胰腺癌免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的構(gòu)建及評估

羅寶花 劉曉秋 雷靜玉 張彩勤 張永斌師長宏*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心,廣州 510405;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,西安 710032;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,廣州 510405)

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤,其發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、預(yù)后極差,5 年生存率僅為8.5%[1-3]。臨床數(shù)據(jù)顯示,胰腺癌對放療不敏感,對化療易耐藥,手術(shù)切除是目前治療胰腺癌的主要手段[4-6]。然而,多數(shù)患者在確診時已存在局部血管的浸潤或轉(zhuǎn)移,術(shù)后的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率很高,患者術(shù)后5 年總生存率不超過20%～25%[7-8]。因此,迫切需要尋找新的治療策略來提高胰腺癌的治療效果。

近年來,腫瘤免疫療法和免疫檢查點抑制劑的誕生給腫瘤治療帶來了革命性的變化,針對細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原4 (cytotoxic T-lymphocyteassociated protein-4,CTLA-4)和程序性死亡蛋白1/程序性死亡蛋白配體1(programmed death protein 1/programmed death protein ligand 1,PD-1/PD-L1)的免疫檢查點抑制劑在非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、腎癌等惡性腫瘤的治療中取得了卓越療效[9-11],顯示了人體免疫系統(tǒng)在抗腫瘤方面的巨大潛力。目前針對胰腺癌開展的免疫療法包括免疫檢查點抑制劑、CAR-T 療法、溶瘤病毒、腫瘤疫苗、免疫因子調(diào)節(jié)劑等,大部分免疫治療的療效評估都是臨床研究[12-15],周期較長,進(jìn)程緩慢,少數(shù)的臨床前研究也是在自發(fā)胰腺癌小鼠模型上進(jìn)行[16-18],由于存在種間差異,臨床前研究結(jié)果與腫瘤患者實際臨床特點的一致性較差,難以實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化,因此,亟需找到一個合適的臨床前動物模型來推動胰腺癌免疫治療策略的開發(fā)。近年來,隨著重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠的不斷改良,具有人免疫系統(tǒng)的人源化小鼠模型得以建立,通過將患者來源的腫瘤細(xì)胞系或腫瘤組織移植入免疫系統(tǒng)人源化小鼠體內(nèi)構(gòu)建的腫瘤免疫雙人源化小鼠模型,可以極大程度地模擬患者體內(nèi)腫瘤組織與免疫系統(tǒng)的相互作用,可能成為推動腫瘤免疫治療策略臨床前研究的理想工具。

本研究通過將人外周血單個核細(xì)胞和人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)spc1 同時植入重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠NCG 體內(nèi)以構(gòu)建胰腺癌免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型并進(jìn)行模型的有效性評估,以期為后續(xù)開展的胰腺癌免疫治療研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

24 只5～6 周齡SPF 級雌性重度聯(lián)合免疫缺陷NCG 小鼠,體重22～25 g,購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司【SCXK(蘇)2018-0008】,飼養(yǎng)在空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心SPF 級屏障設(shè)施內(nèi)【SYXK(陜)2017-001】。環(huán)境溫度23～25℃,相對濕度40%～60%,12 h 晝夜交替,小鼠籠盒、墊料、飼料及飲用水等經(jīng)高溫高壓滅菌處理,動物自由攝食和飲水。相關(guān)動物實驗獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物福利及倫理委員會批準(zhǔn)(審批號:20180512)。

1.1.2 細(xì)胞系

人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)spc1 細(xì)胞購買于ATCC,使用DMEM 培養(yǎng)基(10%胎牛血清+1%青鏈霉素)于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑與儀器

4 份健康人新鮮外周血從西京醫(yī)院輸血科獲取,獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(KY20193035),人淋巴細(xì)胞分離液、小鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物科技有限公司),抗人hCD45 流式抗體(BD,555482),抗鼠mCD45 流式抗體(BD,553082),IHC試劑盒(康為世紀(jì)有限公司),抗人PD-L1 抗體(Abcam,ab205921),抗人CD45 抗體(CST,13917 S),抗人CD8 抗體(proteintech,66868-1-Ig),抗人CD4 抗體(Abcam,ab133616),抗人顆粒酶B 抗體(Abcam,ab208586),胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、0.05%胰酶(Gibco);人抗PD-1 單抗帕博利珠單抗(K 藥) 購自MSD;熒光正置顯微鏡(奧林巴斯BX43) 用于免疫組織化學(xué)染色分析,FC500(Beckman Coulter)和Flow Jo 軟件用于流式細(xì)胞采集與數(shù)據(jù)分析。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

NCG 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,隨機(jī)分為未重建組(Aspc1)、重建不治療組(Aspc1+PBMC)及重建K藥治療組(Aspc1+PBMC+K),共3 組,每組8 只,所有動物均飼養(yǎng)在SPF 級屏障設(shè)施內(nèi)。

