代謝組解析商品成熟與生理成熟芒果內(nèi)在品質(zhì)和類胡蘿卜素合成差異

高文科 李明海 趙興東 吳興恩 彭 磊 王梓然*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，昆明 650201;2.云南省玉溪市元江縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 玉溪 653300)

芒果(MangiferaindicaL.)是漆樹科杧果屬的一種熱帶亞熱帶常綠大喬木，是著名的熱帶亞熱帶水果[1]。芒果被譽(yù)為“熱帶水果之王”，因其具有顏色豐富、果形多樣等較好的外觀品質(zhì)以及肉質(zhì)細(xì)嫩、香氣濃郁和營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)良的內(nèi)在品質(zhì)而備受國內(nèi)外消費(fèi)者喜歡。近年來，隨著芒果栽培面積的不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量逐年上升，已經(jīng)成為世界五大水果之一[1]。芒果果實(shí)中含有多種有益于身體健康的生物活性成分，如糖分、能量和豐富的膳食纖維，同時(shí)芒果也是人體獲取礦物質(zhì)、維生素A、維生素C、類胡蘿卜素和多酚較好的來源[2]。芒果果實(shí)色澤多樣，主要有紅皮黃肉型、綠皮黃肉型和黃皮黃肉型等。果實(shí)色澤是評(píng)價(jià)果實(shí)鮮食品質(zhì)和商品價(jià)值的重要指標(biāo)，也是影響種植者和消費(fèi)者選擇的最重要的因素之一[3-4]。

近幾年，次生代謝物質(zhì)的重要性及其對(duì)水果口感的貢獻(xiàn)受到眾多研究者的關(guān)注，但大部分代謝物功能和代謝途徑還未明確，缺乏對(duì)整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)和某類代謝物系統(tǒng)全面的研究[5]。次生代謝物質(zhì)的檢測隨著代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展而不斷完善和豐富，代謝組學(xué)也是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后為分析檢測復(fù)雜多變生物代謝網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)手段。隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，一些果實(shí)次生代謝物質(zhì)如花青素、類黃酮、類胡蘿卜素和揮發(fā)性代謝物等代謝組檢測也在眾多園藝產(chǎn)品上得到廣泛應(yīng)用，包括百香果[6]、枇杷[7]、木瓜[8]和黃桃[9]等。類胡蘿卜素代謝組學(xué)以類胡蘿卜素的生物合成途徑為基礎(chǔ)，以異戊烯焦磷酸為前體，經(jīng)過異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶(Isoprene pyrophosphate isomerase, IPI)、牻兒苗屬二磷酸酯合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPS)、植物烯合成酶(Phytoene synthase, PSY)、植物烯不飽和酶(Phytoene desaturase, PDS)、胡蘿卜素不飽和酶(Zeta-carotene desaturase, ZDS)和番茄紅素-β-環(huán)酶(Lycopene-β-cyclase, LycB)等酶催化，產(chǎn)生各類類胡蘿卜素，如α、β、γ和δ等類型[10]。在植物中，β-胡蘿卜素作為類胡蘿卜素生物合成途徑中重要的合成產(chǎn)物，占總胡蘿卜素含量的60%～70%[11]，使水果呈現(xiàn)出特有的黃色和橙色[12]。利用類胡蘿卜代謝組學(xué)研究表明，隨著柑橘果實(shí)著色類胡蘿卜素代謝物質(zhì)如八氫番茄紅素、β-隱黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)逐漸積累，并且在柑橘果皮中也發(fā)現(xiàn)了很大比例的類胡蘿卜素物質(zhì)[13]。在不同果肉顏色的柑橘品種中，β-蝶形黃質(zhì)和β-蝦青素是果肉呈現(xiàn)黃色的主要類胡蘿卜素物質(zhì)[14]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在橙色果肉的杏中主要類胡蘿卜素物質(zhì)為β-胡蘿卜素和(E/Z)-卟啉，其次是β-蝶形黃質(zhì)和葉黃素[15]。而類胡蘿卜素物質(zhì)積累量的差異也是導(dǎo)致枇杷果實(shí)顏色呈現(xiàn)黃色和白色的主要原因[16]。Ma等[17]利用HPLC技術(shù)在‘臺(tái)農(nóng)一號(hào)’芒果黃色果肉中發(fā)現(xiàn)主要的類胡蘿卜素是β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素，其次為β-蝶形黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)。類胡蘿卜素作為一些與果實(shí)風(fēng)味有關(guān)的化合物的前體，不但影響果實(shí)的品質(zhì)，同時(shí)也是判斷果品成熟與采收的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。

