人源化小鼠在呼吸道病原研究中的應(yīng)用與發(fā)展

程春雨,段翔,李顏

(模式動物與疾病研究教育部重點實驗室,蛋白質(zhì)與多肽藥物教育部工程研究中心,醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室,南京大學(xué)化學(xué)與生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院,醫(yī)學(xué)院模式動物研究所,南京 210061)

世界衛(wèi)生組織(WHO)的報告顯示,呼吸系統(tǒng)疾病是2019 年全球最主要的三大死亡原因之一,其中下呼吸道感染仍然是世界上最致命的傳染病,排在人類十大主要死亡原因的第四位[1]。合適的動物模型不僅能夠加速呼吸道病原致病機制的研究,更能為呼吸道病原的預(yù)防與治療方法提供評價工具。目前已用于呼吸道病原研究的實驗動物有很多,例如小鼠、大鼠、豚鼠、雪貂和非人靈長類動物等。小鼠因具有容易飼養(yǎng)且飼養(yǎng)成本低和繁殖快等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究。遺傳背景均一、實驗結(jié)果一致的近交系小鼠更是研究基因功能或疾病機制的首選。然而小鼠與人之間存在的物種差異,導(dǎo)致人鼠肺及免疫系統(tǒng)有所不同,從而使一些人源呼吸道病原無法直接感染小鼠,或者造成在小鼠與臨床顯著不同的病理與免疫特征。為了能更有效地研究和治療呼吸道病原感染,免疫系統(tǒng)人源化小鼠、肺人源化小鼠、肺/免疫系統(tǒng)雙人源化小鼠等模型在過去半個世紀(jì)逐漸發(fā)展和成熟。

1 免疫系統(tǒng)人源化小鼠

免疫系統(tǒng)人源化小鼠主要指將人的造血干細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi),然后在小鼠體內(nèi)發(fā)育出人免疫細(xì)胞譜系的小鼠模型。早在1980 年,研究人員就發(fā)現(xiàn)了重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID) 小鼠品系——CB17-Prkdcscid,該小鼠T 細(xì)胞和B 細(xì)胞均存在嚴(yán)重缺陷,胸腺和外周淋巴組織嚴(yán)重萎縮。而后在1988 年,McCune 等[2]在SCID 小鼠中植入人胎肝來源的造血干細(xì)胞和人體胸腺組織,構(gòu)建出了SCID 人源化小鼠。SCID 人源化小鼠雖然支持人類T、B 細(xì)胞分化,但存在“泄露”——即小鼠隨著年齡增長發(fā)育出自體T、B 細(xì)胞。后來,研究人員觀察到具有非肥胖糖尿病(non-obese diabetes,NOD)的NOD-SCID 小鼠具有更強的支持人類造血干細(xì)胞植入的能力,原因是NOD 品系中小鼠巨噬細(xì)胞的信號調(diào)控蛋白α(Sirpa)具有突變,削弱了小鼠巨噬細(xì)胞對人類細(xì)胞的吞噬作用[3-4]。但NOD-SCID 人源化小鼠仍保留部分小鼠NK 細(xì)胞,且也存在“泄露”的情況。此后研究人員一直在尋求人源化小鼠背景品系上的突破。2002 年,研究者發(fā)現(xiàn)突變白細(xì)胞介素2(IL-2)受體共同γ 鏈(IL2rg),可導(dǎo)致小鼠NK 細(xì)胞活性的喪失和T、B淋巴細(xì)胞譜系的消失。據(jù)此,研究人員構(gòu)建了NOD-SCIDIL2rgtm1sug(NOG)小鼠品系[5]。隨后,研究人員用完整的無效等位基因替代小鼠的IL2rg,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了BRG、NSG 等小鼠品系。以NOG、BRG 和NSG 為背景構(gòu)建的免疫系統(tǒng)人源化小鼠,表現(xiàn)出穩(wěn)定的人免疫細(xì)胞的定植與分化能力,過去十幾年在人源病原感染以及腫瘤免疫治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。

