多酶共固定化技術(shù)在糖類催化中的研究進(jìn)展

唐婷，周文鳳，王志，朱晨杰，許敬亮，莊偉，應(yīng)漢杰，歐陽平凱

（1 鄭州大學(xué)化工學(xué)院，生物 +聯(lián)合研究中心，河南 鄭州 450002；2 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，國家 生化工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 211816）

糖類是一種天然、多功能、可再生的有機(jī)分子，其催化轉(zhuǎn)化一方面可以減少自然界生物質(zhì)資源的浪費(fèi)，另一方面可以將糖類轉(zhuǎn)化為附加值高的多種產(chǎn)品，如藥物、食品添加劑、生物質(zhì)燃料等，廣泛應(yīng)用于人們?nèi)粘Ｉ詈凸I(yè)生產(chǎn)中。在糖類的催化反應(yīng)中，傳統(tǒng)的化學(xué)催化法存在催化效率低、設(shè)備腐蝕嚴(yán)重、分離困難、污染環(huán)境等問題，阻礙了糖類的高效轉(zhuǎn)化和實(shí)際應(yīng)用。相比之下，固定化酶催化技術(shù)不僅反應(yīng)條件溫和、選擇性好、專一性高、催化效率高，而且穩(wěn)定性強(qiáng)，便于回收和重復(fù)利用，為糖類的催化反應(yīng)提供了一條綠色高效的途徑，引起了研究者的極大興趣。

糖類結(jié)構(gòu)繁多，催化過程復(fù)雜，往往需要多種酶共同參與完成，單酶固定化技術(shù)顯然難以滿足需求，因此，發(fā)展基于級聯(lián)反應(yīng)的多酶共固定化技術(shù)是糖類催化的必然選擇。多酶共固定化技術(shù)是在單酶固定化的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，簡單來說，就是通過物理、化學(xué)或生物親和等方法，將多種酶或含酶細(xì)胞固定于同一個載體上，使多種酶之間協(xié)同作用，充分發(fā)揮其催化特性。在共固定化多酶的級聯(lián)催化過程中，一種酶的產(chǎn)物往往是另一種酶的底物，通過縮短底物的傳輸距離和反應(yīng)時間，減少了中間物的積累和抑制，能夠獲得更高的催化效率和更少的污染物。此外，多酶共固定化技術(shù)簡化了多步反應(yīng)的復(fù)雜流程，更易獲得目標(biāo)產(chǎn)物。

目前，多酶共固定化技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、能源、環(huán)境保護(hù)等行業(yè)，尤其在糖類催化領(lǐng)域的發(fā)展最為廣泛和深入，并形成了很多新成果。鑒于此，本文論述了糖類催化中常用的多酶共固定化方法（包括傳統(tǒng)方法和新型方法），介紹了多酶共固定化技術(shù)在糖類催化中的應(yīng)用，分析了存在的問題并對其發(fā)展前景進(jìn)行展望，以期為該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展提供有益參考。

1 糖類催化中常用的多酶共固定化方法

根據(jù)酶與載體之間結(jié)合方式的不同，多酶共固定化方法可分為多種類型，主要包括發(fā)展較為成熟的4種傳統(tǒng)固定化方法以及近年來出現(xiàn)的一些新型固定化技術(shù)。本節(jié)對糖類催化中常用的共固定化方法進(jìn)行論述，并對其優(yōu)缺點(diǎn)加以討論。

1.1 傳統(tǒng)固定化技術(shù)

傳統(tǒng)固定化技術(shù)是發(fā)展成熟且目前最為常用的方法。通常包括4種，即吸附法、包埋法、共價法和交聯(lián)法，其基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示。傳統(tǒng)法的應(yīng)用范圍比較廣，適合大部分的多酶催化體系。但在對某一特定的多酶體系進(jìn)行共固定化時，要充分考慮載體的特點(diǎn)、多酶的性質(zhì)、級聯(lián)反應(yīng)的類型以及酶與載體之間的相互作用等多種因素，并在此基礎(chǔ)上選擇合適的方法以實(shí)現(xiàn)最佳催化效果。此外，在實(shí)際應(yīng)用中，還可以將多種方法聯(lián)用以提高固定化酶的性能，如吸附-交聯(lián)法、吸附-共價法不僅能增加酶蛋白負(fù)載量，還可以使共固定化多酶的穩(wěn)定性大幅度提高。

表1 目前常用的幾種傳統(tǒng)固定化技術(shù)及其比較

總體而言，以上4 種傳統(tǒng)固定化方法各具優(yōu)勢，與游離酶相比，制備的固定化多酶均展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性。然而，這些方法都具有一定的局限性，容易出現(xiàn)酶分子的隨機(jī)排列和相互堆積的現(xiàn)象，無法實(shí)現(xiàn)酶分子在載體上的精確有序定位，使整體酶活及催化效率受到限制。

1.2 新型固定化技術(shù)