1.2.2 PBMC 的分離純化

應(yīng)用Ficoll 密度梯度離心法1750 rpm,20℃,20 min 獲取第2 層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層,即PBMC,加入3～5 倍體積的紅細(xì)胞裂解液,4℃裂解5 min,隨后加入3～5 倍體積buffer 重懸細(xì)胞,750 rpm,4℃,10 min 低速離心以去除血小板,重復(fù)3 次,最后用PBS 重懸細(xì)胞計算細(xì)胞數(shù)量和活率。

1.2.3 免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的構(gòu)建

獲取新鮮純化的PBMC 后,用PBS 重懸為5 ×107/mL,并置于冰上,每只小鼠注射劑量為1 × 107,經(jīng)尾靜脈注射植入NCG 小鼠體內(nèi),構(gòu)建免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠外周血中人免疫細(xì)胞的重建水平

PBMC 植入后第3 周用斷尾法采集小鼠外周血,并用Ficoll 密度梯度離心法分離出PBMC 制成單個細(xì)胞懸液,同時標(biāo)記流式抗人hCD45 和抗鼠mCD45 熒光抗體后,進(jìn)行流式分析,評估小鼠外周血中人免疫細(xì)胞的重建水平。計算方法:hCD45/(hCD45+mCD45),應(yīng)用FlowJo 7.6.1 軟件進(jìn)行分析及繪圖。

1.2.5 胰腺癌免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的構(gòu)建

PBMC 植入NCG 小鼠體內(nèi)后第2 天,將處于對數(shù)生長期的Aspc1 細(xì)胞經(jīng)0.05%的胰蛋白酶消化后,用無菌PBS 緩沖液和Matrigel 基質(zhì)膠以1 ∶1 的比例將細(xì)胞重懸至2 × 106/200 μL,經(jīng)皮下植入小鼠體內(nèi),構(gòu)建胰腺癌免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型。

1.2.6 腫瘤生長監(jiān)測及K 藥治療

在腫瘤細(xì)胞接種后,動態(tài)監(jiān)測腫瘤生長情況,每周2 次監(jiān)測腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線,腫瘤體積計算方法:V(mm3)=長(mm)×寬2(mm2)/2,當(dāng)腫瘤生長至100～200 mm3時,重建K 藥治療組(Aspc1+PBMC+K)開始給予K 藥治療,經(jīng)腹腔注射,每周2 次,每次劑量為10 mg/kg,持續(xù)治療3 周,未重建組(Aspc1)及重建不治療組(Aspc1+PBMC)給予等劑量生理鹽水。

1.2.7 免疫浸潤情況分析

治療3 周結(jié)束后,終止實驗,對荷瘤小鼠采用吸入CO2安樂死,收集各組小鼠腫瘤組織、脾及骨髓,固定于4%多聚甲醛溶液中,石蠟包埋后做組織切片,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色或免疫熒光染色,顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析及圖片制作,以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示。采用t檢驗法進(jìn)行組間差異性分析,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型

經(jīng)過多次實驗摸索,確定按照圖1A 指示的流程,應(yīng)用Ficoll 密度梯度離心法獲得新鮮的純度＞94%,活率＞98%的人PBMC,然后經(jīng)尾靜脈注射植入重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠NCG 體內(nèi),在PBMC 植入3 周后采集小鼠外周血,利用流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠外周血免疫細(xì)胞中人CD45+細(xì)胞比例,結(jié)果顯示,小鼠外周血中 hCD45/(hCD45+mCD45) ＞ 25%(54.7%～84.2%)(圖1B),待實驗結(jié)束時,收集重建小鼠的脾及骨髓,用4%多聚甲醛溶液固定后,石蠟包埋做組織切片,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果顯示,脾和骨髓中也含有較高水平的人CD45+細(xì)胞(圖1C),這些結(jié)果均提示免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型構(gòu)建成功。

圖1 成功構(gòu)建免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型Note.A.PBMC separation and purification procedure.B.Flow cytometry analysis of the percentage of human CD45+ cells in the peripheral blood immune cells of reconstructed mouse 3 weeks after PBMC implantation.C.The expression of human CD45+ cells in spleen and bone marrow of mouse was detected.Figure 1 Humanized immune system mouse model was successfully constructed