1.1 結(jié)核桿菌

結(jié)核病(tuberculosis,TB)仍然是嚴(yán)重威脅人類健康安全的全球性傳染病,然而唯一獲得許可的結(jié)核疫苗卡介苗(Bacille Calmette-Gué Rin,BCG)的保護(hù)效力因人群和地區(qū)不同而不同[6]。深入理解人體對結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,Mtb)的免疫應(yīng)答,將幫助開發(fā)更有效的TB 疫苗及治療方案。目前,響應(yīng)Mtb 感染的核心免疫過程在不同動物模型中未能得到一致的結(jié)論。而通過免疫系統(tǒng)人源化小鼠則可直接觀察人免疫系統(tǒng)對Mtb感染的響應(yīng),與臨床更為相關(guān)和接近。

2013 年,2 個課題組相繼報道了在免疫系統(tǒng)人源化小鼠鼻內(nèi)感染Mtb 可誘導(dǎo)肺肉芽腫形成[7-8]。該病理特征與在結(jié)核病患者體內(nèi)觀察到的現(xiàn)象非常相似,表現(xiàn)為人T 細(xì)胞環(huán)繞著人巨噬細(xì)胞形成的壞死中心,并被大量成纖維細(xì)胞包圍。同時,在沒有免疫系統(tǒng)人源化的小鼠中則觀察不到肺肉芽腫形成。值得一提的是,2013 年Heuts 等[7]發(fā)現(xiàn)CD4+T 細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的感染具有意想不到的作用。他們發(fā)現(xiàn)人源化小鼠器官中的分枝桿菌數(shù)量高于非人源化對照,并且細(xì)菌負(fù)荷的增加是由人CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)。這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了既往應(yīng)用其他動物模型進(jìn)行的Mtb 研究,體現(xiàn)出免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的不可替代性,即探索人免疫系統(tǒng)在病原感染中的物種特異性反應(yīng)。

免疫系統(tǒng)人源化小鼠也常被用來評價結(jié)核病疫苗,通過在免疫系統(tǒng)人源化NOG 小鼠上接種卡介苗或CpG-C(一種含有結(jié)核分枝桿菌抗原ESAT-6的脂質(zhì)體制劑),研究人員觀察到CD4+和CD8+T 細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子,例如 IFN-γ、TNF-α 和IL-2[9]。與C57BL/6 小鼠和Hartley 豚鼠相比,人源化小鼠模型提供了疫苗可以進(jìn)一步誘導(dǎo)人類T細(xì)胞免疫反應(yīng)的證據(jù)。此外關(guān)于結(jié)核病疫苗的開發(fā)方面,人源化小鼠也可以作為新型疫苗的評價平臺。此前一項研究中,研究人員從50 個預(yù)測多肽中篩選出6 個免疫優(yōu)勢肽,構(gòu)建了一種新的多肽疫苗,命名為MP3RT[10]。免疫系統(tǒng)人源化NSG 小鼠經(jīng)MP3RT 免疫后,IFN-γ 的分泌、CD3+IFN-γ+T 細(xì)胞和MP3RT 特異性IgG 抗體均顯著增加,證明MP3RT 是一種有潛力的多肽結(jié)核疫苗。

1.2 流感病毒

在流感研究方面,特定基因敲除小鼠模型和人源基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型被廣泛應(yīng)用于研究某一基因在流感病毒感染中的作用。而免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型則可以用來測試人免疫系統(tǒng)對疫苗及治療的響應(yīng)等[11]。

