基原為云南獨蒜蘭的山慈菇的化學成分鑒定與分析

王靜 肖秋肖 周祖英 仁莎莎 陳思穎 鞏仔鵬 黃勇 王愛民 劉春花 李月婷

中圖分類號 R917;R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）10-1165-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.10.03

摘 要 目的 鑒定、分析山慈菇（基原為云南獨蒜蘭）的化學成分。方法 采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯(lián)用技術。色譜柱為Hyperdil GOLD，流動相為0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈溶液（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為2 ?L;離子源為電噴霧離子源，掃描范圍為m/z 100～1 500，掃描模式為全掃描+數(shù)據(jù)依賴二級掃描的正負離子交換模式。采用Compound Discoverer 3.1軟件，通過與mzCloud、PubChem網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫和中藥成分高分辨質譜本地數(shù)據(jù)庫OTCML進行比對，同時結合對照品和已有文獻確定化合物結構。結果與結論 從山慈菇中共鑒定出42個化學成分（正離子模式下有24個、負離子模式下有27個），包括13個丁二酸芐酯苷類成分（如dactylorhin C、coelovirin A、militarine等）、4個酚苷類成分（如腺苷、鳥苷、天麻素等）、3個生物堿類成分（膽堿、甜菜堿、小檗堿）、1個黃酮類成分（川陳皮素）、7個芳香族類成分（如DL-賴氨酸、DL-精氨酸、DL-谷氨酰胺等）、1個糖類成分（蔗糖）、3個聯(lián)芐類成分（shancigusin H、shancigusin H isomer、山藥素Ⅲ）和10個其他類成分（如對甲氧基苯甲酸、十二烷二酸單甲酯、二苯胺等）。丁二酸芐酯苷類成分在裂解過程中易丟失葡萄糖氧芐基和一些小分子;酚苷類成分易丟失糖基;生物堿類成分以小分子取代基的裂解和丟失為主;黃酮類成分多發(fā)生脫甲基反應。

關鍵詞 山慈菇;超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯(lián)用技術;化學成分;鑒定;分析

Identification and analysis of chemical constituents of Pleione yunnanensis with origin of Pleione yunnanensis

WANG Jing1，2，XIAO Qiuxiao1，2，ZHOU Zuying1，2，REN Shasha1，2，CHEN Siying1，GONG Zipeng1，HUANG Yong1，WANG Aimin3，LIU Chunhua3，LI Yueting1（1. Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics in Guizhou/State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 2. School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 3. Engineering Research Center of the Minstry of Education for the Development and Application of Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To identify and analyze chemical constituents of Pleione yunnanensis with origin of Pleione yunnanensis. METHODS UPLC-Q-Exactive-Plus-Orbitrap-MS was adopted. The determination was performed on Hyperdil GOLD column with mobile phase consisted of? ?0.1% formic acid solution-0.1% formic acid acetonitrile solution （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃， and sample size was 2 ?L. The electrospray ion source was adopted， and the scanning range was m/z 100-1 500， and the scanning mode was positive and negative ion exchange mode of full scan+ddMS2. The structure of chemical constituents were determined by using Compound Discoverer 3.1 software， comparing with mzCloud， PubChem network database and OTCML， on the basis of reference substance and published literatures. RESULTS & CONCLUSIONS A total of 42 chemical constituents were identified （positive ion mode has 24， negative ion mode has 27）， including 13 benzyl succinate glycosides（such as dactylorhin C， coelovirin A， militarine）， 4 phenol glycosides（such as adenosine， guanosine， gastrodin）， 3 alkaloids （choline， betaine， berberine）， and one flavonoid （nobiletin）， 7 aromatics （such as DL-lysine， DL-arginine， DL-glutamine）， one sugar （sucrose）， 3 benzenes （shancigusin H， shancigusin H isomer， batatasin Ⅲ） and 10 others （such as p-methoxybenzoic acid， monomethyl dodecanedioate， diphenylamine）. Glucose oxybenzyl and some small molecules are easy to be lost in the cleavage of benzyl succinate glycosides; glycosyl is easy to be lost in the cleavage of phenol glycosides; the cleavage of alkaloids mainly manifest as the cleavage and loss of small molecular substituents; demethyla- tion reaction is occurred in most flavonoids.