為了克服傳統(tǒng)固定化技術(shù)的不足，近年來國內(nèi)外研究者開始探究一些新型固定化方法。通過精確控制不同酶之間的空間取向或相對位置，使酶蛋白活性位點(diǎn)充分暴露或縮短底物分子的傳輸距離，以提高多酶體系的催化效率。其中，應(yīng)用較為廣泛的是生物固定化法，按照技術(shù)原理的不同又可分為金屬親和標(biāo)簽固定化技術(shù)、生物親和固定化技術(shù)以及DNA定向固定化技術(shù)。

1.2.1 金屬親和標(biāo)簽固定化技術(shù)

金屬親和標(biāo)簽固定化技術(shù)是利用某些氨基酸與過渡金屬離子（Fe、Co、Ni等）形成配位鍵而使酶分子固定在載體上的一種方法。適當(dāng)?shù)挠H和標(biāo)簽可以用于修飾酶分子，并提高固定化酶的催化效率。常用的金屬親和標(biāo)簽為六組氨酸（6×His），它可以溫和地結(jié)合在酶分子的C端或N端，然后與載體上的Ni特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)酶在載體上的定向固定。

Liu 等利用這一原理將七種酶通過六組氨酸標(biāo)簽固定在鎳瓊脂糖珠上，并裝填于反應(yīng)柱中，構(gòu)建了七酶級聯(lián)催化反應(yīng)體系，用于尿苷二磷酸半乳糖（UDP-半乳糖）的合成。由于多酶之間的臨近效應(yīng)和協(xié)同催化作用，該固定化酶體系表現(xiàn)出較好的催化活性，反應(yīng)混合物連續(xù)催化48h可將50%的尿苷單磷酸（UMP）轉(zhuǎn)化為UDP-半乳糖，反應(yīng)24h的產(chǎn)物產(chǎn)量（1.80g/L）遠(yuǎn)大于溶液中的游離酶（1.26g/L）。此外，該法制備的固定化酶穩(wěn)定性良好，是一種利用廉價原材料生產(chǎn)UDP-半乳糖的有效方案。利用相似的工作原理，Pl?課題組將His標(biāo)簽標(biāo)記的酮基還原酶（KRED）和葡萄糖脫氫酶（GDH）共固定在含Ni的瓊脂糖基質(zhì)上，制備了重復(fù)間歇流生物反應(yīng)器?；陔p酶正交級聯(lián)反應(yīng)的原理，GDH 催化所產(chǎn)生的NADP正好滿足了主反應(yīng)對輔因子的需求，充分發(fā)揮了多酶協(xié)同催化的優(yōu)勢。這種精心設(shè)計(jì)的固定化多酶系統(tǒng)具有比游離酶更好的底物耐受性，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率可達(dá)95%。

金屬親和標(biāo)簽固定化是一種較為溫和的固定化方法。親和標(biāo)簽相對較小的尺寸和低電荷量減少了對酶蛋白活性的干擾，并可以實(shí)現(xiàn)與功能化載體的特異性結(jié)合。目前，很多酶的親和標(biāo)簽都可以通過基因編碼來完成。但是該法仍存在一些缺點(diǎn)，如載體和酶的修飾過程煩瑣，有時會出現(xiàn)金屬離子易脫落、選擇性低、親和力不高等缺點(diǎn)，且一般適用于活性中心遠(yuǎn)離C端或N端的酶分子。

1.2.2 生物親和固定化技術(shù)

生物親和固定化技術(shù)，是利用某些生物分子間的特異性結(jié)合將酶分子固定到載體上的一種新型方法。根據(jù)親和分子種類的差異，該技術(shù)包括抗原-抗體親和法、親和素-生物素親和法和凝集素-糖類親和法等。

Jia 等基于抗原-抗體親和作用定向固定化酶的原理，制備了電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測腫瘤標(biāo)志物。該制作過程主要分為三個部分，如圖1所示：第一部分（a），將硫堇（THI）標(biāo)記的CEA-抗體及二茂鐵（Fc）標(biāo)記的AFP-抗體分別結(jié)合在鉑納米粒子功能化的氧化石墨烯上，并以此作為共固定化HRP 和GOD 的復(fù)合載體；第二部分（b），將金納米粒子（AuNPS）沉積到玻碳電極（GCE）表面，用于結(jié)合大量的CEA-抗體和AFP-抗體；第三部分（c），通過加入CEA 和AFP 兩種抗原使兩類復(fù)合載體結(jié)合，從而將GOD 和HRP 定向固定在復(fù)合電極上。在此反應(yīng)體系中，葡萄糖經(jīng)GOD和HRP 的級聯(lián)催化產(chǎn)生電化學(xué)信號，并經(jīng)由“夾心載體”將免疫信號放大，從而實(shí)現(xiàn)了對抗原的快速靈敏檢測。這種免疫檢測器具有良好的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，且檢測限較低（CEA 為1.64×10g/L，AFP 為1.33×10g/L），可用于臨床血清的檢測與分析。

圖1 CEA、AFP免疫信號放大生物傳感器示意圖[29]