理想的疫苗能夠誘導(dǎo)長期免疫記憶,并產(chǎn)生高滴度、廣譜性的中和抗體。然而,由于甲型流感病毒包膜抗原HA 的序列變異,甲型流感病毒的多個亞型已經(jīng)進(jìn)化,使疫苗的開發(fā)變得困難。例如,H7N9 亞型流感疫苗對人類的免疫原性始終低于其他亞型的疫苗[12]。針對這一問題,Wada 等[13]修飾了H7 特異性T 細(xì)胞表位中的關(guān)鍵殘基,然后在以NOD-SCID/Jak3null(由于缺乏IL-2R 介導(dǎo)的Jak3 信號傳導(dǎo)從而導(dǎo)致NK 細(xì)胞發(fā)育受損)為基礎(chǔ)品系構(gòu)建的免疫系統(tǒng)人源化小鼠上進(jìn)行了測試,他們發(fā)現(xiàn)免疫后的人源化小鼠中IgG 結(jié)合HA 的能力和強度有所改善,證明H7N9 免疫原性弱是由于其特異性的T 細(xì)胞表位所導(dǎo)致的,同時體現(xiàn)了人源化小鼠模型可以模擬人免疫細(xì)胞對不同抗原表位的響應(yīng)能力,并且是探究不同流感病毒亞型的感染過程及免疫系統(tǒng)應(yīng)答的優(yōu)秀模型。此外,使用不同策略開發(fā)的疫苗,包括抗病毒DNA 疫苗,也可以在免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型中進(jìn)行測試。研究者根據(jù)人單核細(xì)胞上的FcγRI 可增強體內(nèi)抗原呈遞的原理,將編碼抗人FcγRI 單鏈可變抗體(scFv)的序列與編碼含有T、B 細(xì)胞表位的甲型流感病毒血凝素亞基間肽(hemagglutinin intersubunit peptide)的序列偶聯(lián),再將其構(gòu)建到真核表達(dá)載體系統(tǒng)pTriEx-3 Neo 中[14]。免疫系統(tǒng)人源化NOD-SCIDIL2rgnull小鼠注射該嵌合載體分子后,可以產(chǎn)生抗流感的IgG 和流感特異性的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞。

為了在人源化小鼠體內(nèi)能夠更好地模擬人體抗病毒反應(yīng),研究者通過基因工程手段進(jìn)一步改造免疫缺陷小鼠品系,用不同的HLA 單倍型取代小鼠MHC I 類和II 類分子,從而使人T 細(xì)胞在小鼠胸腺中能夠正確發(fā)育成熟。例如,2016 年Majji 等[15]開發(fā)了名為“DRAGA”的免疫缺陷小鼠品系,同時表達(dá)人II 類分子HLA-DR4 和I 類分子HLA-A2。而后研究發(fā)現(xiàn)針對H1N1 血凝素蛋白的人單克隆抗體能夠清除免疫系統(tǒng)人源化DRAGA 小鼠的流感病毒[16]。另一項研究展示了人源化DRAGA 小鼠可以支持H1N1 和H3N2 甲型流感病毒的感染,且被感染的人源化DRAGA 小鼠可以產(chǎn)生抗病毒中和抗體和駐肺的CD103+T 細(xì)胞[17]。這些結(jié)果表明,人源化DRAGA 小鼠甲型流感病毒感染模型可以產(chǎn)生與人類相似的肺部病理表現(xiàn)和抗病毒免疫反應(yīng)。

2 肺人源化小鼠

小鼠作為臨床前模式動物有著諸多的優(yōu)勢,但人鼠之間數(shù)百萬年的進(jìn)化隔離,物種差異造成一些人源呼吸道病原不能感染小鼠,例如新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)。新型冠狀病毒肺炎的爆發(fā),對全球公共衛(wèi)生及經(jīng)濟都造成了巨大損失,直至現(xiàn)在仍嚴(yán)重威脅著全世界人民的生命健康與安全。通過對小鼠進(jìn)行改造,例如基因人源化、人肺組織異位移植及人-鼠肺嵌合等方法,可以實現(xiàn)利用小鼠模型對人源呼吸道病原進(jìn)行研究。

