利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建斑馬魚Hand2基因敲除模型

譚志霞 ，張 健，呂 丹，江志鋼，袁婺洲，吳秀山，葉湘漓

（1. 湖南師范大學(xué) a. 醫(yī)學(xué)院，長沙 410013；b. 生命科學(xué)學(xué)院，長沙 410081； 2. 長沙市第九醫(yī)院檢驗(yàn)科，長沙 410004）

心血管病是我國乃至全球范圍內(nèi)第一位致死、致殘?jiān)颉！吨袊l(wèi)生健康統(tǒng)計(jì)年鑒2021》報(bào)告顯示［1］，我國居民心血管病的患病率處于持續(xù)上升階段，心血管病的現(xiàn)患人數(shù)約為3.3億，每10個成人中至少有2人是心血管病患者。心血管病的疾病負(fù)擔(dān)日漸加重，加強(qiáng)政府主導(dǎo)下的心血管病防治工作刻不容緩。通過研究心臟及血管的發(fā)生發(fā)育規(guī)律，從分子水平闡明心血管病的發(fā)病機(jī)理，對心血管病的基因診斷與新藥研發(fā)、最終利用分子干預(yù)手段根治心血管病等具有重要的理論和實(shí)踐意義。

心臟神經(jīng)脊衍生物表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子2（heart and neural crest derivatives expressed transcript 2，Hand2）是bHLH家族的成員，也稱為dHand、Hed和Thing2，可在人以及鼠、雞、斑馬魚、果蠅等模式動物中表達(dá)［2］。1995年，小鼠的Hand2基因被首次克?。?］；1997年，第一只Hand2基因的傳統(tǒng)基因敲除小鼠模型構(gòu)建成功［4］；2001年，研究人員確認(rèn)Hand2可在成人心臟中表達(dá)［5］。Hand2基因主要與右心室的發(fā)育有關(guān)，在維持右心室祖細(xì)胞和右心室形態(tài)發(fā)生中起關(guān)鍵作用，并參與神經(jīng)嵴衍生的心臟流出道和主動脈弓的發(fā)生過程［6］。Hand2可與Twist1形成異二聚體，Twist1的突變可能導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)先天性疾病，目前Hand2基因異常參與人類心血管疾病發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。

Hand2在進(jìn)化中高度保守，但其在不同物種中的表達(dá)模式存在差異［7］。在小鼠和大鼠的心肌肥厚模型中，Hand2的表達(dá)下調(diào)［8］；而在病理性心肌病患者的心臟中，Hand2的表達(dá)不受影響。有關(guān)Hand基因家族在斑馬魚中的研究目前還不多，斑馬魚的Hand2主要在魚類的側(cè)中胚層表達(dá)，參與心臟、腸道以及神經(jīng)嵴細(xì)胞的形成［9］。另有研究顯示：Gata4在心血管發(fā)育過程中調(diào)節(jié)Hand2的表達(dá)；Hand2的bHLH結(jié)構(gòu)域與Gata4的C末端鋅指結(jié)構(gòu)域相互作用，通過與啟動子結(jié)合激活心臟發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)［10］；Hand2和Gata4與轉(zhuǎn)錄因子Mef2c和Tbx5的組合能夠在體外將成纖維細(xì)胞重新分化為心肌細(xì)胞。由此可見，Hand2可能成為心肌梗死等人類心臟損傷的潛在治療靶點(diǎn)。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了斑馬魚的Hand2基因敲除模型，為后期研究Hand2基因在人類疾病中的作用機(jī)制和新型治療靶點(diǎn)的臨床開發(fā)等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DNA瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物公司；Cycle pure kit（PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒）購自O(shè)MEGA生物公司；RNeasy Mini kit購自Qiagen生物公司；RTPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo fisher生物公司；T7轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega生物公司；PMD18-T試劑盒購自Takara生物公司；DNA高保真酶試劑盒購自Vazyme生物公司；TrueCut Cas9蛋白試劑盒購自Thermo fisher生物公司；大腸桿菌（E. coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞菌種由湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育研究中心保存。