2.2 重建的人源免疫系統(tǒng)能夠抑制人源胰腺癌生長

本研究在構(gòu)建胰腺癌免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型前,先在重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠NCG 皮下植入2 × 106Aspc1 細(xì)胞,并對其生長情況進(jìn)行定期監(jiān)測,結(jié)果顯示,Aspc1 細(xì)胞在植入第3 周時,腫瘤體積達(dá)100 mm3左右(見圖2A),可以開始治療,而Hu-PBMC 小鼠模型(humanized-peripheral blood mononuclear cells,Hu-PBMC)的重建時間一般為3周左右[19],因此,本研究在后續(xù)進(jìn)行胰腺癌免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型構(gòu)建時,在相近的時間點分別將PBMC 和Aspc1 植入NCG 體內(nèi),在PBMC 植入后第3 周,腫瘤體積達(dá)100～200 mm3時進(jìn)行流式檢測以評估人源免疫系統(tǒng)的重建效果,并開始K藥治療(圖2B)。結(jié)果顯示,與未重建組(Aspc1)相比,重建不治療組(Aspc1+PBMC)能夠減緩腫瘤生長(P＜0.01),而重建K 藥治療組(Aspc1+PBMC+K)減緩腫瘤生長的作用則更為顯著(P＜0.001)(圖2C),提示重建的人源免疫系統(tǒng)有功能,能夠發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖2 重建的人源免疫系統(tǒng)能夠抑制人胰腺癌生長Note.A.Growth curve of Aspc1 in NCG mouse.B.Construction strategy of humanized immune system mouse model with human pancreatic cancer and treatment strategy of K drug.C.Tumor growth curves of the non-reconstruction group (Aspc1),reconstruction without treatment group (Aspc1+PBMC) and reconstruction of K drug treatment group (Aspc1+PBMC+K).Compared with non-reconstruction group (Aspc1),**P ＜0.01,***P ＜0.001.Compared with reconstruction without treatment group (Aspc1+PBMC),#P ＜0.01.Figure 2 Reconstructed humanied immune system inhibits the growth of human pancreatic cancer

2.3 重建的人源免疫系統(tǒng)能夠被人抗PD-1 單抗活化

K 藥治療結(jié)束后,收集未重建組(Aspc1)、重建不治療組(Aspc1+PBMC) 及重建K 藥治療組(Aspc1+PBMC+K)小鼠的腫瘤組織做免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色,分析不同處理組之間腫瘤組織內(nèi)人PD-L1、CD45、CD8、CD4 和顆粒酶B(Granzyme B,GZMB)的表達(dá)差異,結(jié)果顯示,未重建組(Aspc1) 的腫瘤組織內(nèi)無人PD-L1、CD45、CD8、CD4 和GZMB 表達(dá),重建不治療組(Aspc1+PBMC)與重建K 藥治療組(Aspc1+PBMC+K)組的腫瘤組織均有人PD-L1、CD45、CD8、CD4 和GZMB表達(dá),與重建不治療組(Aspc1+PBMC)相比,重建K藥治療組(Aspc1+PBMC+K)的腫瘤組織中人CD45和CD4 的表達(dá)無顯著性差異,而PD-L1 (P＜0.001)、CD8(P＜0.01)和GZMB(P＜0.01)的表達(dá)顯著性增多(圖3A,3B),這些結(jié)果表明重建的人源免疫系統(tǒng)能夠被人抗PD-1 單抗活化,而且人抗PD-1 單抗治療誘導(dǎo)的增強(qiáng)的抗腫瘤作用主要與CD8+T 的活化有關(guān)。

圖3 重建的人源免疫系統(tǒng)能夠被人抗PD-1 單抗活化Note.Differential expression of human PD-L1,CD45,CD8,CD4 and GZMB in tumor tissues of the non-reconstruction group (Aspc1),reconstruction without treatment group (Aspc1+PBMC) and reconstruction of K drug treatment group (Aspc1+PBMC+K).Compared with the reconstruction without treatment group (Aspc1+PBMC),*P ＜0.05,**P ＜0.01,***P ＜0.001.Figure 3 Reconstructed humanized immune system can be activated by human anti-PD-1 monoclonal antibody