2.1 基因人源化

為了克服物種特異性障礙,將人類受體蛋白通過轉(zhuǎn)基因或者腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式在小鼠中表達(dá),可使小鼠對人源呼吸道病原易感。轉(zhuǎn)基因動物是指將外源重組基因整合到宿主基因組且穩(wěn)定表達(dá),并可遺傳的一類動物。轉(zhuǎn)基因小鼠往往存在構(gòu)建時間久、繁育周期長等問題,但一旦構(gòu)建完成,可通過繁育大規(guī)模生產(chǎn)。而采用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方式構(gòu)建人源化小鼠的技術(shù)方法簡單,周期短(2～3 周),可在多種基因修飾背景鼠上進(jìn)行構(gòu)建,但轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因不能遺傳給后代,因此需要重復(fù)構(gòu)建。兩種基因人源化方法各有優(yōu)勢,適用于不同條件下的實驗設(shè)計。以冠狀病毒為例,根據(jù)其遺傳學(xué)差異和血清學(xué)特性可將冠狀病毒分為α、β、γ 和δ 四個屬,其中可感染人的主要是α 屬中的HCoV-229E 與HCoV-NL63,以及β 屬中的HCoV-OC43、HCoV-HKUl、嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)和SARS-CoV-2[18]。除HCoV-OC43 外[19],其余人冠狀病毒均不可以很好地感染普通小鼠。因此,為了更好地研究人冠狀病毒的致病機制以及開發(fā)相關(guān)疫苗和抗病毒藥物,研究者們開發(fā)了一系列基因人源化小鼠。

ACE2 是SARS-CoV 和SARS-CoV-2 的共同受體,同時也是研發(fā)新冠疫苗及治療藥物的重要靶點。2007 年,3 個課題組幾乎同時對hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了報道。這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型的主要差別在于應(yīng)用不同的啟動子以驅(qū)動人ACE2 在小鼠組織中特異表達(dá),包括上皮細(xì)胞Krt18 啟動子、小鼠內(nèi)源性ACE2 啟動子以及外源性的復(fù)合啟動子CAG(帶有CMV-IE 增強子的雞β-肌動蛋白啟動子)等[20-22]。2016 年,Menachery 等[23]利用肺纖毛上皮細(xì)胞啟動子HFH4 構(gòu)建了HFH4-hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠。所有這些轉(zhuǎn)基因小鼠都易感SARS-CoV,但是無論采取何種表達(dá)策略,在SARS-CoV 研究中,小鼠都死于病毒感染大腦,而大腦感染在臨床中極少觀察到。在新型冠狀病毒肺炎爆發(fā)后,這些在SARS感染小鼠模型構(gòu)建上積累的經(jīng)驗也很快被應(yīng)用于新冠病毒研究[24-26]。這些模型同樣支持SARSCoV-2 的感染,但由于它們在人ACE2 的表達(dá)上存在差異,最終的感染程度也不盡相同。其中,較高劑量的SARS-CoV-2 鼻內(nèi)接種會導(dǎo)致K18-hACE2 小鼠死亡,并對包括肺、肝和腎在內(nèi)的各種器官造成嚴(yán)重?fù)p害,而較低劑量感染則引起的損傷癥狀較輕[27],在大多數(shù)組織中表現(xiàn)為劑量依賴性效應(yīng),與臨床表型較為類似。因此,K18-hACE2 模型似乎是迄今為止報道的最敏感、最接近臨床表型的新冠小鼠模型。除hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠外,2020 年6 月,Sun等[28]將表達(dá)人ACE2 的腺病毒在鼠肺中轉(zhuǎn)導(dǎo),快速建立了首個新冠肺炎非轉(zhuǎn)基因小鼠模型。該小鼠在感染SARS-CoV-2 后,肺中可檢測到高滴度的新冠病毒,并出現(xiàn)相應(yīng)的肺炎癥狀和病理特征。

2012 年,MERS 爆發(fā)后,Zhao 等[29]率先應(yīng)用表達(dá)MERS-CoV 受體的人DPP4 腺病毒構(gòu)建了MERSCoV 易感小鼠,并且證明這些小鼠可用于評估MERS 疫苗和抗病毒療法。隨后Agrawal 等[30]于2015 年構(gòu)建了在CAG 啟動子控制下表達(dá)hDPP4 的轉(zhuǎn)基因小鼠,該小鼠感染MERS-CoV 幾天后出現(xiàn)了體重持續(xù)減輕和死亡。2017 年,研究人員又開發(fā)了另一種hDPP4 轉(zhuǎn)基因小鼠,并證明MERS-CoV 感染引起的致命性肺炎具有病毒載量依賴性[31]。目前,針對4 種低致病性人冠狀病毒(HCoV-229E、HCoVNL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUl)小鼠模型構(gòu)建方面的研究還相對比較少。2005 年,Lassnig 等[32]報道了針對229E 受體APN 人源化的轉(zhuǎn)基因小鼠,但是免疫健全的hAPN 轉(zhuǎn)基因小鼠卻對229E 不易感,而當(dāng)小鼠同時存在Stat1 缺陷時,可檢測到病毒在肺部和腸道的大量復(fù)制。提示對一些人源呼吸道病原來說,僅僅將感染受體人源化還不能夠完全支持病原在小鼠中感染。