1.2 Hand2基因的打靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

通過生物信息學(xué)網(wǎng)站Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html）分析發(fā)現(xiàn)斑馬魚（Danio rerio）Hand2基因位于斑馬魚的1號染色體上，包含2個外顯子，起始密碼子ATG位于1號外顯子上，在起始密碼子后面的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)打靶位點(diǎn)可提高基因敲除的有效性。打靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)遵循了以下原則：打靶位點(diǎn)堿基長度在18～20 bp左右；前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）區(qū)序列嚴(yán)格為NGG（N可為任意堿基）。通過blast分析找到Hand2的1號外顯子所在的基因組序列。利用生物信息學(xué)網(wǎng)站ZIFIT（http://zifit.partners.org/ZiFiT/）分析1號外顯子的基因組序列，篩選得到了兩個潛在的靶位點(diǎn)，即Hand2-靶1（GTCGCTGTCATGAAGAACCC）和Hand2-靶2（GGGGGCCGGCGCCGTTGGAA）。設(shè)計(jì)并合成Hand2基因打靶位點(diǎn)檢測引物序列，即Hand2-KO-檢測引物F（ACCAAAGCGTACTCCGTCTG）和Hand2-KO-檢測引物R（CGAAATGAGGCCATCTGAAC）。

1.3 Hand2基因的打靶位點(diǎn)的sgRNA引物合成

在設(shè)計(jì)好的靶位點(diǎn)序列之前加上保護(hù)堿基tg和T7啟動子，靶位點(diǎn)之后加上pUC57-gRNA骨架上游序列作為正向引物序列，pUC57-gRNA骨架的下游序列為反向引物。此外通過生物信息學(xué)網(wǎng)站NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)了一對檢測打靶有效性的檢測引物，檢測引物在野生型對照組（wild type，WT）中的目的條帶大小為707 bp。

1.4 Hand2基因打靶g(shù)RNA的mRNA合成

以pUC57-gRNA質(zhì)粒為模板，以上述含有靶序列的gRNA正向引物和反向引物gRNA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到Cas9-Hand2-gRNA的DNA產(chǎn)物，純化回收DNA產(chǎn)物后，再進(jìn)行體外T7不加帽轉(zhuǎn)錄合成2個打靶位點(diǎn)的mRNA，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察到轉(zhuǎn)錄得到的mRNA后，再加入1.5 μL的DNase，37℃水浴消化剩余的未轉(zhuǎn)錄成功的DNA帶，用瓊脂糖凝膠電泳檢測轉(zhuǎn)錄出來的mRNA條帶。

1.5 顯微注射

將上述合成的2個靶位點(diǎn)的gRNA的mRNA與Cas9蛋白各吸1 μL入RNase free-EP管中，按照1∶1∶1的比例混勻，注射到斑馬魚胚胎的Ⅰ-細(xì)胞時(shí)期中，待3 d左右鑒定注射的有效性。

1.6 Hand2基因打靶F0、F1、F2代基因的有效性檢測

收集3 d左右胚胎，分為WT組和Hand2-KO組，每組各收集10顆胚胎，用堿裂解法提取基因組。以提取后的基因組作為模板，用上述合成的一對檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將上述顯示為敲除成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，并送公司測序，陽性結(jié)果顯示在靶位點(diǎn)附近開始出現(xiàn)雙峰。將此PCR純化回收產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上進(jìn)行轉(zhuǎn)化，待長菌后隨機(jī)挑取5個單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，菌液送公司進(jìn)行測序。

將Hand2-KO斑馬魚F0代胚胎養(yǎng)育3個月左右至成熟后剪尾，每尾魚的剪尾組織單獨(dú)放一個EP管，提取基因組，按上述方法篩選出有陽性突變的F0代成魚。

將鑒定出陽性突變的F0代成魚分別與WT雜交，獲得F1代，檢測并篩選出F1代Hand2-KO突變嵌合體。將相同堿基突變的F1代雄性嵌合體與F1代雌性嵌合體自交，可獲得F2代純合突變體，然后提取基因組并進(jìn)行PCR和測序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hand2基因打靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)

利用生物信息學(xué)網(wǎng)站設(shè)計(jì)斑馬魚Hand2基因的打靶位點(diǎn)，如圖1和圖2。

圖1 Hand2基因敲除2個靶位點(diǎn)位置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the location of the two target sites for the knockout of the Hand2 gene

圖2 Hand2基因敲除打靶位點(diǎn)及檢測引物在基因組中的位置示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the location of the Hand2 gene knockout target site and detection primer in genome上述序列為Hand2基因的部分序列，綠色字體為5' UTR序列，藍(lán)色字體為外顯子序列，灰色字體為內(nèi)含子，紅色高亮為起始密碼子，綠色高亮為Hand2基因敲除的靶位點(diǎn)1，黃色高亮為Hand2基因敲除的靶位點(diǎn)2序列，橙色字體為3' UTR序列，藍(lán)色高亮為正反檢測引物。The above sequence is a partial sequence of the Hand2 gene, the green font is the 5' UTR sequence, the blue font is the exon sequence, the gray font is the intron, the red highlight is the start codon, and the green highlight is the Hand2 gene knockout target site 1, the yellow highlight is the knockout target site 2 sequence of the Hand2 gene, the orange font is the 3' UTR sequence, and the blue highlight is the forward and reverse detection primers.