果品的適時(shí)采收是果樹上最常用的栽培管理措施，廣泛應(yīng)用于香蕉、獼猴桃、南果梨和芒果等果樹。當(dāng)果實(shí)達(dá)到商品成熟時(shí)期采收，在一定程度上可以改善果品過度成熟造成的易腐爛、病害增多和外觀品質(zhì)下降等不利因素。除了易于儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和延長果品貨架期之外，商品成熟時(shí)期采收還可以顯著提升果實(shí)的外觀品質(zhì)[18]。果實(shí)在商品成熟時(shí)期含有大量的淀粉、有機(jī)酸和單寧物質(zhì)，果皮中含有較多的葉綠素，當(dāng)果實(shí)進(jìn)入生理成熟時(shí)期，果實(shí)中次生代謝物質(zhì)發(fā)生了大量變化，通過分析碳水化合物、有機(jī)酸、果膠、單寧及色素成分的改變可以判斷果實(shí)的品質(zhì)高低[19]。芒果是典型的“后熟”水果，在芒果貯藏和成熟的過程中，次生代謝物質(zhì)可以從與糖苷結(jié)合的化合物中釋放出來[20]。之前對(duì)于芒果的研究主要集中于果皮色澤含量以及果實(shí)可溶性固形物、總糖和總酸等基本代謝產(chǎn)物的鑒定，缺乏關(guān)于從商品成熟到生理成熟時(shí)期果實(shí)內(nèi)部次生代謝物質(zhì)系統(tǒng)變化規(guī)律以及果實(shí)中類胡蘿卜素等次生代謝物質(zhì)的靶向代謝組學(xué)的研究。

本研究以‘金鳳凰’芒果為試材,為更好地了解芒果果實(shí)“后熟”過程中果實(shí)色澤和內(nèi)在品質(zhì)相關(guān)次生代謝物質(zhì)的變化，本研究利用廣泛靶向代謝組學(xué)和靶向類胡蘿卜素代謝組學(xué)對(duì)商品成熟和生理成熟期芒果果實(shí)進(jìn)行了分析，通過代謝組學(xué)鑒定了芒果商品成熟和生理成熟期品質(zhì)相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物包括碳水化合物、有機(jī)酸、氨基酸和類胡蘿卜素等次生代謝產(chǎn)物的變化，旨在為深入研究芒果果實(shí)著色和品質(zhì)形成的代謝調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，為優(yōu)質(zhì)芒果果品的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料和收集方法

早中熟芒果(MangiferaindicaL.)品種‘金鳳凰’種植于云南省玉溪市元江哈尼族彝族傣族自治縣(101°39′～102°22′ N, 23°18′～23°55′ W)，樹齡10年，露地栽培，株行距為3 m×5 m。在芒果花后100 d左右進(jìn)行樣品采收，記為商品成熟期(Commodity maturity， CM)；在室溫條件下，商品成熟期芒果果實(shí)貯藏后熟達(dá)到生理成熟，記為生理成熟期(Physiological maturity， PM)。從果園選取5株生長狀態(tài)相近的樹隨機(jī)采集芒果果實(shí)，每30個(gè)果實(shí)為1個(gè)樣本，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)生物重復(fù)。將收集的芒果果實(shí)用刀片切分為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小、約15 g重的果粒，放入液氮速凍后置于-80 ℃的超低溫冰箱保存，為進(jìn)一步的廣靶代謝組和類胡蘿卜素代謝組檢測提供樣品。

1.2 樣品制備和代謝物提取

將芒果果實(shí)樣品在液氮冷凍后粉碎研磨均勻，用帶鋯珠的冷凍混合球磨機(jī)(MM 400，Retsch，德國)在30 Hz下粉碎1.5 min。稱取冷凍干燥粉末狀的樣品(100 mg)，在4 ℃下用1.2 mL 70%的甲醇水溶液提取過夜，12 000 r/min離心10 min，吸收提取物(CNWBOND碳-GCB SPE盒，250 mg，3 mL；ANPEL，中國上海)并過濾(SCAA-104，0.22 μm孔徑；ANPEL)。芒果果實(shí)樣品提取物采用LC-ESI-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。分析條件如下：HPLC柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm 100 mm)；溶劑體系為A相超純水(0.1%甲酸)和B相乙腈(0.1%甲酸)；洗脫梯度程序：0 min時(shí)V(A)∶V(B)=95∶5，11.0 min時(shí)V(A)∶V(B)=5∶95，12.0 min時(shí)V(A)∶V(B)=5∶95，12.1 min時(shí)V(A)∶V(B)=95∶5，15.0 min時(shí)V(A)∶V(B)=95∶5；流速：0.35 mL/min；溫度：40 ℃；進(jìn)樣量：4 μL。出液交替連接到ESI-三重四極線離子阱(Q-TRAP)-MS采集分子粒子碎片離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)[21]。

