急性溫度脅迫對雙帶隱帶麗魚免疫指標(biāo)及相關(guān)酶活性的影響

黃成裕，高世科，張家銳，王凌霄，張 碩,2,3

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.長江口水生生物監(jiān)測與保護(hù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

酶是催化生物反應(yīng)的一類特殊的蛋白質(zhì)，生物體中的化學(xué)反應(yīng)絕大部分都是在催化劑的作用下進(jìn)行。酶的活性可以被調(diào)節(jié)，且與不同能量形式的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。在酶系統(tǒng)中，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)等抗氧化酶具有清除生物體活性氧自由基的功能，對增強(qiáng)細(xì)胞防御能力、提高生物體免疫力具有重要作用。而溫度是影響抗氧化酶活性高低的重要因素之一，過高或過低的溫度都會導(dǎo)致酶活性下降。因此，研究急性溫度脅迫下抗氧化酶的變化，可以深入了解生物體對環(huán)境脅迫的響應(yīng)。

雙帶隱帶麗魚()隸屬于輻鰭魚綱(Actinopterygii)鱸形目(Perciformes)麗魚科(Cichlidae)。在我國，雙帶隱帶麗魚具有良好的商業(yè)價(jià)值，近年來隨著生活水平的提高，越來越多人開始嘗試飼養(yǎng)這一體型小、色彩艷麗的魚種，但因其對繁殖和生長環(huán)境要求較高，尤其是對于溫度等環(huán)境因子的適應(yīng)性，國內(nèi)未能形成規(guī)?；庇?，因此絕大部分商品魚依靠進(jìn)口，常因水質(zhì)環(huán)境的不適導(dǎo)致較高的運(yùn)輸損耗，因此價(jià)格居高不下，阻礙了該魚種在國內(nèi)觀賞魚市場的普及和發(fā)展。作為變溫動物的魚類廣泛棲息于不同的溫度環(huán)境中，環(huán)境溫度對其影響更加劇烈。當(dāng)生存水域改變時(shí)，高溫和低溫環(huán)境下都會導(dǎo)致魚類免疫力下降，容易生病甚至死亡。因此，環(huán)境溫度直接影響到雙帶隱帶麗魚的生長和生存，并且雙帶隱帶麗魚的人工養(yǎng)殖過程也會經(jīng)常出現(xiàn)因季節(jié)更替、氣候變化及人為因素等原因?qū)е滤疁爻霈F(xiàn)節(jié)律性或突發(fā)性的溫度驟變，從而對其造成一定程度的高溫或低溫脅迫影響。已有研究表明，麗魚科魚類的棲息水溫在22～32 ℃之間，但目前尚無雙帶隱帶麗魚的急性溫度脅迫和免疫應(yīng)答及酶活性方面的研究。

本試驗(yàn)研究了雙帶隱帶麗魚在急性溫度脅迫環(huán)境中的免疫相關(guān)酶活性變化，分析了急性溫度脅迫對雙帶隱帶麗魚抗氧化及免疫指標(biāo)活性的影響，以期為推動和加深雙帶隱帶麗魚的人工養(yǎng)殖技術(shù)，為優(yōu)化雙帶隱帶麗魚的運(yùn)輸技術(shù)提供重要的參考依據(jù)，為后續(xù)深入研究雙帶隱帶麗魚對環(huán)境的適應(yīng)性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚及暫養(yǎng)條件

2021年4月于遼寧Apisto Family水族工作室購進(jìn)規(guī)格為(3.0±0.3)cm、平均體重(1.5±0.5)g的雙帶隱帶麗魚500尾，隨機(jī)挑選體質(zhì)健壯、規(guī)格均勻、體表干凈無病癥且游動正常的150尾為試驗(yàn)對象。在規(guī)格為0.8 m×0.5 m×0.6 m的水槽中暫養(yǎng)1周。暫養(yǎng)條件設(shè)定為：水溫為26 ℃，pH為7.50±0.15，溶解氧含量高于8 mg/L，暫養(yǎng)用水使用曝氣過的自來水(充氣暴曬3 d)，每周換水1/5。暫養(yǎng)期間按每條雙帶隱帶麗魚體重的10%的投喂足量飼料，飼料采用小型慈鯛科專用餌料(德國莫斯特)，投餌于早上8:00和晚上6:00進(jìn)行，試驗(yàn)開始前24 h停止投喂。光照周期采用12L:12D。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用規(guī)格為0.3 m×0.3 m×0.3 m的方形玻璃水槽，水槽注入25 L預(yù)先曝氣過的自來水，每組水槽放置恒溫設(shè)備和氣動式過濾。試驗(yàn)開始前將水槽遮光封閉處理，試驗(yàn)共三組，試驗(yàn)溫度設(shè)置為20、26、32 ℃(由預(yù)實(shí)驗(yàn)可知，26 ℃為魚體最佳生存溫度，當(dāng)雙帶隱帶麗魚處于22 ℃、30 ℃時(shí)，魚體機(jī)能開始出現(xiàn)下降趨勢，表現(xiàn)為行動力下降，日攝食率、日生長率均開始下降)，其中20 ℃、32 ℃兩組為試驗(yàn)組，26 ℃組為對照，試驗(yàn)開始后,將暫養(yǎng)的雙帶隱帶麗魚隨機(jī)放入3個(gè)溫度組各50尾，試驗(yàn)組勻速升/降溫至32 ℃、20 ℃，對照組保持26 ℃水溫，試驗(yàn)期間暫停投喂。本實(shí)驗(yàn)使用自動控溫系統(tǒng)對各水槽升/降溫，速率為1 ℃/h，直至達(dá)到試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)溫度保持1 d后以相同速率降/升溫至26 ℃進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng),分別在升/降溫試驗(yàn)前及試驗(yàn)后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h進(jìn)行采樣，每次每組取6尾,三組共18尾，試驗(yàn)做2次重復(fù)。