3 討論

CD45 分子在所有白細(xì)胞上都有表達(dá),稱為白細(xì)胞共同抗原,是所有免疫細(xì)胞的共同標(biāo)志物[20]。Hu-PBMC 小鼠模型是一種構(gòu)建較為簡單和經(jīng)濟(jì)的免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型,當(dāng)人PBMC 植入重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠后第3 周,小鼠外周血免疫細(xì)胞中人CD45+細(xì)胞的比例大于25%時,提示該模型構(gòu)建成功[19]。Hu-PBMC 小鼠模型主要以重建人的T 淋巴細(xì)胞為主,比例可達(dá)90%以上,因此該模型是研究成熟T 細(xì)胞功能及其效應(yīng)的理想模型,可用于研究人效應(yīng)T 細(xì)胞的活化過程或用于免疫治療藥物的評估等[21]。但是,該模型有一明顯的局限性,由于重建的人源免疫細(xì)胞與鼠源細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)不匹配,會出現(xiàn)致死性的移植物抗宿主反應(yīng)(graftversus-host disease,GVHD),通常在PBMC 植入后4～6周開始出現(xiàn),其嚴(yán)重程度與人T 細(xì)胞的植入水平直接相關(guān),可以通過小鼠體重減輕、炸毛、弓背等癥狀來評估。由于GVHD 的發(fā)生,Hu-PBMC 小鼠模型實驗觀察窗口期較短,在實驗過程中需要充分利用免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的窗口期,以保證腫瘤免疫雙人源化小鼠模型構(gòu)建成功后還能有足夠的時間窗口進(jìn)行后續(xù)實驗,因此,在進(jìn)行腫瘤免疫雙人源化小鼠模型的構(gòu)建時,需要綜合考慮免疫重建所需的時間以及人源腫瘤的生長情況。為了充分利用實驗窗口期,本研究實施了在構(gòu)建胰腺癌免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型前,先在重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠皮下植入胰腺癌細(xì)胞并對其生長情況進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測,以確定腫瘤植入與進(jìn)行免疫重建的最佳時間,從而實現(xiàn)最長的免疫治療窗口。

在對臨床患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫藥物篩選時,理想情況下應(yīng)該使用患者自身的PBMC 進(jìn)行重建,但是由于腫瘤患者接受過化療或自身免疫力下降等諸多原因,從腫瘤患者外周血中獲取的PBMC數(shù)量非常有限,而Hu-PBMC 小鼠模型構(gòu)建的成功率與植入的PBMC 的數(shù)量密切相關(guān),多數(shù)情況下從腫瘤患者外周血中獲取的PBMC 數(shù)量不能滿足實驗要求,因此,在無法從患者上獲取足量的PBMC的情況下,可以考慮使用正常人的PBMC 進(jìn)行重建并分組評估給予不同干預(yù)的治療效果。但由于不同個體來源的PBMC 可能會對免疫治療藥物產(chǎn)生不同的反應(yīng),因此,我們在進(jìn)行免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的構(gòu)建時會同時選用3 個以上的PBMC 供體,對同一種免疫治療藥物進(jìn)行評估,以明確該藥物在不同個體上是否具有普適性。根據(jù)本實驗結(jié)果,不同的供體對帕博利珠單抗具有一致的反應(yīng)性。

PD-1 是一種免疫負(fù)調(diào)控分子,能夠在T 細(xì)胞上表達(dá),PD-L1 是其配體,在腫瘤微環(huán)境中,PD-1/PDL1 的相互作用可促使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)測,從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。與正常組織相比,腫瘤組織中PDL1 的表達(dá)明顯增多,大量研究認(rèn)為這是由抗腫瘤免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的,腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞在識別腫瘤抗原后,釋放γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng),與此同時,腫瘤細(xì)胞會表達(dá)PD-L1 產(chǎn)生一種適應(yīng)性免疫抵抗以逃避免疫細(xì)胞的殺傷[22-23],因此,腫瘤組織中PD-L1 的表達(dá)上調(diào),可認(rèn)為是一種腫瘤免疫反應(yīng)活化的標(biāo)志。CD8+T 細(xì)胞是細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞,能夠分泌各種細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng),如IFN-γ、GZMB 等,對腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用,是機(jī)體發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵細(xì)胞[24]。在本研究中,未進(jìn)行免疫重建的小鼠體內(nèi)腫瘤組織不表達(dá)人PD-L1,無CD8+T 細(xì)胞浸潤,而進(jìn)行免疫重建后,腫瘤組織中有人源性CD8+T 細(xì)胞的浸潤和PDL1 的表達(dá),表明小鼠體內(nèi)的人源腫瘤組織能夠誘導(dǎo)重建的人源免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤免疫反應(yīng),抑制腫瘤生長,即免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型具有人免疫功能。在給予K 藥治療后,與不治療的免疫系統(tǒng)人源化小鼠相比,腫瘤組織中浸潤的人源性CD45+細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞的含量無明顯變化,而CD8+T 細(xì)胞、GZMB 和PD-L1 的表達(dá)明顯增多,表明抗PD-1 單抗治療誘導(dǎo)的增強(qiáng)的腫瘤抑制作用主要與CD8+T 的活化有關(guān),重建的人源性CD8+T 細(xì)胞能夠與抗PD-1單抗發(fā)生反應(yīng)。

本研究構(gòu)建的胰腺癌免疫雙人源化小鼠模型具備人源腫瘤細(xì)胞和人源免疫系統(tǒng),能夠較好地模擬胰腺癌患者體內(nèi)腫瘤組織與免疫系統(tǒng)之間的相互作用,可以作為臨床腫瘤患者的“替身”用于評估臨床前胰腺癌免疫療法的有效性及安全性,有望成為推動腫瘤免疫治療策略臨床前研究的理想工具。