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    人氨基肽酶N在豬丁型冠狀病毒感染HEK293細(xì)胞中的作用

    2022-05-30 07:33:00趙玉佳宋代麗張路文李施倩文翼平杜森焱顏其貴文心田曹三杰黃小波
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞系宿主結(jié)構(gòu)域

    趙玉佳,陳 汭,宋代麗,張路文,肖 黛,李施倩,文翼平,伍 銳,趙 勤,杜森焱,顏其貴,文心田,曹三杰,2,3,黃小波,2,3*

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心,成都 611130;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與獸醫(yī)診斷技術(shù)四川科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,成都 611130;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家級(jí)動(dòng)物類實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,成都 611130)

    丁型冠狀病毒(deltacoronavirus)是新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒科(),丁型冠狀病毒屬()成員,可以感染哺乳動(dòng)物和禽類。2009年,Woo等發(fā)現(xiàn)3種禽丁型冠狀病毒:夜鶯冠狀病毒HKU11、畫(huà)眉冠狀病毒HKU12和文鳥(niǎo)冠狀病毒HKU13。2012年,Woo等在豬和鳥(niǎo)群中鑒定出7種新型丁型冠狀病毒,對(duì)豬冠狀病毒HKU15-44和HKU15-155毒株13、和基因序列分析顯示其與亞洲豹貓冠狀病毒相似性高達(dá)99.8%,說(shuō)明PDCoV在野生小型哺乳動(dòng)物和豬之間可能存在跨種傳播。2014年,美國(guó)暴發(fā)豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)感染。隨后,韓國(guó)、加拿大、泰國(guó)、越南、日本和中國(guó)等國(guó)家也報(bào)道PDCoV引起的仔豬腹瀉性疾病。當(dāng)前,已報(bào)道的PDCoV毒株全基因組序列相對(duì)保守,序列分析表明,PDCoV可能起源于麻雀丁型冠狀病毒(sparrow deltacoronavirus,SpCoV)。此外,美國(guó)報(bào)道的4種新型SpCoV與PDCoV親緣關(guān)系更為密切,表明PDCoV在豬和禽類之間也可能發(fā)生跨種傳播。

    PDCoV是引起豬腸道疾病的主要病原,可感染各年齡階段的豬,感染仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水和死亡等臨床癥狀,影響全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。人工接種PDCoV還可感染牛、雞和火雞等多種動(dòng)物。體外試驗(yàn)證實(shí),病毒也可感染豬源細(xì)胞(LLC-PK、PK15、ST、IPEC和IPI-2I)、人源細(xì)胞(Huh7和Hela)、禽源細(xì)胞(LMH和DF-1)、牛源細(xì)胞(PBK和PBH)、猴源細(xì)胞(Vero-CCL81)和犬源細(xì)胞(MDCK)等多種細(xì)胞,顯示PDCoV具有廣泛的跨宿主傳播風(fēng)險(xiǎn)。

    氨基肽酶N(aminopeptidase N,APN),又稱CD13,是一種膜結(jié)合的金屬蛋白酶,可與冠狀病毒S蛋白結(jié)合,介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞。甲型冠狀病毒中,傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、貓冠狀病毒(feline coronavirus,F(xiàn)CoV)、犬冠狀病毒(canine coronavirus,CCoV)和人冠狀病毒229E(human coronavirus 229E,HCoV-229E)被鑒定出以APN作為功能受體。此外,APN作為冠狀病毒受體具有種屬特異性。有研究表明,HCoV-229E以hAPN作為受體,而不能以豬APN(porcine APN,pAPN)作為受體。貓APN(feline APN,fAPN)可與TGEV、CCoV、HCoV-229E和FCoV結(jié)合。但是,APN在PDCoV入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中是否發(fā)揮受體功能存在爭(zhēng)議。Li等構(gòu)建APN基因敲除細(xì)胞證明APN是PDCoV感染多種動(dòng)物細(xì)胞的功能受體,病毒可通過(guò)S蛋白的S1結(jié)構(gòu)域與APN的催化區(qū)域發(fā)生互作。Wang等也證明,pAPN在PDCoV入侵細(xì)胞中發(fā)揮受體功能。與之相反,部分研究結(jié)果卻證明,APN不是PDCoV的受體。也有研究顯示,APN雖不是PDCoV的關(guān)鍵受體,但其能影響PDCoV的早期感染和增殖過(guò)程。另外,Stoian等卻認(rèn)為APN是PDCoV感染細(xì)胞的一個(gè)非必需細(xì)胞受體。