Mansur小組將蔗糖酶（INV）、GOx、HRP分別與生物素結(jié)合形成酶-生物素復(fù)合物，然后利用生物素-親和素的相互作用，將三種酶層層組裝，建立了具有3D構(gòu)架的固定化多酶級聯(lián)系統(tǒng)（圖2）。與游離酶相比，這種生物親和固定化酶表現(xiàn)出良好的催化活性和更高的底物親和性，其值僅為游離酶的1/3，這一方面是因?yàn)殡p酶經(jīng)固定化后借助載體表面的親水性增加了對底物的親和性，另一方面由于多酶之間的有序排列和構(gòu)建的反應(yīng)微環(huán)境促進(jìn)了底物向酶活性位點(diǎn)的靠近。此外，他們還重點(diǎn)研究了三酶的相對位置對整體活性的影響，結(jié)果表明當(dāng)酶的排列順序不同時，反應(yīng)體系的催化效率也隨之變化，這種差異可歸因于多種因素，如不同排列方式對酶構(gòu)象的影響、空間位阻以及級聯(lián)反應(yīng)的途徑等。

圖2 生物素-親和素法固定化INV、GOx和HRP[30]

Chen等以功能化多壁碳納米管（MCNTs）作為載體，利用糖-凝集素之間的親和作用，通過層層組裝的方式構(gòu)建了HRP-GOD 雙酶傳感器（圖3）。該固定化策略既完成了對單個酶的調(diào)控，也實(shí)現(xiàn)了雙酶的定向有序組裝。這種MCNT-酶納米復(fù)合材料對葡萄糖的線性響應(yīng)范圍為2.0×10～1.7×10mol/L，檢測限可低至2.5×10mol/L，且具有快速的響應(yīng)性（響應(yīng)時間小于5s）、高度的選擇性和良好的穩(wěn)定性，可直接用于測定血清中的葡萄糖。

圖3 基于功能化MCNTs和糖-凝集素特異性作用的雙酶仿生納米電極[31]

與金屬親和標(biāo)簽固定化技術(shù)相比，生物親和固定化的親和作用力更強(qiáng)且具有高度的專一性，因此制備的固定化酶不僅能夠較大程度地保留原始酶活，而且具有較好的穩(wěn)定性。但是由于使用的生物親和標(biāo)簽價格昂貴，且酶分子改性過程較為煩瑣，因此一般不適用于工業(yè)生產(chǎn)的多酶催化體系。

1.2.3 DNA定向固定化技術(shù)

DNA定向固定化（DDI）技術(shù)是一種具有高度特異性和位點(diǎn)可選擇性的固定化方法，能夠精確地控制酶的空間位置及方向，調(diào)節(jié)多酶之間的相對距離以提高整體催化效率。此外，DNA片段自身具有良好的機(jī)械剛性和生物相容性，不僅能夠充分保護(hù)酶的活性，還能提高固定化酶的穩(wěn)定性。

最簡單的DNA 定向固定化酶是通過兩條互補(bǔ)的DNA 短鏈來實(shí)現(xiàn)的。簡言之，將探針DNA 鏈（P）與載體結(jié)合，目標(biāo)DNA單鏈（C）與酶分子結(jié)合，然后利用兩種鏈（P 和C）之間的堿基互補(bǔ)作用實(shí)現(xiàn)酶分子在載體上定向固定。Yang課題組通過這種方法，將HRP 和GOx 共固定在多巴胺衍生物改性的磁性納米顆粒上（圖4）。制備的DNA 定向共固定化酶具有較好的底物親和性和優(yōu)異的酶學(xué)性能，其值為游離酶的0.73 倍，相對酶活比游離酶高20%，比單酶定向固定化高55%，且能夠利用其磁分離特性進(jìn)行多次回收利用，在重復(fù)催化13 個批次后仍可保持75%的活性。此外，該方案還可以通過調(diào)節(jié)載體上兩種官能團(tuán)的數(shù)量來調(diào)節(jié)固定化雙酶的比例，以獲得最佳催化效率。這種DNA 定向固定化技術(shù)為制備人工多酶復(fù)合物提供了一條新途徑，可應(yīng)用于醫(yī)療診斷、生物醫(yī)學(xué)設(shè)備和生物技術(shù)中。

圖4 多功能磁性納米粒子上的DNA定向固定化多酶[33]

DNA 自組裝技術(shù)是另一種較為復(fù)雜的DNA 定向固定化方法。它是對多條DNA 鏈進(jìn)行獨(dú)特的空間設(shè)計(jì)，使之形成多維組裝體，用于定向固定不同的酶分子。Liu 等以自組裝的方式設(shè)計(jì)了一個DNA 支架，并以酶抑制劑為連接體，將DNA 鏈與GOD、INV和HRP三種酶定向結(jié)合在一起。然后在三種酶表面將DNA 支架移除，制備了超分子納米酶膠囊（圖5）。該固定化多酶體系的催化效率是游離酶的24 倍，且納米膠囊能夠保護(hù)酶免受外界環(huán)境的破壞，使酶穩(wěn)定性顯著提高。

