疫機(jī)制
    抑制miR-31表達(dá)對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞系遷移和侵襲的影響及可能機(jī)制
    E3泛素連接酶對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
    国产日韩一区二区三区精品不卡| 一区二区三区精品91| 午夜免费观看性视频| 免费日韩欧美在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜av观看不卡| 免费高清在线观看日韩| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲欧洲国产日韩| videosex国产| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产一区二区 视频在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品免费视频内射| 亚洲欧洲日产国产| 国产 一区精品| 伦理电影大哥的女人| 男女午夜视频在线观看| 好男人视频免费观看在线| 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产精品999| 蜜桃国产av成人99| 精品少妇久久久久久888优播| 看非洲黑人一级黄片| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产爽快片一区二区三区| 午夜久久久在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产色婷婷99| 国产精品熟女久久久久浪| 国产国语露脸激情在线看| 女性生殖器流出的白浆| 伊人久久国产一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 九草在线视频观看| 国产爽快片一区二区三区| 男人舔女人的私密视频| 成人影院久久| 日本vs欧美在线观看视频| 免费观看av网站的网址| 两个人免费观看高清视频| 亚洲五月色婷婷综合| 男女边摸边吃奶| 大片免费播放器 马上看| 亚洲在久久综合| 日韩一区二区视频免费看| 日韩av免费高清视频| 青草久久国产| 99re6热这里在线精品视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 在线观看国产h片| 桃花免费在线播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av综合色区一区| av卡一久久| 国产精品免费大片| 亚洲天堂av无毛| 亚洲一码二码三码区别大吗| 不卡视频在线观看欧美| 国产日韩欧美在线精品| 18禁观看日本| 五月天丁香电影| 黑人欧美特级aaaaaa片| 成人国产av品久久久| 亚洲天堂av无毛| 亚洲av成人精品一二三区| 人体艺术视频欧美日本| av视频免费观看在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 在现免费观看毛片| 午夜日韩欧美国产| 成人影院久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美亚洲日本最大视频资源| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲情色 制服丝袜| 99热网站在线观看| 成人手机av| av网站免费在线观看视频| www.av在线官网国产| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲国产色片| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 桃花免费在线播放| 丝袜人妻中文字幕| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久久久久久久久久免费av| 伦精品一区二区三区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲国产看品久久| 新久久久久国产一级毛片| 老熟女久久久| 婷婷成人精品国产| 韩国av在线不卡| 不卡av一区二区三区| 国产av国产精品国产| 免费av中文字幕在线| 亚洲av成人精品一二三区| 只有这里有精品99| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品av久久久久免费| 看免费成人av毛片| 亚洲第一青青草原| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 精品亚洲成a人片在线观看| www.自偷自拍.com| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲三区欧美一区| 国产精品99久久99久久久不卡 | √禁漫天堂资源中文www| 成人手机av| 中文天堂在线官网| 国产av码专区亚洲av| av有码第一页| 亚洲国产精品999| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 男女午夜视频在线观看| 亚洲精品在线美女| 一边摸一边做爽爽视频免费| 在线 av 中文字幕| 日韩免费高清中文字幕av| 美女福利国产在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 精品第一国产精品| 国产精品 欧美亚洲| 最黄视频免费看| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产极品天堂在线| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲人成电影观看| 男女边摸边吃奶| 18在线观看网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲人成77777在线视频| 最近中文字幕2019免费版| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲在久久综合| 欧美日本中文国产一区发布| 国产在线视频一区二区| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲av电影在线进入| 女人久久www免费人成看片| 久久精品人人爽人人爽视色| 性高湖久久久久久久久免费观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久久久久久国产电影| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩一区二区视频免费看| 黄片小视频在线播放| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日韩视频在线欧美| 精品视频人人做人人爽| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲第一区二区三区不卡| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 丝袜美腿诱惑在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产成人精品久久久久久| 美女大奶头黄色视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲天堂av无毛| 女人精品久久久久毛片| 日韩大片免费观看网站| 有码 亚洲区| 亚洲国产精品一区三区| 久久97久久精品| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产精品熟女久久久久浪| 97精品久久久久久久久久精品| 另类精品久久| 亚洲国产精品国产精品| 天天影视国产精品| 赤兔流量卡办理| 深夜精品福利| 夫妻性生交免费视频一级片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产av精品麻豆| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 男女下面插进去视频免费观看| a级毛片在线看网站| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久精品国产自在天天线| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | a 毛片基地| 国产精品久久久久久精品古装| 丝瓜视频免费看黄片| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久久久精品人妻al黑| 