1.3 代謝物的鑒定與量化

LIT和三重四極桿(QQQ)掃描在QQQ-線型離子阱質(zhì)譜儀(Q TRAP)、API 6500 Q TRAP LC/MS/MS 系統(tǒng)上采集，該系統(tǒng)配備ESI Turbo I-Spray 接口，以正離子模式工作，由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制。ESI源操作參數(shù)如下：離子源，turbo噴霧；源溫，550 ℃；離子噴霧電壓(IS)5 500 V；離子源氣體I(GSI)、氣體II(GSII)、幕氣(CUR)分別設(shè)置為55、60和25 psi；碰撞氣體(CAD)為高。在QQQ和LIT模式下分別用10和100 μmol/L聚丙烯乙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描作為MRM實(shí)驗(yàn)采集，碰撞氣體(氮?dú)?設(shè)置為5 psi。Declustering電位(DP)和碰撞能量(CE)的單個(gè)MRM過渡與進(jìn)一步DP和CE優(yōu)化。根據(jù)每個(gè)時(shí)期內(nèi)洗脫的代謝物，監(jiān)測1組特定的MRM轉(zhuǎn)換。代謝物數(shù)據(jù)分析采用Analyst 1.6.1軟件(AB SCIEX，加拿大)進(jìn)行，代謝物的定量采用MRM進(jìn)行，對(duì)確定的代謝物進(jìn)行部分最小二乘判別分析(PLS-DA)，含量差異顯著的代謝物設(shè)定閾值為投影中可變重要性(VIP)≥1，Log2FC≥2或≤0.5[21]。

1.4 類胡蘿卜素代謝物的檢測

將冷凍芒果果實(shí)樣品在液氮中粉碎研磨均勻并用帶鋯珠的冷凍混合球磨機(jī)(MM 400，Retsch，德國)在30 Hz下粉碎1.0 min；稱取粉末狀的樣品(50 mg)，加入內(nèi)標(biāo)，并用含0.01% BHT的混合溶液(V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1∶2)提取。將提取液在室溫下渦流20 min，重復(fù)提取1次后離心合并上清液。將得到的提取液濃縮之后用V(甲醇)∶V(甲基叔丁基醚)=3∶1的混合溶液復(fù)溶，溶液經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后，進(jìn)一步進(jìn)行LC-MS 分析。樣品提取液采用LC-APCI-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。分析條件如下：HPLC：色譜柱，YMC C30(3 μm，100 mm×2.0 mm i.d.)；溶劑體系：V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶3，加0.01% BHT和0.1%甲酸(A)，甲基叔丁基醚加0.01% BHT(B)；梯度程序，從0% B(0～3 min)開始，增加到70% B(3～5 min)，然后增加到95% B(5～9 min)，最后回升到0% B(11～12 min)；流速：0.8 mL/min；溫度：28 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。API 6500+Q TRAP LC/MS/MS 系統(tǒng)，配備APCI Turbo Ion-Spray接口，工作模式為正離子，由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制。APCI源操作參數(shù)如下：離子源，APCI+；源溫350 ℃；簾氣(CUR)設(shè)置在25 psi。對(duì)單個(gè)MRM過渡的DP和CE進(jìn)行了進(jìn)一步的DP和CE優(yōu)化。根據(jù)每個(gè)時(shí)期洗脫的類胡蘿卜素，對(duì)每個(gè)時(shí)期的一組特定的MRM過渡進(jìn)行監(jiān)測[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果成熟階段的代謝差異及風(fēng)味物質(zhì)的積累