KEYWORDS? ?Pleione yunnanensis; UPLC-Q-Exactive-Plus- Orbitrap-MS; chemical constituents; identification; analysis

山慈菇為蘭科植物杜鵑蘭Cremastra appendiculata（D. Don）Makino、獨蒜蘭Pleione bulbocodioides（Franch.）Rolfe 或云南獨蒜蘭Pleione yunnanensis Rolfe的干燥假鱗莖，前者習稱“毛慈菇”，后兩者習稱“冰球子”[1]。該藥主要分布于我國貴州、云南、山西、陜西等地，為我國瀕危藥用植物[2]。山慈菇歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、化痰散結的功效[1]，以山慈菇為主要藥材的多種中藥復方制劑（如菊藻丸）療效顯著[3]。目前，山慈菇的基礎研究多集中在杜鵑蘭化學成分的分離鑒定及綜述報道[4-5]，而關于云南獨蒜蘭的研究較少。山慈菇作為2020年版《中國藥典》（一部）收錄品種之一，僅有“性狀”和“鑒別”項[1]，缺乏有效的質量控制標準，加之山慈菇基原多樣，導致市面上山慈菇偽品不斷[6]。因此，明確山慈菇化學成分，不僅有助于闡明其藥效物質基礎，還可用于藥材基原的確定。

近年來，超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯(lián)用（UPLC-Q-Exactive-Plus-Orbitrap-MS）技術被廣泛應用于蛋白組學和中藥復方、成分的分析，具有分離效率高、掃描速度快、分辨率高、靈敏度高等特點[7]?；诖?，本研究擬采用UPLC-Q-Exactive-Plus-? Orbitrap-MS技術對山慈菇（基原為云南獨蒜蘭）的主要成分進行分析，旨在為闡明其化學成分、挖掘藥效物質基礎及建立質量標準提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Vanquish型UPLC系統(tǒng)、Q Exactive Plus型高分辨質譜儀及配套的中藥成分高分辨質譜本地數(shù)據(jù)庫OTCML（美國Thermo Fisher Scientific公司），F(xiàn)W100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），EL-104型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，Allegra X-30R Centrifuge型離心機（美國Beckman Coulter公司），KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 藥品與試劑

天麻素對照品（批號110807-202010，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院;山藥素Ⅲ、militarine、dactylorhin A對照品（批號分別為AF20080910、AF20082308、AF21071602，純度均大于98%）均購自成都埃法生物科技有限公司;鳥苷對照品（批號F2012066，純度≥98%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;腺苷對照品（批號A8653358E，純度≥98%）購自上海吉至生化科技有限公司;loroglossin對照品（批號210610，純度≥97%）購自上海源葉生物科技有限公司;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

山慈菇飲片（批號201103）購自亳州市永剛飲片廠有限公司，經(jīng)貴州醫(yī)科大學藥學院生藥學教研室劉春花副教授鑒定為蘭科植物云南獨蒜蘭P. yunnanensis Rolfe的干燥假鱗莖。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以Hyperdil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～4 min，2%B→5%B;4～8 min，5%B→12%B;8～11 min，12%B→20%B;11～16 min，20%B→22%B;16～22 min，22%B→28%B;22～30 min，28%B→35%B;30～33 min，35%B→65%B;33～36 min，65%B→95%B;36～39 min，95%B→40%B;39～40 min，40%B→2%B;40～43 min，2%B）;流速為0.3 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣量為2 ?L。

2.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源;噴霧電壓為 3 500 V;鞘氣流速為40 arb;輔助氣壓力為10 arb;霧化氣溫度為350 ℃;掃描范圍為m/z 100～1 500;毛細管溫度為320 ℃;探頭加熱器溫度為350 ℃;離子透鏡電壓頻率為50.0;碰撞能梯度為 20、40、60 eV;掃描模式為全掃描+數(shù)據(jù)依賴二級掃描的正負離子交換模式;一級分辨率為70 000;二級分辨率為17 500。