1.3 樣品采集與酶活指標(biāo)測定

將雙帶隱帶麗魚稱重后快速殺死后放入20 mL玻璃勻漿器，按比例加入預(yù)冷的0.65%生理鹽水，冰浴勻漿制成10%的勻漿液，按照試劑盒說明進(jìn)行離心取上清液，最后將其稀釋成不同種酶測試所需的最適濃度，置于-20 ℃冰箱待測。

試驗(yàn)采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定，包括免疫球蛋白M(IgM)測定、酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、SOD、GSH、CAT、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和溶菌酶(Lysozyme,LZM)。其中，組織勻漿酶活性用U/g可溶性蛋白(prot)表示，個(gè)別酶含量單位以試劑盒為準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析，差異的顯著性以<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，運(yùn)用Excel 2020繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 急性溫度脅迫對雙帶隱帶麗魚抗氧化指標(biāo)的影響

2.1.1 ACP活性

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品ACP活性的變化如圖1所示，可以看出，隨著時(shí)間的變化，在20 ℃和32 ℃處理組的ACP活性出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，26 ℃時(shí)各處理組間差異均不顯著；20 ℃組在試驗(yàn)后0 h ACP含量最低，為0.009 3 U/gport；32 ℃組在脅迫6 h時(shí)ACP含量最低，為0.010 8 U/gport，20 ℃組ACP含量變幅較大。在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的ACP活性均在48 h后趨于平衡。

圖1 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的ACP活性變化

2.1.2 ALP活性

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品ALP活性的變化如圖2所示。與ALP活性的變化趨勢一致，在20 ℃和32 ℃處理組的ALP活性出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，26 ℃各處理組差異均不顯著20 ℃組在試驗(yàn)后0 h ALP含量最低，為0.010 4 U/gport；32 ℃組則在脅迫6 h ALP含量最低，為0.003 8 U/gport，32 ℃組ALP變幅較大。但是，在剛開始實(shí)驗(yàn)階段，20 ℃處理組的ALP活性的下降程度不如ACP活性。在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的ALP活性均在24 h后趨于平衡。

圖2 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的ALP活性變化

2.1.3 CAT活性

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品CAT活性的變化如圖3所示。不同于ALP和ACP活性，CAT活性在20 ℃處理組出現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，在32 ℃處理組出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，26 ℃各處理組差異均不顯著；20、32 ℃組CAT最低值均在脅迫6 h時(shí)出現(xiàn)，分別為0.329 4 U/gport、0.968 0 U/gport，32 ℃組恢復(fù)水平相對較差。而在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的CAT活性均是在48 h后趨于平衡。

圖3 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的CAT活性變化

2.1.4 SOD活性

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品SOD活性的變化如圖4所示。SOD活性在20 ℃處理組和32 ℃處理組的變化趨勢一致，均是出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，26 ℃各處理組差異均不顯著；試驗(yàn)后0 h、6 h、12 h時(shí)20 ℃與32 ℃ SOD含量較低。在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的SOD活性在48 h后趨于平衡，但均出現(xiàn)潛在上升的趨勢。

圖4 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的SOD活性變化

2.1.5 GSH含量

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品GSH含量的變化如圖5所示。與MDA含量的變化趨勢一致，GSH含量在20 ℃處理組和32 ℃處理組出現(xiàn)先上升到12 h達(dá)到最高值，而后出現(xiàn)下降的趨勢；在26 ℃時(shí)，試驗(yàn)前后0 h及6～72 h GSH含量變化較為平緩，各處理組差異均不顯著；在脅迫6 h后20 ℃與32 ℃組GSH含量均達(dá)到峰值且相近，分別為63.57 U/gport、60.42 U/gport，隨后隨時(shí)間逐步恢復(fù)。在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的GSH含量均可能在48 h甚至72 h后趨于平衡。