    為驗(yàn)證hAPN在PDCoV復(fù)制中的作用,本研究首先證實(shí)PDCoV可感染HEK293細(xì)胞,再進(jìn)一步構(gòu)建hAPN基因敲除細(xì)胞系和hAPN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,驗(yàn)證hAPN在PDCoV復(fù)制中的作用。通過(guò)同源建模和分子對(duì)接模擬PDCoV S 蛋白與hAPN蛋白的相互作用,為闡述PDCoV的細(xì)胞入侵機(jī)制和跨種傳播提供新的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞、病毒和主要試劑

    HEK293、HEK293T和ST細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存;PDCoV四川分離株CHN-SC2015(GenBank收錄號(hào):MK355396.1)由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。pCMV-SPORT6-ANPEP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存;兔抗ACTB多克隆抗體(AC026),HRP-羊抗兔IgG(AS014),HRP-羊抗鼠IgG(AS003):武漢Abclonal公司;鼠抗ANPEP單克隆抗體(sc-166105):Santa Cruz公司;兔抗PDCoV N多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

    1.2 PDCoV感染HEK293細(xì)胞

    將PDCoV以MOI=0.1接種60 mm培養(yǎng)皿中的HEK293細(xì)胞,37 ℃吸附1 h,PBS洗2遍,加維持液繼續(xù)培養(yǎng)。于0、12、24、36和48 h取樣,通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)PDCoV感染HEK293細(xì)胞后的病毒含量;將PDCoV感染HEK293細(xì)胞24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次后,連續(xù)傳至4代,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)PDCoV在HEK293細(xì)胞上的增殖情況,TCID檢測(cè)不同代次的病毒滴度。

    1.3 hAPN基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定

    參考hAPN基因(NC_000015)序列,利用網(wǎng)絡(luò)在線工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA(表1)。合成的sgRNA經(jīng)退火處理,連接到B Ⅰ酶切的線性化載體lenti CRISPR v2,構(gòu)建同時(shí)表達(dá)Cas9和sgRNA的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。用Lipofectamine 3000將質(zhì)粒按重組質(zhì)粒∶psPAX2∶pMD2.G=5∶3∶2的比例共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,48 h后收上清。待T25細(xì)胞瓶中HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至50%時(shí),感染慢病毒,36 h后,用含1 μg·mL嘌呤霉素(puromycin)的完全培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選;有限稀釋法挑選hAPN基因敲除細(xì)胞系,將其命名為hAPN。通過(guò)測(cè)序、RT-qPCR和Western blot鑒定hAPN在HEK293細(xì)胞上的敲除情況。

    表1 相關(guān)引物序列

    1.4 細(xì)胞活性鑒定

    按照10·孔的細(xì)胞數(shù)將野生型細(xì)胞(hAPN)和敲除細(xì)胞(hAPN)接種96孔細(xì)胞板,24 h后,避光條件下,每孔加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃孵育1 h,測(cè)定450 nm的吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%,As:試驗(yàn)孔(hAPN細(xì)胞孔);Ac:對(duì)照孔(hAPN細(xì)胞孔);Ab:空白孔(培養(yǎng)基)。

    1.5 敲除hAPN對(duì)PDCoV復(fù)制的影響

    待60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中hAPN和hAPN長(zhǎng)滿單層后,PBS洗2遍,將PDCoV以MOI=0.1的劑量感染細(xì)胞,37 ℃孵育1 h,棄病毒液,每孔加入4 mL維持液,于24 h收集細(xì)胞懸液和蛋白,細(xì)胞懸液用RT-qPCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平;蛋白樣品用Western blot檢測(cè)N蛋白表達(dá)水平。

    1.6 過(guò)表達(dá)hAPN對(duì)PDCoV復(fù)制的影響

    針對(duì)hAPN基因的CDs區(qū)設(shè)計(jì)引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增后連接到載體pIRES2-EGFP,構(gòu)建hAPN過(guò)表達(dá)真核載體(命名為pIRES2-EGFP-hAPN)。待HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至50%時(shí),用Lipofectamine 3000分別轉(zhuǎn)染4 μg質(zhì)粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-hAPN至HEK293細(xì)胞;轉(zhuǎn)染24 h后,觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況;收集細(xì)胞和細(xì)胞蛋白,分別用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)hAPN表達(dá)。以MOI為0.1的PDCoV感染轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hAPN的HEK293細(xì)胞,同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP空載的HEK293細(xì)胞為對(duì)照,24 h后,收集細(xì)胞懸液和蛋白,細(xì)胞懸液通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平;蛋白樣品通過(guò)Western blot檢測(cè)N蛋白表達(dá)水平。

