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    不同蛋白水平日糧對(duì)荷斯坦公犢牛糖異生的影響

    2022-05-26 02:53:10楊天宇馬曉宇貢笑笑趙國琦
    關(guān)鍵詞:糖異生全價(jià)反芻動(dòng)物

    楊天宇 馬曉宇 貢笑笑 彭 程 黃 杰 趙國琦,2,3 詹 康*

    (1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;2.揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院,江蘇 揚(yáng)州 225009;3.揚(yáng)州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州 225009)

    犢牛時(shí)期是奶牛飼養(yǎng)過程中重要環(huán)節(jié),犢牛生長性能受飼料成分和飼喂方式等多種因素的影響[1]。提供合理的日糧不僅可以提高飼糧的利用率,還可提高其成年后的總體發(fā)育水平。因此,犢牛培育是提高牛群品質(zhì)和創(chuàng)建高產(chǎn)奶牛群的關(guān)鍵。以前奶牛營養(yǎng)研究關(guān)注點(diǎn)主要在泌乳奶牛,而近些年來,更多的研究集中在幼齡反芻動(dòng)物營養(yǎng)方面[2]。

    葡萄糖作為體內(nèi)重要的營養(yǎng)單糖,是動(dòng)物體內(nèi)唯一可以通過血漿和細(xì)胞循環(huán)于全身的碳水化合物,參與多種細(xì)胞功能[3]。在反芻動(dòng)物中,循環(huán)葡萄糖的90%~100%均來自糖異生。此外,調(diào)節(jié)反芻動(dòng)物糖異生是改善動(dòng)物健康、生長與生產(chǎn)性能的有效手段[3]。糖異生在犢牛生長發(fā)育發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。犢牛出生后經(jīng)歷的一個(gè)關(guān)鍵適應(yīng)過程是:從子宮中葡萄糖、乳酸、氨基酸和脂肪酸獲取能量,轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕾囉谌樘?、蛋白質(zhì)和脂肪通過消化轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟恰被岷椭舅岖@取能量[5-6]。Elwyn等[7]研究表明,在消化蛋白的過程中,肝臟通過門靜脈吸收多余氨基酸為糖異生儲(chǔ)備糖原。與單胃動(dòng)物不同,反芻動(dòng)物從腸道中吸收的葡萄糖很少,都不同程度地依賴氨基酸作為糖異生底物產(chǎn)生葡萄糖。處于生長階段的反芻動(dòng)物需要大量的氨基酸通過糖異生途徑合成葡萄糖[8]。此外,參與糖異生途徑的關(guān)鍵限速酶包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)、丙酮酸羧化酶(PC)、果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)。提高肝糖異生與PCK和PC的表達(dá)增加有關(guān)[9-10]。此外,PC負(fù)責(zé)將線粒體中的丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸,其啟動(dòng)子是通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC1A)的活化而被轉(zhuǎn)錄激活[11];PGC1A可以調(diào)節(jié)關(guān)鍵的線粒體基因,這些基因有助于促進(jìn)糖異生途徑[12]。而FBP1酶催化果糖1,6-二磷酸轉(zhuǎn)化為果糖6-磷酸。Wang等[13]研究表明,F(xiàn)BP1酶活性的降低會(huì)導(dǎo)致葡萄糖產(chǎn)量的下降。葡萄糖異生的最后一步,即G6PC酶催化葡萄糖6-磷酸,是葡萄糖從肝細(xì)胞釋放的必要步驟[14]。

    日糧中蛋白質(zhì)是犢牛獲取氨基酸最重要的途徑。蛋白質(zhì)是影響犢牛生長性能的重要因素。飼糧中蛋白質(zhì)水平對(duì)反芻動(dòng)物的生長性能、氮代謝、瘤胃發(fā)育有著促進(jìn)作用[15]。前人研究表明日糧中蛋白水平在18%~21%可提高反芻動(dòng)物的生長性能、采食量和蛋白利用率[16-17]。液體和固體是犢牛飼料兩種形態(tài)。顆粒料既提供了均衡的營養(yǎng)成分,又可以直接進(jìn)入瘤胃,促進(jìn)瘤胃的發(fā)育[18],同時(shí)也為成年時(shí)期提供了良好營養(yǎng)物質(zhì)代謝的前提[19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)21.02%的蛋白水平更有利于5月齡公犢牛的生長發(fā)育[20]。