2.3 供試品溶液的制備

取山慈菇飲片適量，粉碎，過40目篩。精密稱取上述粉末1 g，加入80%甲醇25 mL，稱定質量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，冷卻至室溫，再次稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，濾過，以12 000 r/min離心5 min，取上清液，即得質量濃度為40 mg/mL（以生藥量計）的供試品溶液。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取天麻素、山藥素Ⅲ、dactylorhin A、鳥苷、腺苷、loroglossin、militarine對照品適量，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解后再用甲醇定容，制得質量濃度均為20 μg/mL的單一對照品溶液，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Compound Discoverer 3.1軟件分析山慈菇的UPLC-MS/MS數(shù)據(jù)，將所得到的質譜信息（保留時間、一級和二級碎片離子信息等）與mzCloud（www.mzCloud.org）、PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫、中藥成分高分辨質譜本地數(shù)據(jù)庫OTCML進行比對，設置兩者一級、二級質量的誤差為5 ppm。

2.6 化學成分分析

2.6.1 正離子模式 取“2.3”項下供試品溶液和“2.4”項下各單一對照品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析，得山慈菇在正離子模式下的總離子流圖（圖1，對照品圖略）。根據(jù)各成分峰的碎片離子信息，按“2.5”項下方法處理質譜數(shù)據(jù)，并參考相關文獻[8-30]，最終從山慈菇中共鑒定出24個化學成分。結果見表1。

2.6.2 負離子模式 取“2.3”項下供試品溶液和“2.4”項下各單一對照品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析，得山慈菇在負離子模式下的總離子流圖（圖2，對照品圖略）。根據(jù)各成分峰的碎片離子信息，按“2.5”項下方法處理質譜數(shù)據(jù)，并參考相關文獻[8-30]，最終從山慈菇中共鑒定出27個化學成分。結果見表1。

同時通過與各單一對照品質譜圖進行對比，指認峰10為腺苷、峰11為鳥苷、峰12為天麻素、峰27為loroglossin、峰30為dactylorhin A、峰32為militarine、峰35為山藥素Ⅲ。結果見圖3。

2.7 裂解規(guī)律分析

2.7.1 丁二酸芐酯苷類化合物 丁二酸芐酯苷類是一類存在于蘭科植物中且結構較新穎的化學成分。該類化合物有2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯結構，具有益智、延緩衰老、保護神經(jīng)等作用[31]。本研究從山慈菇中共鑒定出13個丁二酸芐酯苷類化合物，分別為dactylorhin C（峰15）、coelovirin A（峰23）、dactylorhin E（峰24）、dactylorhin E isomer（峰26）、loroglossin（峰27）、gymnoside Ⅰ（峰28）、gymnoside Ⅱ（峰29）、dactylorhin A（峰30）、militarine（峰32）、gymnoside Ⅴ（峰36）、gymnoside Ⅳ（峰37）、gymnoside Ⅵ（峰38）、gymnoside Ⅴ isomer（峰40），其中峰27、30、32經(jīng)與對照品對比確認，分別為loroglossin、dactylorhin A、militarine。

以保留時間為24.08 min的化合物32為例，其分子式為C34H46O17，在負離子模式下的準分子離子峰為m/z 725.265[M-H]-。參考其碎片離子信息推測裂解規(guī)律如下：準分子離子峰水解脫酯，從酯鍵斷裂，失去1個天麻單元（-C13H16O6，質量數(shù)少了268），形成特征碎片離子峰m/z? 457.171[M-C13H16O6-H]-;進一步裂解，失去1個異丁基-蘋果酸單元和天麻單元，分別形成碎片離子峰m/z 285.098[M-C21H28O10-H]-和m/z 189.076[M-C26H32O12-H]-;碎片離子峰m/z 189.076進一步裂解，脫去2分子H2O得到碎片離子峰m/z 153.055[M-C26H36O14-H]-。根據(jù)上述裂解規(guī)律并參考相關文獻[27]，推測化合物32（militarine）可能的裂解途徑如圖4所示。