    1.7 同源建模與分子對(duì)接

    hAPN蛋白(PDB ID:4FYQ)、PDCoV S蛋白(PDB ID:6B7 N)和HCoV-229E S(PDB ID:6U7H)的整體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取(https://www.rcsb.org)。用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)手動(dòng)構(gòu)建PDCoV S蛋白和HCoV-229E S蛋白的單體結(jié)構(gòu)和受體結(jié)構(gòu)域(receptor binding domain,RBD),用PyMOL對(duì)hAPN、PDCoV S和HCoV-229E S蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析;用MEGA6、ESPrit 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)和PyMOL的align功能對(duì)PDCoV和HCoV-229E S蛋白的RBD進(jìn)行序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)。用分子對(duì)接方法模擬PDCoV S1蛋白與hAPN蛋白的相互作用。

    1.8 TCID50測(cè)定

    取100 μL病毒液,按照10倍梯度進(jìn)行倍比稀釋,共稀釋7個(gè)梯度,每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)重復(fù),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。待96孔細(xì)胞板中的ST細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后,PBS洗2遍,加入100 μL稀釋好的病毒液,37 ℃孵育1.5 h,棄病毒液,加入150 μL含5 μg·mL胰酶的維持液,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變,連續(xù)觀察4 d,按照Reed&Muench方法計(jì)算TCID。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié) 果

    2.1 PDCoV在HEK293細(xì)胞中的增殖情況

    將PDCoV以MOI=0.1感染HEK293細(xì)胞,收取0、12、24、36和48 h的樣品,RT-qPCR檢測(cè)病毒含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),病毒感染細(xì)胞12~36 h時(shí),病毒快速增殖,36 h達(dá)到頂峰;36~48 h,出現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖1A);此外,在0~24 h,病毒N蛋白表達(dá)水平也迅速增加(圖1C)。將PDCoV在HEK293細(xì)胞上連續(xù)傳至4代,RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)傳至第3代時(shí),只能檢測(cè)到很弱的條帶,而傳至第4代時(shí),檢測(cè)不到條帶(圖1B);Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PDCoV傳至2代時(shí),仍可檢測(cè)到很弱的病毒N蛋白表達(dá)水平(圖1D);TCID結(jié)果表明,PDCoV在HEK293細(xì)胞上第1代滴度約為4.36 lg TCID·mL,傳至2代時(shí),病毒滴度稍微下降,約為3 lg TCID·mL(圖1E),表明PDCoV可感染HEK293細(xì)胞,但是不能在HEK293細(xì)胞上穩(wěn)定傳代。

    A.RT-qPCR檢測(cè)PDCoV在HEK293細(xì)胞上的增殖情況;B.RT-PCR檢測(cè)PDCoV在HEK293細(xì)胞上的傳代;C.Western blot檢測(cè)PDCoV感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的N蛋白表達(dá)水平;D.Western blot檢測(cè)PDCoV感染HEK293細(xì)胞不同代次的N蛋白表達(dá)水平;E.TCID50檢測(cè)PDCoV感染HEK293細(xì)胞不同代次的病毒滴度

    2.2 hAPN基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建和鑒定

    用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建hAPN基因敲除細(xì)胞系,通過(guò)測(cè)序、RT-qPCR和Western blot檢測(cè)hAPN在HEK293細(xì)胞上的敲除情況。測(cè)序結(jié)果顯示,hAPN細(xì)胞系在PAM序列前出現(xiàn)明顯的重疊峰,且存在23個(gè)堿基的連續(xù)缺失(圖2A);RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,在hAPN細(xì)胞上幾乎檢測(cè)不到hAPN基因表達(dá)(圖2B、C),表明hAPN在HEK293細(xì)胞上缺失成功。細(xì)胞活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),hAPN和hAPN的活性無(wú)差異(圖2D),表明敲除hAPN對(duì)HEK293細(xì)胞活性無(wú)影響。

    A.hAPNWT和hAPNKO細(xì)胞中hAPN基因的序列測(cè)定;B.RT-qPCR檢測(cè)hAPNKO細(xì)胞的hAPN基因mRNA水平(***.P<0.001);C.Western blot檢測(cè)hAPNKO細(xì)胞的hAPN蛋白表達(dá)水平;D.CCK-8檢測(cè)hAPNWT和hAPNKO細(xì)胞的細(xì)胞活性(ns.P>0.05)