    之前的研究均集中在不同蛋白水平對(duì)荷斯坦公犢牛生長性能的影響,而不同蛋白水平全價(jià)顆粒料能否對(duì)荷斯坦公犢牛糖異生途徑產(chǎn)生影響?因此,本研究旨在探究不同蛋白水平全價(jià)顆粒日料對(duì)5~6月齡荷斯坦公犢牛糖異生影響,以為進(jìn)一步探究高蛋白水平全價(jià)顆粒料對(duì)犢牛糖異生途徑的影響提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    試驗(yàn)于2017年4月—2017年6月在揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)牧場進(jìn)行,選擇月平均月齡為5月齡,體重(172.80±7.16) kg 10頭荷斯坦公犢牛(隨機(jī)分為2組,每組5頭。試驗(yàn)每組分別添加蛋白含量為15.05% 和21.02%的犢牛全價(jià)顆粒料,15.05%的犢牛全價(jià)顆粒料記為LP及21.02%的犢牛全價(jià)顆粒料記為HP組,自由飲水。按試驗(yàn)牛體重的3%進(jìn)行飼喂。通過每周更改一次顆粒料的飼喂量,確保LP與HP組犢牛的干物質(zhì)飼喂量基本一致。試驗(yàn)分為預(yù)試期和正試期,預(yù)試期7 d,正試期56 d。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,將所有供試牛,在禁食(自由飲水)24 h后進(jìn)行屠宰,收集3 g肝臟到2 mL離心管,迅速放入液氮中,回到實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱凍存。

    試驗(yàn)期間,日糧采用全價(jià)顆粒料,自由采食,營養(yǎng)需要參照NRC(2001)。全價(jià)顆粒營養(yǎng)成分見表1。

    表1 全價(jià)顆粒料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient level of whole grain (DM basis)

    1.2 樣本采集

    在正試期第56 天,于晨飼5 h后,在犢牛頸部頸靜脈使用真空采血管進(jìn)行采血,采血量約為20 mL,在真空采血管中(無抗凝劑)轉(zhuǎn)入5 mL血樣,靜置30 min,3 500 r/min 15 min離心,制備的血清樣品于-80 ℃冰箱中保存。

    試驗(yàn)結(jié)束后,共10頭試驗(yàn)公犢牛,在禁食(自由飲水)24 h后進(jìn)行屠宰,收集3 g肝臟,迅速放入液氮中,回到實(shí)驗(yàn)室放入-80 ℃冰箱凍存。

    1.3 肝臟和血清中葡萄糖的測定

    精確稱取50 mg肝臟組織放入離心管后,加入250 μL裂解液,用電動(dòng)勻漿器勻漿破碎組織,勻漿后室溫靜置10 min。取230 μL上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中,取剩下的裂解液用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度測定。

    制備好的血清樣品和肝臟裂解液,采用葡萄糖試劑盒(購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司)測定葡萄糖(GLU)。

    1.4 肝臟中氨基酸測定

    稱取肉樣70 mg,加500 μL 6 mol/L HCL,勻漿60 s。將其轉(zhuǎn)移至20 mL安瓿瓶,2 mL 6 mol/L HCL清洗勻漿器,然后使用6 mol/L HCL定容至10 mL。放-20 ℃冰箱5 min,氮吹儀去掉空氣,酒精噴燈封口。在110 ℃下水解24 h,1 h后搖動(dòng)一次;24 h后拿出冷卻至室溫,全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶,使用超純水定容后搖勻。用0.22 mm水相濾膜過濾1 mL取500 μL至1.5 ml離心管中,氮吹儀吹干。200 μL 0.1 mol/L HCL 溶解,漩渦震蕩。加20 μL 正亮AA,加100 μL三乙氨已膘溶液,加100 μL 衍生試劑c異硫睛酸苯芷,混勻,室溫靜置1 h。加正己烷400 μL,漩渦震蕩,室溫15 min。取下層液體,0.22 mm濾膜過濾后,取200 μL濾液+800 μL超純水。最后取10 μL上樣。譜柱:SunFireTM C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)裝有SunFireTM C18保護(hù)住(4.6 mm×20 mm, 5 μm);流動(dòng)相A:0.1 mol/L醋酸鈉乙腈溶液(93∶7),pH 6.5;流動(dòng)相B:乙腈-甲醇-超純水溶液,比例為80∶10∶10;梯度洗脫,程序見表1,流速0.7 mL/min,柱溫40 ℃,檢測波長254 nm。測定肝臟中17種氨基酸。

    1.5 肝臟總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄成cDNA

    稱50 mg肝臟組織于1.5 mL離心管,按照總RNA提取試劑盒(Tiangen,中國)提取總RNA。最后,取1 μL提取的樣品進(jìn)行總RNA濃度和純度的測定。按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL,反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s;PCR反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),每個(gè)樣品都有3個(gè)重復(fù)。