2.2 組織異位移植

盡管可以通過基因人源化對小鼠進(jìn)行改造,使其適應(yīng)人源呼吸道病毒的感染,但人鼠的物種差異性可能會導(dǎo)致利用小鼠模型產(chǎn)生與臨床相矛盾的結(jié)果。因此,直接利用人體器官或組織研究病毒感染或許是更優(yōu)的選擇。

在過去的幾十年中,通過移植一種或多種人體組織或細(xì)胞到小鼠體內(nèi)的方法已被廣泛用于HIV、HBV、HCV 和其他重要病原體的研究。早在1994年,已有將8～12 周的人胎肺組織植入免疫缺陷SCID 小鼠的腎包囊或者皮下的報道,結(jié)果顯示異位移植的人胎肺組織可快速生長發(fā)育,并分化成與正常人肺相似的結(jié)構(gòu)[33]。2012 年,De Paepe 等[34]通過比較移植的部位(腎包膜下和皮下),證明腎包囊移植更有利于人胎肺組織微血管的重塑。同年,Maidji 等[35]同樣將胎肺組織移植入免疫缺陷SCID小鼠腎包膜下,并向其直接注射人巨胞病毒(HCMV)臨床分離株,發(fā)現(xiàn)HCMV 能感染人肺泡上皮和間充質(zhì)細(xì)胞,并在2 周內(nèi)有效地在肺移植物中復(fù)制,導(dǎo)致大量病變。水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)和HCMV 一樣,感染具有種屬限制。2017 年,Wang等[36]利用人肺腎包囊移植小鼠模型證實異位移植的人肺組織也可支持VZV 的感染。而2019 年Wahl等[37]報道了人肺皮下移植小鼠模型(LoM),結(jié)果顯示LoM 可支持例如MERS-CoV、RSV、HCMV 和寨卡病毒等人源病毒的感染和復(fù)制。以上結(jié)果表明,這種在免疫缺陷鼠上異位移植的人肺組織理論上可支持所有人源呼吸道病原的感染,或許可作為今后呼吸道病原感染的通用模式動物,包括SARS-CoV-2。Wahl 等[38]于2021 年將LoM 應(yīng)用于新冠研究,結(jié)果顯示SARS-CoV-2 在人肺移植物中主要感染人肺上皮細(xì)胞,如肺泡中的2 型肺泡細(xì)胞(hAEC2s)和氣道中的纖毛細(xì)胞,而EIDD-2801(一種目前處于II/III 期臨床試驗的口服廣譜抗病毒藥物)的治療和預(yù)防給藥能顯著抑制SARS-CoV-2 在肺移植物中的復(fù)制。同年,廈門大學(xué)的夏寧邵團(tuán)隊通過同樣的構(gòu)建策略,也證實了異位移植的人肺組織可支持SARS-CoV-2 的感染和復(fù)制[39]。