    2.3 敲除hAPN可降低PDCoV復(fù)制

    為驗(yàn)證hAPN敲除對(duì)PDCoV復(fù)制的影響,將PDCoV以MOI=0.1感染hAPN和hAPN細(xì)胞,24 h后,測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平和N蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明,hAPN基因敲除后,導(dǎo)致基因mRNA水平下調(diào)約75%(圖3 A),N蛋白表達(dá)水平下降約66%(圖3 B),證實(shí)hAPN敲除能夠顯著抑制PDCoV復(fù)制。

    A.RT-qPCR檢測(cè)敲除hAPN后PDCoV M基因mRNA水平(***.P<0.001);B.Western blot檢測(cè)敲除hAPN后PDCoV N蛋白表達(dá)水平

    2.4 過(guò)表達(dá)hAPN可促進(jìn)PDCoV復(fù)制

    為進(jìn)一步驗(yàn)證hPAN過(guò)表達(dá)對(duì)PDCoV復(fù)制的影響,構(gòu)建hAPN真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hAPN,轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中,24 h后,可以觀察到明顯的綠色熒光(圖4 A)。RT-qPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),hAPN在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)(圖4 B、C)。將pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-hAPN分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h后,接種PDCoV,病毒感染24 h后,RT-qPCR和Western blot檢測(cè)表明,過(guò)表達(dá)hAPN導(dǎo)致M基因mRNA水平上調(diào)2.7倍,N蛋白表達(dá)水平上調(diào)1.7倍(圖4 D、E),表明過(guò)表達(dá)hAPN促進(jìn)PDCoV復(fù)制。

    A.熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)(標(biāo)尺=100 μm);B.RT-qPCR檢測(cè)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hAPN后hAPN基因mRNA水平(***.P<0.001);C.Western blot檢測(cè)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hAPN后hAPN蛋白表達(dá)水平;D.RT-qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)hAPN后M基因mRNA水平(***.P<0.001);E.Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)hAPN后N蛋白表達(dá)水平。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖

    2.5 hAPN與PDCoV S蛋白的互作分析

    為分析hAPN和PDCoV S蛋白的互作關(guān)系,從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取hAPN和PDCoV S的三聚體結(jié)構(gòu)(圖5 A、G);PDCoV S蛋白的單體結(jié)構(gòu)及其主要結(jié)構(gòu)域包括C-末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain,CTD)、N-末端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)、融合肽(fusion peptide,F(xiàn)P)、七肽重復(fù)序列(heptad repeat,HR)(圖5 B)。HCoV-229E和PDCoV S1 RBD,包含6個(gè)β-折疊和3個(gè)短而不連續(xù)的環(huán)組成的受體結(jié)合基序(receptor binding motifs,RBM)(圖5 C、D)。序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)PDCoV和HCoV-229E S1 RBD具有相似的空間結(jié)構(gòu),表明PDCoV RBD與hAPN的結(jié)合可能類似HCoV-229E RBD和hAPN的結(jié)合(圖5 E、F)。分子對(duì)接結(jié)果表明,PDCoV S1 RBD能夠結(jié)合hAPN結(jié)構(gòu)域Ⅱ,主要是S1蛋白的RBM1氨基酸殘基TYR、THR、THR、PHE和MET通過(guò)氫鍵與hAPN的氨基酸殘基PHE、GLN、ARG和SER結(jié)合(圖5 G、H)。

    A.PDCoV S 蛋白整體結(jié)構(gòu);B.PDCoV S 蛋白單體結(jié)構(gòu);C.HCoV-229E S1 RBD;D.PDCoV S1 RBD;E.HCoV-229E和PDCoV S1 RBD結(jié)構(gòu)比對(duì);F.HCoV-229E和PDCoV S1 RBD序列比對(duì);G~H.分子對(duì)接模擬PDCoV S1 RBD和hAPN蛋白的互作。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖

    3 討 論

    PDCoV是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種豬冠狀病毒,人工接種PDCoV能夠感染豬、牛、雞和火雞等多種動(dòng)物。PDCoV感染仔豬后引起明顯的腹瀉癥狀,而感染小雞后腹瀉癥狀較輕,接種PDCoV的小牛甚至未出現(xiàn)腹瀉和其他臨床癥狀。Lednicky等在兒童血清樣品中檢測(cè)到變異的PDCoV,首次報(bào)道了PDCoV可感染人。鑒于PDCoV在豬群的廣泛流行和跨宿主傳播風(fēng)險(xiǎn),研究宿主細(xì)胞蛋白在PDCoV復(fù)制中的作用具有重要意義。過(guò)表達(dá)hAPN、fAPN、pAPN、cAPN顯著增加細(xì)胞對(duì)PDCoV的易感性。APN在不同腸段中的差異表達(dá)與PDCoV腸道組織嗜性也密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)敲除hAPN降低PDCoV復(fù)制,而過(guò)表達(dá)hAPN促進(jìn)PDCoV復(fù)制,表明hAPN是影響PDCoV復(fù)制的重要宿主細(xì)胞因子,豐富了PDCoV跨種傳播和致病機(jī)制理論。