    1.6 Real-time PCR

    熒光定量PCR反應(yīng)配置總體系為20.0 μL,其中SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ Kit 10.0 μL;10 μmol/L 的PCR Forward primer和PCR Reverse Primer各0.8 μL;Water PCR grade 6.4 μL;cDNA 2.0 μL。引物詳情見表2。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),每個(gè)樣品都有3個(gè)重復(fù)。計(jì)算方法按照2-ΔΔCt。因?yàn)樵谀膛V懈视腿?磷酸脫氫酶(GAPDH)基因穩(wěn)定性高。因此,以GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)μ钱惿P(guān)鍵的mRNA表達(dá)進(jìn)行歸一化處理。

    表2 熒光定量PCR引物信息Table 2 Information of reverse-transcription PCR primers

    1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。運(yùn)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示極顯著差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同蛋白水平的日糧對(duì)犢牛血清和肝臟葡萄糖含量的影響

    不同蛋白水平的日糧對(duì)犢牛血清和肝臟葡萄糖的含量,結(jié)果見表3。與低蛋白組相比,高蛋白組極顯著提高(P<0.01)肝臟中的葡萄糖含量,同時(shí)也顯著提高(P<0.05)血清中葡萄糖含量。

    表3 不同蛋白水平飼料對(duì)犢牛血清和肝臟葡萄糖含量的影響Table 3 Effects of protein at different concentrations on glucose content in serum and liver of Holstein bull calves

    2.2 不同蛋白水平的日糧對(duì)犢牛肝臟氨基酸含量的影響

    采用液相色譜的方法檢測犢牛肝臟中氨基酸的含量見表4。與低蛋白組相比,高蛋白組顯著提高(P<0.05)Asp、Ala、Ser、Leu、Lys、Phe、Ile、Val、Tyr、Arg、Glu和His的含量,極顯著提高(P<0.01)Gly和Pro的含量,但未改變Thr和Met的含量。

    表4 不同蛋白水平飼料對(duì)犢牛肝臟氨基酸含量的影響Table 4 Effects of protein at different concentrations on amino acidscontent in liver of Holstein bull calves mg/g

    2.3 不同蛋白水平的日糧對(duì)犢牛肝臟糖異生關(guān)鍵基因表達(dá)水平的影響

    采用qRT-PCR分別檢測PCK1、PCK2、PC、FBP1、G6PC和PGC1A在不同蛋白水平日料飼喂?fàn)倥5母闻K中的表達(dá)變化(表5)。與高蛋白組相比,高蛋白組顯著提高了(P<0.05)PCK2、PC和PGC1A基因表達(dá)量,極顯著提高了(P<0.01)PCK1基因表達(dá)量,其他基因無顯著差異。

    表5 不同蛋白水平飼料對(duì)犢牛肝臟糖異生途徑關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響Table 5 Effects of protein at different concentrations on mRNA expression of key genes of gluconeogenesis pathway in liver of male calves

    3 討論與結(jié)論

    糖異生對(duì)犢牛生長發(fā)育起著重要的作用[4]。尤其在進(jìn)食后,當(dāng)代謝產(chǎn)物大量流入血液時(shí),糖異生起著至關(guān)重要的角色[22]。通過氨基酸轉(zhuǎn)成為葡萄糖是糖異生經(jīng)典途徑之一[23]。除了賴氨酸和亮氨酸外,其他的氨基酸都可以通過糖異生途徑生成糖。在維持飼養(yǎng)水平的反芻動(dòng)物中,內(nèi)源性葡萄糖最少有15%是由氨基酸轉(zhuǎn)化而來的,來自肝臟攝取的氨基酸占32%。在生長階段的反芻動(dòng)物,需要大量的氨基酸去合成葡萄糖維持生長發(fā)育[24]。而日糧中蛋白質(zhì)是氨基酸的最重要來源。以往的研究主要集中在不同水平蛋白日糧對(duì)犢牛生長性能、血清生化和瘤胃發(fā)酵的影響,但不同水平蛋白日糧對(duì)犢牛糖異生的影響尚不清楚。因此本研究旨在不同蛋白水平全價(jià)顆粒日糧對(duì)犢牛糖異生的影響。