2.3 人-鼠肺嵌合

通過皮下或腎包囊異位移植的人胎肺組織雖然可以生長發(fā)育,形成人肺類似結(jié)構(gòu),但其不具備正常肺組織氣體交換的生理功能。因此,無法利用該小鼠模型研究呼吸道病原的傳播和流行動力學(xué)等。為了維持人肺細(xì)胞的生理功能,可在鼠肺原位嵌合人肺細(xì)胞,構(gòu)建人-鼠肺嵌合小鼠模型。構(gòu)建人-鼠肺嵌合與構(gòu)建肝嵌合小鼠的思路相類似,都需要先對鼠源細(xì)胞進(jìn)行破壞,從而為植入的人源細(xì)胞提供生長空間。然而,肝細(xì)胞的組成較為均一,可通過自身肝細(xì)胞基因缺陷或者轉(zhuǎn)入毒性基因等造成鼠源肝細(xì)胞損傷。而肺細(xì)胞組成復(fù)雜,難以利用基因工程方法同時損傷多種鼠肺細(xì)胞。因此,研究人員往往通過感染H1N1 流感病毒和給予萘[40]以及博來霉素[41]這兩種化學(xué)藥物來誘導(dǎo)小鼠肺損傷。其中萘誘導(dǎo)的損傷較為特異,基本只針對Club細(xì)胞,而博來霉素較為廣譜,可同時誘導(dǎo)氣道和肺泡細(xì)胞損傷。

通常情況下,可以通過靜脈注射或者氣管滴注的方式移植人肺細(xì)胞。目前,可用于移植的人肺細(xì)胞主要有人肺干細(xì)胞、人胎肺細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞(ESCs)或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)定向分化的肺樣細(xì)胞等。慢性阻塞性肺病(COPD)是一種以慢性支氣管炎和/或肺氣腫為特征的疾病,最終可發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭。Wang 等[42]通過移植表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子p63 和角蛋白-5(Krt5)的遠(yuǎn)端氣道干細(xì)胞(DASC)到COPD 小鼠中,證實移植人DASCs 可以減輕COPD 小鼠肺部炎癥和肺氣腫。而hAEC2s 同樣具有肺干細(xì)胞特性,Kathiriya 等[43]通過將hAEC2s 移植到博來霉素誘導(dǎo)損傷的NSG 小鼠肺部,10 d 后可在肺泡受損區(qū)域檢測到人細(xì)胞團(tuán)。ESCs 或iPSCs 具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性,可體外定向誘導(dǎo)分化至肺細(xì)胞譜系。Soh 等[44]通過干細(xì)胞標(biāo)記物CD166 進(jìn)一步富集hESCs 分化產(chǎn)生的肺上皮細(xì)胞(LEC),可以在LEC 移植后提高肺損傷NOD-SCID 小鼠的生存能力并改善其肺功能。胎肺細(xì)胞因其處于生長發(fā)育階段,因此也具備一定的干細(xì)胞潛能。2015 年,Rosen等[45]將20～22 周人胎肺單細(xì)胞懸液靜脈輸注到萘損傷和輻照的SCID 小鼠中,7 周后在鼠肺中檢測到3%左右的人肺嵌合。但目前應(yīng)用人-鼠肺嵌合模型來研究呼吸道病原感染的報道還比較少,一個可能的原因是人肺嵌合的比例還有待提升。

3 肺/免疫系統(tǒng)雙人源化小鼠

病原感染的預(yù)防和治療通常與先天性和適應(yīng)性免疫有關(guān),由于單純的肺人源化小鼠模型缺乏人的免疫細(xì)胞,限制了其在病原感染所引發(fā)的免疫反應(yīng)方面的研究。所以在肺人源化小鼠模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過移植人的免疫細(xì)胞,可以建立肺/免疫系統(tǒng)雙人源化小鼠模型。