    S蛋白是冠狀病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白,在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中,S蛋白構(gòu)象的變化能促進(jìn)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合。此外,宿主細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境和蛋白水解酶對(duì)S蛋白的活化也是病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合所必需的。胰蛋白酶可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞之間的融合而促進(jìn)PDCoV增殖,但在病毒入侵細(xì)胞的過(guò)程中不發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,PDCoV通過(guò)胰蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞膜表面入侵ST和IPI-2I細(xì)胞的效率明顯高于內(nèi)吞體途徑。HEK293細(xì)胞是由剪切過(guò)的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)染的人胚腎細(xì)胞形成的細(xì)胞系,HEK293 T細(xì)胞是能夠穩(wěn)定表達(dá)SV40 T抗原的HEK293衍生細(xì)胞系。PEDV可以感染HEK293細(xì)胞,且與Vero細(xì)胞上的增殖特點(diǎn)相似。此外,黃病毒科成員,日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)和黃熱病毒(yellow fever virus,YFV)也可感染HEK293T細(xì)胞。由于HEK293細(xì)胞貼壁能力弱,對(duì)胰蛋白酶的耐受程度較弱,本研究在不添加胰蛋白酶的情況下,發(fā)現(xiàn)PDCoV可在HEK293細(xì)胞至少傳至2代,表明PDCoV可不依賴于胰蛋白酶入侵HEK293細(xì)胞。

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)是新發(fā)現(xiàn)的一種基因編輯工具,廣泛應(yīng)用于研究宿主因子在病毒復(fù)制中的作用。近年來(lái),CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被應(yīng)用于篩選調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的相關(guān)宿主因子。關(guān)于APN是否為PDCoV入侵宿主細(xì)胞的受體存在爭(zhēng)議。本研究為驗(yàn)證hAPN在PDCoV毒株CHN-SC2015復(fù)制中的作用,通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建hAPN敲除細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)hAPN敲除導(dǎo)致PDCoV基因mRNA水平下調(diào)約75%,N蛋白表達(dá)水平下降約66%。本研究還通過(guò)hAPN過(guò)表達(dá)驗(yàn)證其對(duì)病毒復(fù)制的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)hAPN可導(dǎo)致PDCoV基因mRNA水平上調(diào)2.7倍,N蛋白表達(dá)水平上調(diào)1.7倍,證實(shí)hAPN可明顯促進(jìn)PDCoV復(fù)制。

    冠狀病毒S蛋白主要由S1和S2結(jié)構(gòu)域組成,其中S1主要負(fù)責(zé)識(shí)別受體,而S2介導(dǎo)宿主細(xì)胞膜與病毒囊膜的融合。有研究表明,冠狀病毒S1 RBD可以與APN結(jié)合,介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞。HCoV-229E與hAPN的胞外域Ⅱ結(jié)合,而TGEV主要與pAPN的胞外域Ⅳ結(jié)合。pAPN結(jié)構(gòu)域Ⅶ(581—967 aa)在PEDV復(fù)制中發(fā)揮重要作用。在PDCoV研究中,Zhu等發(fā)現(xiàn)PDCoV S1-CTD蛋白可結(jié)合pAPN。本研究通過(guò)序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)PDCoV與HCoV-229E S1 RBD具有相似的空間結(jié)構(gòu),表明PDCoV可能與hAPN結(jié)合。因此,本研究通過(guò)分子對(duì)接方法模擬PDCoV S1 RBD與hAPN的結(jié)合,發(fā)現(xiàn)PDCoV S1 RBD能夠通過(guò)RBM1與hAPN結(jié)構(gòu)域Ⅱ結(jié)合。

    4 結(jié) 論

    PDCoV可以感染HEK293細(xì)胞,宿主細(xì)胞因子hAPN表達(dá)可促進(jìn)PDCoV復(fù)制。此外,PDCoV S1 RBD可通過(guò)RBM1氨基酸殘基TYR、THR、THR、PHE和MET與hAPN蛋白的氨基酸殘基PHE、GLN、ARG和SER結(jié)合,證實(shí)了hAPN是影響PDCoV復(fù)制的一個(gè)重要宿主細(xì)胞因子。

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