    在正常飼養(yǎng)水平下,反芻動(dòng)物血糖濃度總是維持在一定的恒定范圍之內(nèi),這對(duì)維持機(jī)體各組織細(xì)胞的能耗和功能發(fā)揮著重要作用。外源葡萄糖的吸收和內(nèi)源性糖異生作用都對(duì)血糖濃度有影響,而內(nèi)源性糖異生作用主要來自肝糖異生[25]。本課題組前期研究表明[20],高蛋白組會(huì)提高3 h血清中葡萄糖含量,但顯著不差異。李輝等[26]研究表明,22%蛋白水平也可提高犢牛血糖含量。低蛋白組由于采食的日糧水平較低,犢牛對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力較差,難以提供足夠的葡萄糖。本研究表明,日糧中高水平蛋白(21.02%)可以顯著提高犢牛5 h血清葡萄糖和屠宰后肝臟葡萄糖含量。這可能是蛋白質(zhì)消化為氨基酸在肝臟通過糖異生作用促進(jìn)血糖提高的原因。但是關(guān)于犢牛的氨基酸肝臟糖異生研究很少有報(bào)道。肝臟是氨基酸主要代謝的場所。除了賴氨酸和亮氨酸外的18種常見氨基酸均可以通過糖異生途徑生成葡萄糖。本研究中發(fā)現(xiàn),除了蘇氨酸和蛋氨酸以外,21.02%蛋白水平組增加了肝臟中其他氨基酸的含量。

    糖異生途徑包含4種關(guān)鍵的限速酶,即PC、PCK、FBP1和G6PC。草酰乙酸是由PC編碼的酶催化線粒體中丙酮酸得來的,提供糖異生中間體補(bǔ)充所需的草酰乙酸。在糖異生作用的增加時(shí)候,PC的mRNA表達(dá)被促進(jìn)以響應(yīng)來自糖原性AA和乳酸的草酰乙酸[9]。本研究表明,與低蛋白組組相比,高蛋白組組可以顯著提高PC的mRNA表達(dá)量。蘋果酸是草酰乙酸在線粒體蘋果酸脫氫酶的還原作用下生成的,并輸出到細(xì)胞質(zhì)中,并在細(xì)胞質(zhì)中蘋果酸脫氫酶氧化作用后再次生成草酰乙酸。PCK1和PCK2酶分別催化草酰乙酸在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中形成磷酸烯醇式丙酮酸。在細(xì)胞中,磷酸烯醇式丙酮酸是由PCK1催化草酰乙酸產(chǎn)生,這是糖異生的關(guān)鍵反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),高蛋白組可顯著促進(jìn)PCK1的mRNA表達(dá)量。先前的研究報(bào)道表明,氨基酸進(jìn)入糖異生是由PC和PCK1編碼的酶調(diào)節(jié)的,而不是PCK2,因?yàn)榘被嵝纬闪姿嵯┐际奖嵝枰诎麧{中獨(dú)立合成NADH[27]。PC和PCK1的 mRNA表達(dá)量的增加,進(jìn)一步暗示了飼喂高蛋白可促進(jìn)肝臟中磷酸烯醇式丙酮酸濃度增加,進(jìn)而滿足下一步糖異生反應(yīng)。盡管以氨基酸作為前體物質(zhì)的糖異生并不依賴PCK2,但是PCK2也在糖異生發(fā)揮著重要的作用。在單胃動(dòng)物的肝臟中,PCK2只占總磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的大約1%~5%[28],但在反芻動(dòng)物中PCK1和PCK2的活性大致相等[10]。本研究發(fā)現(xiàn),高蛋白組可顯著促進(jìn)PCK2的mRNA表達(dá)量。FBP1和G6PC的功能是催化果糖1,6-二磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?。盡管本研究顯示,高蛋白組并未有顯著的提高FBP1和G6PC的mRNA的表達(dá)量。先前的研究表明,高蛋白飲食增加了肝臟中PCK的活性,但對(duì)G6PC的活性影響不大[29-30]。PGC1A作為一種調(diào)節(jié)與能量代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄輔激活物[31]。此外,PGC1A還參與糖異生關(guān)鍵基因的表達(dá),通過提高PCK啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性去提高肝臟中的PCK的表達(dá)水平。與低蛋白組相比,高蛋白組顯著提高了PGC1A的mRNA表達(dá)量。此外,Dai等[32]研究發(fā)現(xiàn)高水平的氨基酸可以提高肝臟糖異生基因的表達(dá)和氨基酸的利用效率。本研究表明,日糧中高蛋白水平可以提高肝臟中氨基酸豐度同時(shí)增加肝臟糖異生關(guān)鍵基因的表達(dá)量,進(jìn)而促進(jìn)糖異生生成葡萄糖提供機(jī)體所需的能量。

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