代謝組試驗(yàn)材料芒果商品成熟期果實(shí)樣品(CM)和生理成熟期果實(shí)樣品(PM)見圖1(a)。對(duì)2個(gè)芒果果實(shí)樣品代謝產(chǎn)物的氣相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析(1(b))，結(jié)果表明2個(gè)樣品在3次生物學(xué)重復(fù)中的代謝物組成明顯分離，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)在CM和PM樣本之間明顯分離，主成分分析很容易區(qū)分CM和PM，PC1和PC2分別占了總方差的58.45%和18.37%。代謝組分析結(jié)果表明在CM 和 PM中共發(fā)現(xiàn)有309種差異代謝產(chǎn)物，其中上調(diào)95個(gè)，下調(diào)214個(gè)(圖1(c))?？傮w而言，商品成熟的芒果果實(shí)相比生理成熟的果實(shí)，大多數(shù)代謝產(chǎn)物呈下調(diào)表達(dá)趨勢。隨著芒果果實(shí)“后熟”一系列碳水化合物成分的逐漸變化，最終導(dǎo)致果實(shí)甜度和酸度等內(nèi)在品質(zhì)性狀的改變。不同代謝物的含量和類型可能在確定芒果口感中起著至關(guān)重要的作用。商品成熟期的果實(shí)雖然獲得優(yōu)良的儲(chǔ)運(yùn)性和商品性，但果肉的次生代謝物質(zhì)，如糖、有機(jī)酸和酯的積累方面表現(xiàn)出差異，生理成熟期果肉中次級(jí)代謝產(chǎn)物呈增加趨勢(圖1(d))，除了糖類和類胡蘿卜素物質(zhì)大量積累，還包括有機(jī)酸、酯類、萜類和醇類物質(zhì)。

(a) 商品成熟和生理成熟期芒果果實(shí)外觀圖；(b) PCA分析；(c) 差異顯著代謝物火山圖；(d) 代謝產(chǎn)物熱圖。(a) Appearance of mango fruits at commercial maturity (CM) and physiological maturity (PM); (b) PCA analysis; (c) Volcano plot of diffrentially significant metabolites; (d) Heat map of metabolites.圖1 芒果果實(shí)材料與代謝組差異分析Fig.1 Mango fruit material and difference analysis with metabolome

2.2 差異代謝物的KEGG分類和富集分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋，將這309種代謝物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中，結(jié)果顯示主要富集為20個(gè)代謝途徑(圖2)。隨后，以P值<0.05進(jìn)行KEGG路徑差異富集分析，篩選出7個(gè)不同的顯著差異代謝途徑，主要有：代謝途徑、檸檬酸鹽循環(huán)(TCA循環(huán))、次生代謝物的生物合成、光合作用生物體的碳固定、乙醛酸和二羧酸代謝、2-氧代羧酸代謝和氨基酸的生物合成。KEGG結(jié)果表明，大部分的代謝物富集到“代謝途徑(Metabolic pathways)”，符合預(yù)期。因?yàn)楣麑?shí)在生理成熟時(shí)果實(shí)次級(jí)代謝產(chǎn)物大量合成，糖酸含量和類胡蘿卜素含量不斷升高使得果實(shí)呈現(xiàn)出更佳的口感。此外，部分代謝物被歸入“氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)”，這表明芒果果實(shí)可能具有潛在有益健康的效果。KEGG富集分析確定了這2個(gè)不同時(shí)期果實(shí)代謝物的差異變化，也為更深入研究果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)形成的分子代謝機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

圖2 芒果果實(shí)代謝組數(shù)據(jù)的KEGG分類與富集分析Fig.2 KEGG classification and enrichment analysis for mango fruits metabolome

2.3 氨基酸和有機(jī)酸代謝

內(nèi)在品質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)的呈現(xiàn)主要為有機(jī)酸、氨基酸和糖類等。將VIP(Variable importance in projection)≥1、|log2FC|≥5作為顯著差異的閾值，從PM 和CM樣品中共鑒定出22種明顯差異表達(dá)的內(nèi)在品質(zhì)相關(guān)代謝物，包括6種氨基酸及其衍生物，10種有機(jī)酸及其衍生物以及4種糖類和2種維生素(表1)。在CM和PM中篩選出的6種氨基酸和衍生物中有2種為上調(diào)表達(dá)，4種為下調(diào)表達(dá)。在顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物中己酰-L-甘氨酸、O-磷酸-L-絲氨酸、γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酸和谷胱甘肽還原型均達(dá)到10倍顯著差異水平。共有10種差異代謝物被鑒定為有機(jī)酸，其中2-羥基-2-甲基丁酸、羥基丙二酸半醛、4,5,6-三羥基-2-氧己酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-羥基己酸、丙二酸和DL-甘油醛-3-磷酸分別下調(diào)10.13、11.58、12.67、14.58、14.73、15.32和15.92倍。篩選出的糖及醇類物質(zhì)有4種，其中1個(gè)上調(diào)表達(dá)，3個(gè)下調(diào)表達(dá)。以上代謝產(chǎn)物的顯著差異水平，解釋了生理成熟期芒果比商品成熟期芒果的口感和風(fēng)味更加豐富的原因。