圖5 DNA自組裝合成納米多酶體系[35]

隨著DNA 納米技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一種更高級的自組裝方法——DNA 折紙技術(shù)。它是通過復(fù)雜的空間設(shè)計(jì)合成二維或三維的DNA 折紙納米結(jié)構(gòu)，并以此作為載體來實(shí)現(xiàn)多酶的定向固定化。其中，最為經(jīng)典的是Wilner等通過自組裝技術(shù)設(shè)計(jì)了一個六邊形的DNA 骨架（圖6），用于將GOx和HRP 定向固定化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該反應(yīng)體系的活性與DNA 骨架的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有關(guān)，可以通過對DNA鏈進(jìn)行設(shè)計(jì)來控制雙酶的相對位置，從而調(diào)節(jié)該體系的最大催化活性。相似地，F(xiàn)u等利用該技術(shù)合成了DNA納米磚（圖7），用于固定化HRP和GOx，并探究了兩酶的間距（10～65nm）和位置對酶活性的影響。結(jié)果表明，DNA 折紙上固定化酶的酶活普遍大于游離酶，且兩酶間距為10nm時DNA固定化酶的酶活最高（約為游離酶的4 倍），該研究對解釋酶活與位置的相關(guān)機(jī)理具有重要意義。

圖6 GOx和HRP在“二六邊形”和“四六邊形”上的固定化[37]

圖7 GOx和HRP在DNA納米結(jié)構(gòu)上的自組裝[38]

不難看出，DNA 定向固定化技術(shù)在提高酶活方面效果顯著。這一方面得益于DNA 分子優(yōu)良的生物相容性和精確的定位能力，避免了多酶分子之間的堆積重疊，保證酶活性位點(diǎn)的充分暴露；另一方面，由于DNA 結(jié)構(gòu)具有可設(shè)計(jì)性，能夠方便地調(diào)節(jié)多酶的比例、多酶之間的距離以及不同酶分子的空間取向，對整體酶活具有顯著促進(jìn)作用。

綜上所述，新型固定化技術(shù)具有溫和、高效、精確定位等特點(diǎn)，因此通常比傳統(tǒng)固定化技術(shù)具有更好的催化活性。然而，由于生物標(biāo)簽試劑和DNA 鏈的操作要求及應(yīng)用成本都相對較高，其普適性還有賴于生物技術(shù)和DNA技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。目前，新型固定化技術(shù)多用于醫(yī)學(xué)檢測、生物分析及傳感器等少數(shù)領(lǐng)域，而對于一般的多酶催化體系并不常用。

2 多酶共固定化技術(shù)在糖類催化中的應(yīng)用

多酶共固定化技術(shù)在糖類催化中的應(yīng)用源于20 世紀(jì)中期。起初，人們主要關(guān)注于共固定化細(xì)胞對糖類的催化作用，后來又開始探索多種新型固定化方法，其部分應(yīng)用如表2所示。目前，多酶共固定化技術(shù)發(fā)展日漸成熟，在糖類催化中的應(yīng)用也非常廣泛，常見的有淀粉的水解、纖維素的利用以及功能性糖的合成等。

表2 多酶共固定化技術(shù)在糖類催化中的應(yīng)用

2.1 多酶共固定化技術(shù)在淀粉水解中的應(yīng)用

淀粉是我國產(chǎn)量最多的可再生能源之一。該行業(yè)正面臨著初級產(chǎn)品用量過剩、經(jīng)濟(jì)價值低的困境，而其水解產(chǎn)物葡萄糖、麥芽糖等應(yīng)用極為廣泛，在食品、醫(yī)療、化工等行業(yè)發(fā)揮著不可或缺的作用。利用多酶共固定化技術(shù)對淀粉進(jìn)行酶解，使其轉(zhuǎn)化為高價值產(chǎn)品，推動行業(yè)轉(zhuǎn)型升級，已成為當(dāng)今發(fā)展的必然趨勢。

共價法和交聯(lián)法是淀粉催化中常用的多酶共固定化方法。Torabizadeh等以戊二醛為交聯(lián)劑，將α-淀粉酶和麥芽糖淀粉酶共固定在賴氨酸改性的磁性FeO納米顆粒上，用于催化淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖。與游離酶相比，該固定化雙酶保留了84%的活性，在95℃催化時的值降低了1.5倍，熱穩(wěn)定性增加了1.5倍，且重復(fù)使用10個循環(huán)后仍可保留80.4%的原始活性。這種具有高穩(wěn)定性和重復(fù)使用性的納米生物催化劑具有實(shí)際生產(chǎn)價值，為淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖的工業(yè)生產(chǎn)提供了有效方案。相似地，Talekar 等以2%的戊二醛為交聯(lián)劑，將葡萄糖淀粉酶和普魯蘭酶共固定化，在間歇條件下，淀粉水解的轉(zhuǎn)化率為100%，重復(fù)使用8 次后兩酶分別保留90%和85%的活性。在此基礎(chǔ)上，該課題組用同樣的方法制備了三種酶（α-淀粉酶、支鏈淀粉酶和葡糖淀粉酶）的交聯(lián)聚集體，并比較了不同多酶體系混合物的催化效果。結(jié)果表明，多酶交聯(lián)聚集體的轉(zhuǎn)化率（100%）比單酶交聯(lián)聚集體混合物（60%）、游離酶混合物（40%）高很多，并且重復(fù)使用5個循環(huán)活性不發(fā)生明顯變化。