成人亚洲欧美一区二区av| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产 一区精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 大码成人一级视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 超碰成人久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 丁香六月天网| 久久毛片免费看一区二区三区| 五月开心婷婷网| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产免费视频播放在线视频| 国产精品熟女久久久久浪| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲国产看品久久| 国产在线视频一区二区| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲美女黄色视频免费看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 制服人妻中文乱码| 一级毛片我不卡| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久久久人妻| h视频一区二区三区| 在线精品无人区一区二区三| 永久网站在线| 日日撸夜夜添| 亚洲情色 制服丝袜| 丰满少妇做爰视频| 少妇 在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 熟女av电影| 欧美日韩综合久久久久久| 一级,二级,三级黄色视频| 午夜av观看不卡| 大码成人一级视频| 黄片播放在线免费| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲国产色片| 久久久久久人妻| 亚洲人成网站在线观看播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品,欧美精品| av片东京热男人的天堂| 免费av中文字幕在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 色婷婷久久久亚洲欧美| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 美女午夜性视频免费| 深夜精品福利| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产黄频视频在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 免费日韩欧美在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 午夜影院在线不卡| 黄色配什么色好看| 精品人妻偷拍中文字幕| 波多野结衣一区麻豆| 一级片'在线观看视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品久久午夜乱码| 一区二区av电影网| 观看美女的网站| 大片免费播放器 马上看| 国产成人精品福利久久| 国产在线视频一区二区| 叶爱在线成人免费视频播放| 免费高清在线观看视频在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 制服人妻中文乱码| 99久国产av精品国产电影| 少妇 在线观看| 国产乱人偷精品视频| 国产精品不卡视频一区二区| 制服丝袜香蕉在线| 精品久久久久久电影网| 人人澡人人妻人| 一级a爱视频在线免费观看| 一个人免费看片子| 亚洲中文av在线| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 七月丁香在线播放| 久久青草综合色| 国产乱来视频区| 青春草视频在线免费观看| 亚洲中文av在线| 日本av免费视频播放| 欧美少妇被猛烈插入视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 男人舔女人的私密视频| 亚洲久久久国产精品| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产精品 国内视频| 日韩三级伦理在线观看| videossex国产| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美+日韩+精品| 亚洲av中文av极速乱| 国产精品免费大片| 热99国产精品久久久久久7| av在线app专区| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲美女黄色视频免费看| 97在线视频观看| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| www.av在线官网国产| 波多野结衣一区麻豆| 我的亚洲天堂| 三级国产精品片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 在线看a的网站| 日韩大片免费观看网站| 日韩免费高清中文字幕av| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 中文欧美无线码| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 少妇 在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品人妻久久久影院| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 大香蕉久久网| 观看av在线不卡| 日韩成人av中文字幕在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 尾随美女入室| 街头女战士在线观看网站| 两个人看的免费小视频| 在线观看www视频免费| 青春草视频在线免费观看| 日本免费在线观看一区| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 97在线视频观看| 国产精品熟女久久久久浪| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费大片黄手机在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久精品久久久久久久性| av视频免费观看在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲天堂av无毛| 精品第一国产精品| 丝袜脚勾引网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| h视频一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 两性夫妻黄色片| 欧美国产精品一级二级三级| 最近手机中文字幕大全| 午夜精品国产一区二区电影| 99国产精品免费福利视频| 精品福利永久在线观看| 少妇的丰满在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久久久久免费高清国产稀缺| 精品视频人人做人人爽| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美bdsm另类| 国产综合精华液| 欧美成人午夜精品| 久热这里只有精品99| 在线看a的网站| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久热在线av| 秋霞在线观看毛片| h视频一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看| 日日撸夜夜添| 国产成人av激情在线播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久热这里只有精品99| 最新的欧美精品一区二区| 久久久久视频综合| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲av在线观看美女高潮| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 香蕉国产在线看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产成人精品一,二区| 波野结衣二区三区在线| av福利片在线| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲成人一二三区av| 99re6热这里在线精品视频| 成人手机av| 久久久精品94久久精品| 在现免费观看毛片| 青春草视频在线免费观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 