2.7.2 酚苷類化合物 酚苷類化合物是由苷元分子中的酚羥基與糖分子中的端基碳原子縮合而成的苷類化合物[32]。本研究從山慈菇中共鑒定出4個酚苷類化合物，分別為尿苷（峰8）、腺苷（峰10）、鳥苷（峰11）、天麻素（峰12），其中峰10、11、12經(jīng)與對照品對比確認，分別為腺苷、鳥苷、天麻素。

以保留時間為3.38 min的化合物12為例，其分子式為C13H18O7，在負離子模式下的準分子離子峰為m/z 285.097[M-H]-。參考其碎片離子信息推測裂解規(guī)律如下：準分子離子峰通過消除葡糖基，產(chǎn)生特征碎片離子峰m/z? 123.044[M-C6H10O5-H]-、m/z? 105.034[M-C6H12O6-H]-。根據(jù)上述裂解規(guī)律并參考相關文獻[18]，推測化合物12（天麻素）可能的裂解途徑如圖5所示。

2.7.3 生物堿類化合物 生物堿類化合物又被稱為“贗堿”，是廣泛存在于自然界（主要為植物）中的一類含氮堿性有機化合物，有類似堿的性質和藥理活性（如調節(jié)血脂、抗炎、抗病毒等）[33]。本研究從山慈菇中共鑒定出3個生物堿類化合物，分別為膽堿（峰2）、甜菜堿（峰6）、小檗堿（峰31）。

以保留時間為20.97 min的化合物31為例，其分子式為C20H17NO4，在正離子模式下的準分子離子峰為m/z? 336.123[M+H]+。參考其碎片離子信息推測裂解規(guī)律如下：由于準分子離子峰9位/10位的羥基氫被甲基取代，容易發(fā)生脫甲基化，失去1分子CH2（斷裂為9位或10位），產(chǎn)生二級碎片離子峰m/z? 322.091[M-CH2+H]+;該碎片離子峰再次發(fā)生去甲基化反應，產(chǎn)生碎片離子峰m/z 307.043[M-CH3-CH2+H]+。根據(jù)上述裂解規(guī)律并參考相關文獻[28]，確認化合物31為小檗堿，其可能的裂解途徑如圖6所示。

2.7.4 黃酮類化合物 黃酮類化合物是一類以2-苯基色原酮為基本母核的化合物，又名黃酮或黃堿素[34]，具有保護神經(jīng)、抗心肌缺血、降壓等作用[34]。本研究從山慈菇中共鑒定出1個黃酮類化合物，為川陳皮素（峰41）。

化合物41的保留時間為34.00 min，其分子式為C21H22O8，在正離子模式下的準分子離子峰為m/z? 403.139[M+H]+。參考其碎片離子信息推測裂解規(guī)律如下：由于準分子離子峰的羥基氫被甲基取代，發(fā)生單脫甲基反應，失去1分子CH3，產(chǎn)生碎片離子峰m/z 388.115[M-CH3+H]+;該碎片離子峰繼續(xù)發(fā)生雙脫甲基反應，生成比準分子離子峰少28的碎片離子峰m/z? 373.091[M-OCH2+H]+，再進一步脫去1分子H2O，生成二級碎片離子峰m/z? 355.080[M-CH4O2+H]+。根據(jù)上述裂解規(guī)律并參考相關文獻[29]，確認化合物41為川陳皮素，其可能的裂解途徑如圖7所示。

2.7.5 芳香族類、糖類、聯(lián)芐類及其他類化合物 本研究從山慈菇中共鑒定出7個芳香族類（DL-賴氨酸、DL-精氨酸、DL-谷氨酰胺、L-酪氨酸、色氨酸、香蘭素、L-苯丙氨酸）、1個糖類（蔗糖）、3個聯(lián)芐類（shancigusin H、shancigusin H isomer、山藥素Ⅲ）和10個其他類（對甲氧基苯甲酸、十二烷二酸單甲酯、二苯胺等），其可能的裂解途徑略。