與共價法相比，包埋法在操作上更為簡單方便。Zhang 等受線粒體內(nèi)代謝酶空間結(jié)構(gòu)和貽貝黏附蛋白多功能特性的啟發(fā)，通過層層組裝的方式，將葡糖苷酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶和共包埋于多巴胺（PDA）微囊的不同位置（圖8）。用于催化淀粉水解為葡萄糖。由于PDA 微膠囊固有的傳質(zhì)阻力，固定化多酶的催化速率要比游離酶慢。但是，其最大產(chǎn)率（53%）大于游離酶（39%），這是因?yàn)镻DA 的親水性和良好的生物相容性為多酶級聯(lián)體系提供了一個合適的反應(yīng)微環(huán)境，從而提高了整體催化活性。Salgaonkar 等用一鍋共沉淀法制備了淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的復(fù)合金屬有機(jī)骨架（MOF），用于將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。基于MOF的支撐保護(hù)作用，該固定化酶復(fù)合物具有良好的穩(wěn)定性，在儲藏24 天后仍保留89%的活性，遠(yuǎn)高于游離態(tài)。

圖8 多巴胺微膠囊構(gòu)建的固定化多酶體系[47]

在載體比表面積較大的情況下，吸附法也是一種較好的選擇。Han等以多孔微球作為載體，利用吸附法共固定化α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、肌醇1-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，用于催化淀粉合成肌醇。該共固定化多酶體系的催化速率與游離酶相當(dāng)，且具有更高的熱穩(wěn)定性，使用7個批次后仍保留45.6%的相對產(chǎn)率，而游離酶3 個批次后僅保留13.3%的相對產(chǎn)率。這種多孔微球共固定化酶可用于生物制造，對體外合成酶系統(tǒng)的工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。

除單一固定化法外，還可以將多個方法結(jié)合使用。Dai將包埋法和吸附法聯(lián)用，使葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶分別固定于藻酸鈣珠粒的內(nèi)表面和外表面，兩酶的固定效率分別為45%和54%。這種固定化策略可以通過減少中間過程的繁雜步驟數(shù)來提高淀粉水解過程的效率，從而降低酶費(fèi)用及加工成本。

綜上所述，對于淀粉水解的多酶體系，共價固定法最常用。雖然共價固定后的多酶催化體系活性有所損失，但仍保持了高效的催化效率和良好的穩(wěn)定性，具有工業(yè)化應(yīng)用的潛力。包埋法和吸附法能較大程度地保留淀粉酶的活性，但是由于存在底物傳質(zhì)限制和酶易脫落的問題，催化效率和操作穩(wěn)定性往往不如共價固定化法。

2.2 多酶共固定化技術(shù)在纖維素處理中的應(yīng)用

木質(zhì)纖維素可以形成大部分植物的細(xì)胞壁和結(jié)構(gòu)組織，是全球最豐富的可再生農(nóng)業(yè)原料，其主要成分是纖維素。在過去幾十年中，隨著各工業(yè)部門對水解纖維素產(chǎn)品的需求量增加，纖維素酶的應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注。在纖維素的水解過程中，往往需要多種酶協(xié)同催化才能獲得目的產(chǎn)物，然而游離酶體系往往成本高、穩(wěn)定性差且難以回收。因此，在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中，將多種游離纖維素酶進(jìn)行共固定化以提高生產(chǎn)效益是十分必要的。

Cho 等以金納米粒子作為載體（AuNP），共固定半胱氨酸標(biāo)記的三種纖維素酶（內(nèi)葡聚糖酶、外葡聚糖酶、β-葡糖苷酶）用于催化纖維素水解（圖9）。結(jié)果表明，該固定化體系的活性和穩(wěn)定性顯著高于游離纖維素酶混合物。在進(jìn)一步研究中，將這三種酶固定在金-二氧化硅復(fù)合納米粒子上（Au-MSNP），用于連續(xù)生產(chǎn)葡萄糖。研究發(fā)現(xiàn)，由于SiO的存在減少了金納米粒子間的相互作用，Au-MSNP@纖維素酶具有更好的催化效率，生成的纖維二糖和葡萄糖的產(chǎn)率分別增加了158%和179%，且在重復(fù)使用7 次后仍保留90%的催化活性。

圖9 在AuNP和Au-MSNP上固定化纖維素酶[52]

相似地，Yuan 等用磁性納米粒子共固定化三種纖維素酶，水解植物細(xì)胞壁的纖維素以回收花青素。固定化酶顯示出優(yōu)越的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，即使在儲存60 天后，幾乎保持所有的催化活性，而游離酶在30 天內(nèi)失去全部活性。此外，還表現(xiàn)出良好的催化能力，可用于回收5 種花青素，降低了工業(yè)應(yīng)用酶的成本。