近日,耶魯大學(xué)Flavell 團(tuán)隊利用腺病毒將人ACE2 轉(zhuǎn)導(dǎo)到人源化MISTRG6 小鼠的肺部,建立了MISTRG6-hACE2 小鼠模型[46]。研究人員應(yīng)用該模型描述了SARS-CoV-2 感染后長達(dá)28 d 的人先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng),表明被感染的小鼠具有新冠慢性感染的關(guān)鍵特征,包括體重減輕、病毒RNA 持續(xù)性存在、T 淋巴細(xì)胞減少等,同時還利用該模型評估了患者來源的抗體和類固醇治療對于控制新冠早期感染的重要作用。尼帕病毒(NiV)是一種人畜共患的副粘病毒,可引起人類致命的呼吸道疾病和腦炎。2014 年,伊拉斯姆斯大學(xué)Rockx 團(tuán)隊通過人肺皮下移植模型證實了NiV 病毒感染靶向人肺組織中的內(nèi)皮和上皮,并形成合胞體[47],但關(guān)于NiV 病毒誘導(dǎo)急性肺損傷(ALI)的分子機制仍不是非常清楚。在之后的一項研究中,該團(tuán)隊在人肺組織皮下移植的基礎(chǔ)上,結(jié)合了骨髓、肝和胸腺(BLT)免疫系統(tǒng)重建來研究NiV 病毒[48],結(jié)果顯示人體免疫系統(tǒng)的存在可干擾NiV 病毒傳播,感染區(qū)域浸潤的免疫細(xì)胞可產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子。2019 年,Wahl 等[37]利用同樣的雙人源化小鼠模型(BLT-L)感染HCMV,觀察到抗原特異性體液免疫應(yīng)答和T細(xì)胞免疫反應(yīng)。2021 年Wang 等[49]也利用類似的模型研究了H1N1 流感病毒在肺/免疫系統(tǒng)雙人源化小鼠中的感染,發(fā)現(xiàn)人肺移植物感染H1N1 后,組織駐留記憶T 細(xì)胞顯著增加,并產(chǎn)生病毒特異性T細(xì)胞和抗病毒IgM 及IgG。

4 展望

新冠爆發(fā)后,由于人鼠物種差異,原始毒株不能感染普通小鼠,因此基因人源化小鼠模型在新冠初期研究中發(fā)揮了不可替代的作用。而我國科學(xué)家與病毒也在爭分奪秒賽跑,為新冠小鼠模型的研發(fā)作出了巨大貢獻(xiàn),如中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所秦川研究員團(tuán)隊在全球率先報道了hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型[24],而廣州呼吸疾病國家重點實驗室趙金存教授團(tuán)隊則利用腺病毒載體(Ad5)成功建立了首個非轉(zhuǎn)基因新冠小鼠模型等[28]。我國起步較晚,近年來雖有一定發(fā)展,但仍需繼續(xù)努力,希望未來能吸引更多優(yōu)秀的中國科學(xué)家加入人源化小鼠研究。

人源化小鼠在呼吸道病原致病機制研究、藥物開發(fā)及疫苗評價等方面已有了諸多的應(yīng)用,但是仍存在許多不足,有許多地方需要改進(jìn)。例如,免疫系統(tǒng)人源化小鼠的人B 細(xì)胞發(fā)育和激活存在問題,導(dǎo)致產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)較弱,難以產(chǎn)生抗原特異性高親和力抗體。目前已有研究針對這一現(xiàn)狀進(jìn)行優(yōu)化,如構(gòu)建人BAFF 和IL-6 轉(zhuǎn)基因小鼠,為人B細(xì)胞的發(fā)育和激活提供必需的細(xì)胞因子等。而基因人源化小鼠雖然可以使人源特異性病原感染小鼠,但轉(zhuǎn)基因和腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式都存在基因非特異性表達(dá)不能完全還原人體生理表達(dá)水平的現(xiàn)象,因此未來仍需要更深入地研究如何更精準(zhǔn)地控制基因表達(dá)。皮下肺移植模型理論上可以感染所有人源呼吸道病原,結(jié)合免疫系統(tǒng)雙人源化還可以研究病原感染后的免疫反應(yīng)。但人肺移植物無法模擬人正常的氣體交換生理功能,即人肺細(xì)胞處于一種“功能不全”的狀態(tài)。而人-鼠肺嵌合模型內(nèi)的人肺細(xì)胞在鼠肺原位定植、發(fā)育,有希望參與到正常的氣體交換中。但相關(guān)研究還比較少,且研究中所展示的人肺嵌合比例還比較低,有待進(jìn)一步提高,可嘗試誘導(dǎo)更強的肺損傷,移植重建功能更強的人肺細(xì)胞等。期望未來還會有更適合、更完善的人源化小鼠模型被不斷地開發(fā)出來,應(yīng)用于更多種類呼吸道病原的研究。