3 討論

由于山慈菇（基原為杜鵑蘭）所含成分具有抗腫瘤活性[35]，加之市場需求不斷增加，使其成為熱點品種。云南獨蒜蘭作為山慈菇的基原之一，其組胚培育技術較為成熟[36]，但藥效物質基礎不明確，化學成分及藥理作用研究較少。為防止不同種質混用并明確山慈菇的化學成分，本課題組對基原為云南獨蒜蘭的山慈菇進行了成分分析。

UPLC-Q-Exactive-Plus-Orbitrap-MS技術具有高分辨率、高分離效率及高靈敏度等特點[7]，與既往研究山慈菇化學成分所用方法（硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、反相柱色譜等）相比，操作更為簡單、快速，可全面、整體地對山慈菇化學成分進行解析。本課題組前期對不同流動相體系（水-乙腈、0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈溶液）進行了考察，結果顯示，以0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈溶液為流動相時，各色譜峰的峰形較好，故選擇0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈溶液為流動相。為最大程度獲取成分的質譜信息，本課題組前期分別采用正、負離子模式進行掃描，結果顯示，各成分在正、負離子模式下的響應強度存在明顯差異，但同時使用兩種模式時能夠滿足快速、準確的定性要求。

本研究從山慈菇中共鑒定出42個化學成分，包括13個丁二酸芐酯苷類成分（如dactylorhin C、coelovirin A、militarine等）、4個酚苷類成分（如腺苷、鳥苷、天麻素等）、3個生物堿類成分（膽堿、甜菜堿、小檗堿）、1個黃酮類成分（川陳皮素）、7個芳香族類成分（如DL-賴氨酸、DL-精氨酸、DL-谷氨酰胺等）、1個糖類成分（蔗糖）、3個聯(lián)芐類成分（shancigusin H、shancigusin H isomer、山藥素Ⅲ）和10個其他類成分（如對甲氧基苯甲酸、十二烷二酸單甲酯、二苯胺等），其中有5個成分（對甲氧基苯甲酸、川陳皮素、香蘭素、shancigusin H isomer、dactylorhin C）為首次從山慈菇（基原為云南獨蒜蘭）中發(fā)現(xiàn)。丁二酸芐酯苷類化合物在二級質譜的誘導碰撞解離中易裂解，丟失葡萄糖氧芐基離子，失去一些如H2O的小分子;酚苷類化合物由于苷元分子中的酚羥基易與糖分子中的端基碳原子縮合形成氧苷，在裂解過程中，多以丟失糖基為主;生物堿類化合物在質譜高能碰撞下，母核一般不發(fā)生裂解，主要以發(fā)生小分子取代基的裂解與丟失（如CH2）為主，使其母核形成更穩(wěn)定的大π共軛體系;黃酮類化合物由于黃酮母核上有多個甲氧基取代，在質譜條件下主要丟失CH3、H2O。

本研究通過分析山慈菇化學成分發(fā)現(xiàn)，丁二酸芐酯苷類成分在總離子流圖中響應較強，同時對山慈菇含量進行檢測后發(fā)現(xiàn)，含量較高的dactylorhin A、militarine、gymnoside Ⅴ均屬于丁二酸芐酯苷類成分，表明丁二酸芐酯苷類成分是山慈菇的主要化學成分。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，該類化合物具有改善認知、提高學習記憶能力、抗炎、抗氧化等作用[31]，其中dactylorhin A、militarine對阿爾茨海默病模型大鼠的癡呆癥狀有改善作用[37]。酚苷類化合物可抑制缺血性腦卒中導致的神經(jīng)元死亡[38]。此外，有文獻報道，山慈菇（基原為杜鵑蘭）具有神經(jīng)保護作用[39]。由此推測，山慈菇（基原為云南獨蒜蘭）可能也具有保護神經(jīng)的作用，但后續(xù)尚需藥效學研究予以證實。

綜上所述，本研究采用UPLC-Q-Exactive-Plus-Orbitrap-MS技術對山慈菇的化學成分進行了鑒定，并探討了丁二酸芐酯苷類、酚苷類、生物堿類和黃酮類化合物的潛在質譜裂解規(guī)律，為山慈菇的藥效物質基礎研究提供了參考，亦為其質量控制提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2021-12-24 修回日期：2022-03-31）

（編輯：陳 宏）