Muley 等利用溶劑沉淀法從發(fā)酵液中回收纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶，然后以戊二醛為交聯(lián)劑，將這三種酶共固定在APTES 改性的FeO納米粒子上。三種酶的酶活回收率分別為80.25%、84.76%和75.62%，與游離酶相比具有更好的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性，最適溫度由50℃升高為60℃，在5℃下可以穩(wěn)定保存36 天，且在循環(huán)使用4次后仍可保留90%以上的催化活性。這種磁性多酶復(fù)合物性能優(yōu)良，已成功用于黑胡椒中胡椒堿的提取、甘蔗細(xì)胞原生質(zhì)體的制備以及木瓜汁的澄清等。與之相似，Kumari 課題組以FeO納米粒子作為載體，共固定化木聚糖酶、纖維素酶和淀粉分解葡聚糖轉(zhuǎn)移酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三種酶的固定效率分別為92%、45%和93%。制備的共固定化多酶在4℃下儲存45天可以保持66%的催化活性，重復(fù)利用13 次后仍具有50%以上的活性。該多酶復(fù)合物也可用于農(nóng)業(yè)廢棄物的處理，將生物質(zhì)中的纖維素或半纖維素轉(zhuǎn)化為不同種類的單糖，或進(jìn)一步處理轉(zhuǎn)化為乙醇等染料。

纖維素水解中的酶體系大多都是由不同類型的纖維素酶構(gòu)成的。與游離酶相比，共固定化后的多酶體系表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，即具有非常好的儲存穩(wěn)定性和良好的重復(fù)使用性，這在一定程度上為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

2.3 多酶共固定化技術(shù)在功能性糖合成中的應(yīng)用

功能性糖是對人體健康有改善促進(jìn)作用的一些糖類，主要包括功能性低聚糖、功能性膳食纖維和功能性糖醇。功能性糖可以作為蔗糖的替代品，不僅具有抗齲齒、降血壓、保護(hù)腸道的生理功效，還能預(yù)防癌癥、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生。目前，利用多酶級聯(lián)催化法制備功能性糖是一種綠色高效的途徑。

低聚半乳糖是一種具有天然屬性的功能性寡糖，可促進(jìn)腸道菌群的生長，是最有前途的益生元之一。Li 等將β-半乳糖苷酶固定在海藻酸鈣上，催化乳糖生成低聚半乳糖。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用固定化的釀酒酵母細(xì)胞對產(chǎn)物進(jìn)行反復(fù)純化，獲得了高純度的低聚半乳糖。但是由于兩部分固定化過程是分開進(jìn)行的，這種方法在操作上較為煩瑣且獲得的產(chǎn)率較低。近些年，Aburto等也對該催化體系進(jìn)行了研究，但制備固定化酶的方法與Li課題組大不相同。簡單來說，先制備β-半乳糖苷酶的交聯(lián)酶聚集體，然后將其與釀酒酵母細(xì)胞共固定在海藻酸鈣凝膠中。結(jié)果表明，酶和細(xì)胞的共固定化復(fù)合物不僅易于回收和重復(fù)使用，而且獲得了與游離酶（23.3%）相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物收率（25.7%），是一種從乳糖中提取低聚半乳糖的創(chuàng)新工藝。然而，由于酵母細(xì)胞在操作過程中易失活，使催化性能受到限制，所以需進(jìn)一步改進(jìn)工藝以提高酵母細(xì)胞的穩(wěn)定性。

低聚乳果糖是另一種促進(jìn)腸道菌群增殖的功能性糖，可以作為甜味劑食用，在食品行業(yè)應(yīng)用廣泛。Long 等用溶膠-凝膠法共固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶，用于催化蔗糖/乳糖混合液生成低聚乳果糖。與游離酶相比，該固定化雙酶體系具有85.3%的初始活性和較好的操作穩(wěn)定性，在使用15 次之后仍保留78.5%的活性。這種共固定化雙酶體系的低聚乳果糖的產(chǎn)量高達(dá)160.8g/L，可用于食品工業(yè)中高純度低聚乳果糖的連續(xù)生產(chǎn)。

低聚異麥芽又稱益生元，具有促進(jìn)消化吸收、增強(qiáng)免疫力、降低血脂的功能。?l?er 等用海藻酸鈣膠囊法共固定化葡聚糖蔗糖酶（DS）和葡聚糖酶（DN），并以蔗糖為原料制備低聚異麥芽糖。該法簡單有效，不僅具有較高的固定化效率（71%），在重復(fù)使用20 個循環(huán)或儲存一個月后仍可保持其催化活性，具有工業(yè)化生產(chǎn)低聚麥芽糖的潛力。