圖5 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的GSH含量變化

2.1.6 MDA含量

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品MDA含量的變化如圖6所示。與酶活性的趨勢不同，MDA含量在20 ℃處理組和32 ℃處理組出現(xiàn)脅迫6 h時(shí)先上升到達(dá)到最高值，而后出現(xiàn)下降的趨勢，兩溫度組峰值分別為28.15 U/gport、23.16 U/gport；26 ℃各處理組差異均不顯著。在所有溫度組下，雙帶隱帶麗魚樣品的MDA含量均是在48 h后趨于平衡。

圖6 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的MDA含量變化

2.2 急性溫度脅迫對雙帶隱帶麗魚免疫能力的影響

2.2.1 LZM活性

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品LZM活性的變化如圖7所示。與MDA含量的變化趨勢一致，LZM活性在20 ℃處理組出現(xiàn)脅迫6 h時(shí)先上升到達(dá)到最高值而后下降的趨勢，峰值為20.35 U/gport，在32 ℃處理組最高值出現(xiàn)在脅迫6 h時(shí)，然后呈下降的趨勢，峰值為18.34 U/gport，26 ℃各處理組差異均不顯著。在所有溫度組下，LZM活性均是在24 h后趨于平衡。

圖7 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的LZM活性變化

2.2.2 IgM含量

溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚樣品IgM含量的變化如圖8所示。在26 ℃處理組下，IgM含量隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)上升趨勢，而在20 ℃處理組和32 ℃處理組下IgM含量在脅迫溫度達(dá)到目標(biāo)溫度后隨時(shí)間呈先下降后上升的趨勢。3個(gè)溫度組的IgM含量隨時(shí)間增加，IgM含量趨于集中，在48 h后均有上升趨勢。

圖8 急性溫度脅迫下雙帶隱帶麗魚的IgM含量變化

3 討論

3.1 急性溫度脅迫對雙帶隱帶麗魚抗氧化指標(biāo)的影響

溫度與魚類的各項(xiàng)生理活動密不可分，水溫變化會對魚類的行為、抗氧化防御系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生間接或直接影響。有研究表明水溫的突變(驟增或驟降)對雙帶隱帶麗魚產(chǎn)生了較強(qiáng)的脅迫作用，打破了魚體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS)，進(jìn)而對魚體造成一定程度的損傷。

SOD和CAT是抗氧化酶防御體系中非常重要的功能酶，聯(lián)合起來擁有清除ROS的能力，其酶活性下降意味著機(jī)體清除ROS的能力下降。在本研究中，20 ℃處理組下SOD和CAT活性隨時(shí)間的變化趨勢與32 ℃處理組基本相同，且恢復(fù)至正常狀態(tài)所需時(shí)間也基本一致，說明與正常溫度的溫差越大，對雙帶隱帶麗魚SOD和CAT活性的影響越大。強(qiáng)俊等在研究溫度與鹽度對吉富品系尼羅羅非魚幼魚生長和肝臟抗氧化酶活性的協(xié)同影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，溫度高于29 ℃時(shí)，吉富品系尼羅羅非魚幼魚SOD和CAT活性明顯下降；在溫度16 ℃時(shí)，SOD和CAT活性最低，與本研究結(jié)果一致。在試驗(yàn)后0-24 h這個(gè)階段，20 ℃和32 ℃處理組的SOD和CAT活性顯著低于26 ℃處理組，因此魚體可以通過提高SOD和CAT活性來應(yīng)對急性溫度變化產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)對魚體的影響。但是在12-24 h這個(gè)時(shí)間段中，32 ℃處理組的CAT活性上升的幅度比SOD活性更大，說明高溫脅迫下雙帶隱帶麗魚體內(nèi)的CAT活性調(diào)控機(jī)制可能比SOD活性更快速。

GSH是一種低分子自由基清除劑，是清除ROS非常重要的非酶抗氧化物質(zhì)，其與SOD和CAT的作用機(jī)理一致，都是清除細(xì)胞中ROS和過氧化氫(HO)。在本實(shí)驗(yàn)雙帶隱帶麗魚在20 ℃和32 ℃處理組的GSH含量的變化趨勢一致，說明高、低脅迫溫度使得雙帶隱帶麗魚處于應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體產(chǎn)生越多的ROS，SOD和CAT活性會下降，使得底物GSH的含量上升，但與SOD和CAT活性的變化趨勢不同點(diǎn)在于，GSH含量是在48h后才達(dá)到平衡。這可能是由于SOD將機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的ROS分解成過多的HO，而CAT未完全將HO分解為氧分子和水，導(dǎo)致GSH作為底物繼續(xù)被GSH-Px消耗，以此清除剩余的HO。

MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用的產(chǎn)物之一，它能加劇細(xì)胞膜的損傷，反映組織細(xì)胞受ROS攻擊的程度，從而間接反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱。盡管MDA在20 ℃和32 ℃處理組的GSH含量的變化趨勢一致，但試驗(yàn)后6～24 h內(nèi)，20 ℃處理組的MDA含量顯著高于32 ℃處理組，說明低溫脅迫對雙帶隱帶麗魚造成的氧化損傷高于高溫脅迫，由此生成大量的SOD和CAT來抵抗過量的ROS。這與謝明媚等和管敏等的研究急性溫度脅迫對銀鯧()幼魚和史氏鱘()幼魚抗氧化和免疫指標(biāo)中的MDA變化趨勢均不同，這可能與魚類的物種、年齡及應(yīng)激時(shí)間等不同有關(guān)。

3.2 急性溫度脅迫對雙帶隱帶麗魚磷酸酶活性的影響

ACP和ALP是兩種參與免疫防御系統(tǒng)的重要水解酶，普遍存在于生物體內(nèi)，可催化各種含磷化合物的水解過程，在生物體抵抗疾病、免疫反應(yīng)和細(xì)胞損傷與修復(fù)過程中起著重要的作用。ACP和ALP活性的降低表明生物體可能在低溫脅迫下機(jī)體生命代謝能力減弱或免疫調(diào)節(jié)功能下降。本研究中，隨著脅迫溫度的變化和時(shí)間的遷移，20 ℃和32 ℃處理組雙帶隱帶麗魚的ACP和ALP活性均呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢，這與白海文等研究溫度對史氏鱘以及金一春等研究濕度對白斑狗魚()免疫功能影響的變化趨勢一致。這表明短時(shí)間內(nèi)(24 h)的高溫或低溫脅迫會顯著抑制雙帶隱帶麗魚體內(nèi)的ACP和ALP活性，出現(xiàn)免疫疲勞，降低機(jī)體的免疫防御能力，而經(jīng)過較長時(shí)間的高、低溫脅迫，雙帶隱帶麗魚的ACP和ALP活性變化趨于與26 ℃處理組一致，說明雙帶隱帶麗魚很有可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫防御能力，使其能夠盡快適應(yīng)這種極端的溫度環(huán)境變化，但這是否對該種魚類之后的行為、生理或代謝水平產(chǎn)生不良影響，有待進(jìn)一步研究。

3.3 急性溫度脅迫對雙帶隱帶麗魚免疫指標(biāo)的影響

LZM是魚體非常重要的免疫因子，它可以破壞革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，從而瓦解細(xì)菌細(xì)胞，其活性與水溫、鹽度等環(huán)境因子密切相關(guān)。本研究中LZM活性在20 ℃和32 ℃處理組的變化趨勢一致，但在試驗(yàn)后0～24 h內(nèi)，20 ℃處理組的LZM活性顯著高于32 ℃處理組，說明低溫脅迫比高溫脅迫更能促使雙帶隱帶麗魚產(chǎn)生更多的LZM，從而形成保護(hù)機(jī)制，對機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生了顯著的抑制作用。這與管敏等和童燕等的研究結(jié)果類似，即隨著溫度和鹽度的增加，史氏鱘血清中的LZM活性先上升后下降。但是，這一保護(hù)機(jī)制也可能與魚種以及脅迫強(qiáng)度有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

IgM是魚體內(nèi)一種重要的免疫球蛋白，是機(jī)體受抗原刺激后最先產(chǎn)生的抗體，其在血液中的含量是評價(jià)魚體免疫應(yīng)答反應(yīng)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本研究中，26 ℃組雙帶隱帶麗魚的IgM含量變化無規(guī)律性，但數(shù)值變動較大，可能是由于應(yīng)激反應(yīng)造成的結(jié)果，20 ℃、32 ℃組呈先降低后升高的趨勢，且隨時(shí)間變化，IgM含量趨于集中，20 ℃處理組的變化幅度更大一些，表明高溫脅迫的作用較為明顯，而低溫脅迫可能會對雙帶隱帶麗魚的免疫功能產(chǎn)生抑制作用。這與謝明媚等、管敏等、何杰等的研究結(jié)果相同。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，高溫或是低溫脅迫下，雙帶隱帶麗魚的ACP、ALP、CAT和SOD顯著降低，GSH、LZM和MDA含量顯著增加，在恢復(fù)培養(yǎng)過程中逐步趨于與對照組相近，環(huán)境變動會影響魚體的抗氧化防御系統(tǒng)和免疫機(jī)能。因此，在24 h之內(nèi)，養(yǎng)殖過程中遇到急性溫度變化時(shí)作出補(bǔ)救措施是著實(shí)有效的，運(yùn)輸過程中保持26 ℃左右的水溫有助于保護(hù)魚類的身體機(jī)能，避免造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。