表1 “金鳳凰”芒果商品成熟和生理成熟期果肉顯著差異的次生代謝物質(zhì)Table 1 Differentially accumulated flavor compounds (VIP≥1 and |Log2FC|≥5) between commoditymaturity and physiological maturity stages in the cv.‘Jin fenghuang’mango

2.4 類胡蘿卜素代謝組分析

類胡蘿卜素在植物光合作用和脂質(zhì)過氧化過程中起著重要作用，并影響植物果實(shí)的顏色性狀。為了更加清楚的了解芒果果肉著色代謝機(jī)理，本試驗(yàn)分析了芒果CM和PM的果肉類胡蘿卜素合成代謝途徑中代謝產(chǎn)物表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化，在類胡蘿卜素生物合成途徑中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)顯著差異代謝物，其中α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量在CM中分別顯著降低3.40和3.31倍，依據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，如ZDS、LYCB和LCYC等結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量均在PM期迅速升高，這可能導(dǎo)致了類胡蘿卜素生物合成途徑中相關(guān)代謝產(chǎn)物的差異表達(dá)(圖3(a))。其次，商品成熟期的芒果果肉呈現(xiàn)淡黃色，而在生理成熟的過程中呈現(xiàn)橘黃色，α-胡蘿卜素和 β-胡蘿卜素含量的差異是導(dǎo)致果肉呈現(xiàn)不同顏色的原因。類胡蘿卜素代謝組聚類熱圖分析結(jié)果表明，在CM 和PM鑒定到的36個(gè)類胡蘿卜素物質(zhì)中共有15個(gè)代謝產(chǎn)物達(dá)到顯著差異水平，其中1個(gè)代謝物呈增加趨勢，14個(gè)代謝物呈現(xiàn)降低趨勢(圖3(b))。這一結(jié)果可為其他果實(shí)呈色機(jī)理研究提供新思路，為探索芒果果實(shí)中β-胡蘿卜素含量的調(diào)控措施和培育富含β-胡蘿卜素的芒果新品種奠定基礎(chǔ)。

(a)類胡蘿卜素生物合成代謝途徑；(b)差異代謝產(chǎn)物熱圖。(a) Carotenoid biosynthesis metabolic pathway; (b) Heat map of differential metabolites.圖3 商品成熟和生理成熟芒果果實(shí)類胡蘿卜生物合成途徑差異代謝產(chǎn)物Fig.3 Differential metabolites of carotenoid biosynthetic pathways in commodity maturities and physiological maturity mango

3 討論與結(jié)論

3.1 糖和有機(jī)酸次生代謝網(wǎng)絡(luò)變化豐富了芒果果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的構(gòu)成

利用LC-MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行廣泛靶向代謝組分析，已成功地用于大規(guī)模代謝物分析和一些重要植物的比較代謝組學(xué)[13-21]。以往研究芒果代謝物的重點(diǎn)是特定類別的代謝物，如果實(shí)糖類(果糖、葡萄糖和蔗糖)、有機(jī)酸和氨基酸以及葉和花中的酚類物質(zhì)[22]，然而關(guān)于芒果栽培品種在商品成熟期和生理成熟期的次生代謝特性還缺乏系統(tǒng)研究。本研究利用基于LC-MS/MS的廣泛靶向代謝組學(xué)和類胡蘿卜素代謝組學(xué)了解了‘金鳳凰’芒果2個(gè)時(shí)期的內(nèi)在品質(zhì)代謝產(chǎn)物變化；通過代謝組，共鑒定了603種代謝物，其中309種代謝物以差異表達(dá)的方式積累在生理成熟之后的果肉組織中；分析確定了芒果果肉中的大量碳水化合物，包括20種糖類，其中有14種糖類在商品成熟期的果肉中濃度顯著較低，例如D-Glucoronic acid、D-Fructose-1,6-biphosphate、D-Ribose、Mannitol和Dulcitol這5類，可能是構(gòu)成芒果果實(shí)風(fēng)味滋味物質(zhì)的主要糖類；而差異表達(dá)的有機(jī)酸共鑒定到50種，其中有34種物質(zhì)在商品成熟期的果實(shí)中濃度明顯低于生理成熟果實(shí)，這可以在一定程度上揭示果實(shí)在商品成熟期風(fēng)味不足的原因。芒果商品成熟期果實(shí)經(jīng)過室溫貯藏“后熟”之后，果實(shí)內(nèi)糖酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物不斷積累，氨基酸物質(zhì)的含量逐漸提高，對(duì)生理成熟期果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的提升起到了關(guān)鍵作用[23]。