2.4 多酶共固定化技術(shù)在糖類下游產(chǎn)品合成中的應(yīng)用

糖類的催化產(chǎn)物經(jīng)進(jìn)一步加工，還可轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N化合物，不僅可用于補(bǔ)充人體營養(yǎng)物質(zhì)（如小分子糖、微量元素等），還可以作為工業(yè)生產(chǎn)的原料，廣泛地用于各行各業(yè)中。

5-羥甲基糠醛是一種以糖類為原料合成的有機(jī)物，其化學(xué)性質(zhì)活潑，可以通過氧化、氫化和縮合等反應(yīng)轉(zhuǎn)化為多種化學(xué)品或液體染料，應(yīng)用極為廣泛。Wu 等將半乳糖氧化酶、過氧化氫酶和辣根過氧化物酶共固定化在Cu(PO)納米花中，構(gòu)建了一條由5-羥甲基糠醛生成2,5-二甲?；秽摹熬G色路線”。研究發(fā)現(xiàn)，游離酶易受高濃度的5-羥甲基糠醛影響而失去活性，但共固定化三酶表現(xiàn)出更好的底物耐受性和熱穩(wěn)定性。此外，共固定化三酶催化生成2,5-二甲?；秽漠a(chǎn)率（95.7%）是單獨(dú)固定化酶（90.4%）的1.06 倍，這是因?yàn)槿傅墓捕ㄎ粶p少了底物傳輸?shù)木嚯x，促進(jìn)了級聯(lián)反應(yīng)的有序進(jìn)行。在以后的研究中，可以進(jìn)一步將化學(xué)催化法和多酶共固定化技術(shù)相結(jié)合，探究將木質(zhì)纖維素直接轉(zhuǎn)化為2,5-二甲酰基呋喃的高效路徑。

葡萄糖酸是一種多功能有機(jī)化工產(chǎn)品，其鹽類可廣泛應(yīng)用于制藥、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥和混凝土行業(yè)。據(jù)報(bào)道，糖類的酶法催化是生產(chǎn)葡萄糖酸的有效途徑之一。Han 等用纖維素酶水解脫木質(zhì)素的玉米棒殘?jiān)―CCR），進(jìn)而在共固定化葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的催化下，生成葡萄糖酸鈉。該固定化酶在最佳條件下反應(yīng)56h 可得166.87g/L 葡萄糖酸鈉，產(chǎn)物收率為98.24%，重復(fù)使用6次后仍能保持60%以上的催化活性。在此研究的基礎(chǔ)上，Yu 等將纖維素酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶三種酶共固定在Eudragit L-100 上，用于生成葡萄糖酸。通過確定制備條件、探究酶學(xué)性質(zhì)和優(yōu)化催化條件，最終生成的葡萄糖酸的產(chǎn)量達(dá)0.28mg/mg，玉米秸稈中纖維素的轉(zhuǎn)化率為61.41%。該共固定化多酶系統(tǒng)適用于將玉米秸稈一鍋轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸。

木糖酸是維他命C的重要代謝產(chǎn)物之一，也是許多重要化學(xué)過程必不可少的中間體。Bachosz等利用磁性納米粒子共固定化木糖脫氫酶和乙醇脫氫酶，用于將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟咎撬?，并使原位輔因子再生。共固定化酶生成的木糖酸濃度比游離酶高25%，并具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性：保存20天后活性保留了60%左右，連續(xù)5個反應(yīng)循環(huán)后活性仍大于65%。

乙醇是重要的生物質(zhì)燃料和化學(xué)溶劑，廣泛用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品工業(yè)、國防化工等行業(yè)。Altuntas 等將淀粉葡糖苷酶和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌細(xì)胞共固定在海藻酸鈉凝膠中，以廉價的淀粉作為底物，在連續(xù)攪拌的生物反應(yīng)器中同時糖化和發(fā)酵生成乙醇。該生物催化劑具有較好的反應(yīng)活性，在最佳條件下，底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)98%。與此不同，Silva小組先將葡萄糖異構(gòu)酶固定在殼聚糖上，然后再進(jìn)一步與釀酒酵母共固定于藻酸鈣凝膠中，在連續(xù)生物反應(yīng)器中將木糖轉(zhuǎn)化為乙醇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該共固定化多酶具高蛋白負(fù)載量（0.03～0.068g/g）、高產(chǎn)物收率（約100%）和高酶活回收率（>90%），且最佳活性幾乎是商用酶的2倍，可滿足由木糖為底物連續(xù)生產(chǎn)乙醇的需要，具有工業(yè)應(yīng)用的潛力。

2.5 多酶固定化技術(shù)在人工光合作用中的應(yīng)用

二氧化碳是導(dǎo)致溫室效應(yīng)的主要?dú)怏w之一。從資源利用和能源合成的戰(zhàn)略角度來看，利用可再生能源將二氧化碳轉(zhuǎn)化為化學(xué)品具有重要意義，不僅能夠減少碳排放緩解溫室效應(yīng)的危害，而且可以將低價值的化合物轉(zhuǎn)化為具有高附加值的產(chǎn)品。近年來，隨著多酶級聯(lián)系統(tǒng)的迅速發(fā)展，人工光合作用應(yīng)運(yùn)而生，通過利用每種酶的特性和多酶之間的協(xié)同效應(yīng)，將CO高效地轉(zhuǎn)化為一些重要的化學(xué)原料，如甲醛和甲醇等。因此，人工光合作用作為一種創(chuàng)新型方法，近年來受到研究者的廣泛關(guān)注。