少妇人妻久久综合中文| 日本欧美国产在线视频| 免费少妇av软件| 免费高清在线观看视频在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲av综合色区一区| 黑丝袜美女国产一区| 国产激情久久老熟女| 激情视频va一区二区三区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲伊人久久精品综合| 美女国产高潮福利片在线看| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美日韩一级在线毛片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 国产精品无大码| 99久久综合免费| 天天影视国产精品| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日韩视频在线欧美| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久久久久久久免费av| 大码成人一级视频| 韩国高清视频一区二区三区| 免费高清在线观看日韩| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产 精品1| 老汉色av国产亚洲站长工具| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 亚洲av国产av综合av卡| 日本爱情动作片www.在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 男女免费视频国产| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品一区蜜桃| 老鸭窝网址在线观看| 午夜免费鲁丝| 欧美av亚洲av综合av国产av | 丝袜美腿诱惑在线| 国产片内射在线| 老熟女久久久| 丝袜人妻中文字幕| 毛片一级片免费看久久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 2022亚洲国产成人精品| 热re99久久国产66热| 成年动漫av网址| 美女主播在线视频| 下体分泌物呈黄色| 丝袜美腿诱惑在线| 国产综合精华液| 观看av在线不卡| 91精品国产国语对白视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 视频在线观看一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 美女午夜性视频免费| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 三上悠亚av全集在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美成人午夜免费资源| 母亲3免费完整高清在线观看 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 18+在线观看网站| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲国产色片| 亚洲成色77777| 制服人妻中文乱码| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 制服诱惑二区| 欧美日韩av久久| 国产福利在线免费观看视频| 午夜91福利影院| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品乱久久久久久| 韩国高清视频一区二区三区| 男女免费视频国产| 国产成人a∨麻豆精品| 午夜福利一区二区在线看| 七月丁香在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 视频在线观看一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 黄色配什么色好看| 久久久精品94久久精品| 伊人久久国产一区二区| 久久精品亚洲av国产电影网| 老司机亚洲免费影院| 国产成人精品在线电影| 9色porny在线观看| 国产淫语在线视频| 久久这里只有精品19| 国产日韩欧美视频二区| 免费观看av网站的网址| 国产免费视频播放在线视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久久久久人妻| 久久99蜜桃精品久久| 老司机亚洲免费影院| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲国产欧美网| 国产xxxxx性猛交| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品久久久久久精品古装| 男的添女的下面高潮视频| av电影中文网址| 成人亚洲精品一区在线观看| 天美传媒精品一区二区| 少妇的逼水好多| 高清av免费在线| 高清在线视频一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲三区欧美一区| 交换朋友夫妻互换小说| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 免费大片黄手机在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 少妇被粗大的猛进出69影院| av片东京热男人的天堂| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产熟女午夜一区二区三区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美精品一区二区大全| 日本欧美国产在线视频| 欧美xxⅹ黑人| 一级毛片我不卡| 免费大片黄手机在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品国产av在线观看| 精品久久蜜臀av无| 男女午夜视频在线观看| 精品国产一区二区久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产精品国产三级专区第一集| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美日韩综合久久久久久| 男男h啪啪无遮挡| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产一区二区 视频在线| 成人午夜精彩视频在线观看| 一级片'在线观看视频| 国产色婷婷99| 日韩大片免费观看网站| 99久久人妻综合| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲四区av| 免费观看av网站的网址| 亚洲欧美清纯卡通| 免费观看av网站的网址| 一区二区三区乱码不卡18| 99精国产麻豆久久婷婷| 午夜91福利影院| 老司机影院毛片| av国产久精品久网站免费入址| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 色94色欧美一区二区| 毛片一级片免费看久久久久| 女人久久www免费人成看片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美激情 高清一区二区三区| 色哟哟·www| 久热这里只有精品99| 国产精品免费大片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品三级大全| 考比视频在线观看| 多毛熟女@视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品三级大全| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产高清国产精品国产三级| 热99久久久久精品小说推荐| 国产高清国产精品国产三级| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 制服人妻中文乱码| 亚洲,欧美,日韩| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美日本中文国产一区发布| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 麻豆乱淫一区二区| 乱人伦中国视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产成人精品在线电影| 久久精品亚洲av国产电影网| www.熟女人妻精品国产| 老司机影院成人| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| av线在线观看网站| 免费观看av网站的网址| 国产成人aa在线观看|