3.2 類黃酮次生代謝物質(zhì)的增加可提高芒果果實(shí)抗病性

通過商品成熟和生理成熟期芒果代謝組的分析，發(fā)現(xiàn)了在苯丙烷生物合成途徑中的代謝產(chǎn)物如酚類物質(zhì)、木質(zhì)素、類黃酮和黃酮醇等代謝物的變化和積累。類黃酮物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的抗菌物質(zhì)，具有抗氧化活性，也可抵御入侵病原物，提升果實(shí)抗病性[24]。研究表明，在CM和PM中，異黃酮(芒柄花素-7-O-(6″-丙二酰)葡萄糖苷 Formononetin-7-O-(6″-Malonyl)glucoside)、黃酮醇(山奈酚-7-O-葡萄糖醛酸苷 Kaempferol-7-O-glucuronide)、木質(zhì)素(落葉松脂素-4′-O-葡萄糖苷 Lariciresinol-4′-O-glucoside)以及香豆素(秦皮素 Fraxetin)等次生代謝產(chǎn)物分別增加3.12、8.56、12.74和14.41倍，同時(shí)隨著芒果果實(shí)生理成熟，13種黃酮、木質(zhì)素和香豆素代謝產(chǎn)物顯著增加，研究表明這些異黃酮類和黃酮類物質(zhì)可以增強(qiáng)對(duì)病原體的防御[25]。此外，苯丙烷途徑的產(chǎn)物可以與有益微生物相互作用共同抵御病原菌的侵害從而提升果實(shí)的抗病性[26]。

3.3 芒果果實(shí)類胡蘿卜素合成調(diào)控

由類胡蘿卜素、葉綠素和類黃酮構(gòu)成的果皮顏色是果實(shí)品質(zhì)優(yōu)劣的另一個(gè)決定性因素。代謝組研究發(fā)現(xiàn)，果皮中類胡蘿卜素和類黃酮的含量明顯不同[27]。已知的類胡蘿卜素有600多種，是植物的許多器官，如花、果實(shí)、根和葉的主要色素，對(duì)植物的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值起著重要作用[28]。在‘金鳳凰’芒果成熟過程中，果皮葉綠素幾乎完全喪失，而類胡蘿卜素的含量則有所增加。研究表明，β-胡蘿卜素的生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受多種轉(zhuǎn)錄因子(TFs)調(diào)控，根據(jù)TFs所含保守結(jié)構(gòu)域的不同，大致分為 MYB(V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)、bHLH(Basic helix-loop-helix)、MADS box、NAC和bZIP(Basic leucine zipper)幾個(gè)家族[29]。其中，柑橘CrMYB68可以直接負(fù)向調(diào)節(jié)CrBCH2和CrNCED5從而導(dǎo)致類胡蘿卜素的積累；番茄SlMYB72直接與PSY、ZDS和LycB酶基因結(jié)合，調(diào)節(jié)類胡蘿卜素的生物合成[30]；CpbHLH1和CpbHLH2單獨(dú)調(diào)控木瓜果實(shí)成熟過程中番茄紅素β-環(huán)化酶基因(CpCYC-B和CpLCY-B)的轉(zhuǎn)錄[31]。芒果的后熟階段對(duì)類胡蘿卜素的生物合成很重要，雖然本研究中揭示了類胡蘿卜素合成代謝差異，但未從分子生物學(xué)角度進(jìn)行深入解析，對(duì)于類胡蘿卜素的合成調(diào)控機(jī)理也尚待解決。因此，在未來的研究中將對(duì)參與類胡蘿卜素生物合成調(diào)控基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，特別是與β-胡蘿卜素合成有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因以及MYB、bHLH和NAC等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本研究利用廣泛靶向代謝組學(xué)和類胡蘿卜素代謝組學(xué)，共檢測到了309種差異代謝產(chǎn)物和68種類胡蘿卜素代謝物質(zhì)，全面解析了商品成熟期和生理成熟期芒果果實(shí)色澤品質(zhì)和內(nèi)在品質(zhì)形成的代謝機(jī)理，為深入研究芒果果實(shí)著色和內(nèi)在品質(zhì)形成的代謝調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù), 進(jìn)一步為優(yōu)質(zhì)芒果果品的生產(chǎn)提供參考。