Huang基于胞外酶工程原理，通過組合自然界存在的多種酶，催化自然界不存在的暗反應(yīng)途徑。該過程使用H或電能再生NADH驅(qū)動CO轉(zhuǎn)化為糖或淀粉，避開了人工光合磷酸化再生ATP 的難題，理論效率較高。如果進(jìn)一步與太陽能光伏技術(shù)或者產(chǎn)氫技術(shù)結(jié)合，就能實(shí)現(xiàn)人工光合作用，將CO轉(zhuǎn)化為了糖類，成為一種工業(yè)糧食生產(chǎn)的潛在方法。該研究具有理論創(chuàng)新性，但其催化過程存在酶穩(wěn)定性的問題。多酶共固定化技術(shù)可以很好地改善這一困境，即通過對反應(yīng)過程中的多種酶進(jìn)行固定化操作，使酶的穩(wěn)定性和反應(yīng)轉(zhuǎn)化數(shù)顯著提高，進(jìn)而提高糖類產(chǎn)率。因此，基于多酶共固定化技術(shù)的原理，Zhou等設(shè)計(jì)了一種新穎的方案，通過將中-四（羧基苯基）卟吩（TCPP）和ZIF-8 成功結(jié)合在一起，以TCPP 用作光催化劑，ZIF-8 作為甲醛脫氫酶（FaldDH）和甲酸脫氫酶（FateDH）的固定化載體，首次構(gòu)建了光催化多酶級聯(lián)仿生固碳系統(tǒng)（圖10）。結(jié)果表明，1g/L 3%的TCPP@ZIF-8在可見光下反應(yīng)3h，可使NADH 的還原率高達(dá)75.04%，且當(dāng)FateDH∶FaldDH=2∶1 時，甲醛產(chǎn)率為7.74μmol/L。此外，該復(fù)合體系經(jīng)過10 批次重復(fù)使用后，可保留52.93%的催化活性。這是人工光合作用研究中的一次創(chuàng)新，為人工催化體系與多酶固定化體系的結(jié)合提供了實(shí)踐基礎(chǔ)。

圖10 光催化多酶級聯(lián)系統(tǒng)示意圖[82]

3 總結(jié)與展望

糖類是天然的可再生能源，其催化產(chǎn)物具有巨大的應(yīng)用潛力。在過去十幾年里，多酶共固定化技術(shù)迅速發(fā)展，在糖類的催化反應(yīng)中應(yīng)用廣泛，如多糖的水解、功能性寡糖的合成以及糖類下游產(chǎn)品的合成等，越來越受到研究者的關(guān)注。

誠然，多酶共固定化技術(shù)具有諸多優(yōu)勢，不僅使酶分子具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，同時充分發(fā)揮了多酶之間協(xié)同催化的性能，提高了催化效率。然而，需要指出的是，由于糖類的結(jié)構(gòu)繁多，多酶催化體系復(fù)雜，并沒有一種通用的、普適性的方法可供使用，對于某一已知的催化體系，要綜合考慮其實(shí)際情況，理性地選擇合適的方法。此外，多酶共固定化技術(shù)在實(shí)際運(yùn)用中會出現(xiàn)很多問題，如固定化后酶活損失嚴(yán)重、酶與載體結(jié)合不牢固，產(chǎn)物回收率低等。針對以上不足，無論在以后的基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用研究中，應(yīng)注意以下幾個方面：①在固定化過程中，要充分考慮多種因素，選擇一種最佳的固定化方案，以最大限度地保留酶活并提高反應(yīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性；②對于共固定化后傳質(zhì)受限的多酶體系，可為其針對性地選擇合適的載體，充分利用底物通道或微環(huán)境提高級聯(lián)反應(yīng)的催化效率；③若多酶體系中含有固定化細(xì)胞，要設(shè)法改變其操作穩(wěn)定性，以提高整體的操作穩(wěn)定性和重復(fù)使用性；④在一些情況下，可將多種方法聯(lián)合使用以提高固定化酶的性能；⑤靈活利用多種表面分析技術(shù)對固定化過程的有效性進(jìn)行檢測。

目前，多酶共固定化技術(shù)在糖類催化中的工業(yè)應(yīng)用還比較少，主要是因?yàn)槊赋杀颈容^高以及固定化技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用還不夠成熟。在今后，多酶共固定化技術(shù)會面臨更多新挑戰(zhàn)和發(fā)展機(jī)會，相信隨著科學(xué)研究的不斷深入，技術(shù)的不斷優(yōu)化，多酶共固定化技術(shù)將日益成熟完善，并在糖類催化的實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮巨大的作用，為工業(yè)生產(chǎn)帶來一次巨大蛻變。