2.2 Hand2基因sgRNA的合成

設(shè)計(jì)gRNA的正反向引物序列。在設(shè)計(jì)好的靶位點(diǎn)序列之前加上保護(hù)堿基tg和T7啟動子，靶位點(diǎn)之后加上pUC57-gRNA（又名p42250質(zhì)粒，為環(huán)狀質(zhì)粒，見圖3）骨架上游序列，作為正向引物序列，pUC57-gRNA骨架的下游序列為反向引物（圖4）。Hand2-KO-靶1的正向引物為tgTAATACGACTCACTATAgtcgctgtcatgaagaacccGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；Hand2-KO-靶2的正向引物為tgTAATACGACTCACTATAgggggccggcgccgttggaaGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；gRNA的反向引物（gRNA-R）為aaGCACCGACTCGGTGCCACT；其中tg為保護(hù)堿基，T7啟動子序列為TAATACGACTCACTATA，橫線部分為打靶位點(diǎn)序列，GTTTTAGAGCTAGAAATAGC為gRNA骨架序列上游序列；gRNA-R為通用反向引物，序列中aa為保護(hù)堿基。

圖3 pUC57-gRNA質(zhì)粒示意圖Fig. 3 Schematic diagram of pUC57-gRNA plasmid

圖4 gRNA骨架序列示意圖Fig. 4 Schematic diagram of gRNA scaffold sequence紅色下橫線部分為gRNA骨架序列的上游引物序列；藍(lán)色下橫線為gRNA骨架序列的下游引物序列，作為gRNA的反向引物（gRNA-R）。The red underline is the upstream primer sequence of the gRNA backbone sequence; the blue underline is the downstream primer sequence of the gRNA backbone sequence, which is used as the reverse primer (gRNA-R) of the gRNA.

按照上述1.4的方法進(jìn)行2個打靶位點(diǎn)的gRNA的合成，包括PCR、產(chǎn)物純化回收和cDNA轉(zhuǎn)錄為mRNA，轉(zhuǎn)錄出來的mRNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示。

圖5 Cas9-Hand2-gRNA的電泳檢測Fig. 5 Electrophoresis detection of Cas9-Hand2-gRNA （a）Cas9-Hand2-gRNA的DNA產(chǎn)物純化回收的電泳檢測；（b）Cas9-Hand2-gRNA的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的電泳檢測；（c）Cas9-Hand2-gRNA的mRNA純化回收后加DNase消化后的電泳檢測。(a) Electrophoresis detection of the purified and recovered DNA product of Cas9-Hand2-gRNA; (b) Electrophoresis detection of Cas9-Hand2-gRNA DNA being transcribed into mRNA; (c) Electrophoresis detection of DNase digested mRNA of Cas9-Hand2-gRNA after purification and recovery.

2.3 Hand2基因打靶的有效性檢測分析

2.3.1Hand2-KO-F0代胚胎的打靶有效性檢測

將上述合成的2個靶位點(diǎn)的gRNA的mRNA與Cas9蛋白按照1∶1∶1的體積比混勻，注射到Ⅰ-細(xì)胞時(shí)期的斑馬魚胚胎中，孵育72 h左右，收集3管，每管隨機(jī)挑取10顆，其中1管為野生型胚胎，進(jìn)行基因敲除的有效性鑒定（圖6）。

圖6 Hand2-KO-F0代注射胚胎的有效性電泳檢測Fig. 6 Electrophoresis detection of the validity of Hand2-KO-F0 generation injected embryos

為了進(jìn)一步確定胚胎敲除的有效性，將上述顯示為敲除成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，并送公司測序，結(jié)果顯示，其在靶位點(diǎn)附近開始出現(xiàn)雙峰。隨后，將此PCR純化回收產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，菌液送公司測序。本研究挑了5個單克隆送測序，其中有4個單克隆是陽性結(jié)果。測序結(jié)果顯示：1號單克隆在1號靶位點(diǎn)附近插入9個堿基的同時(shí)缺失6個堿基；2號單克隆在1號靶位點(diǎn)附近有4個堿基插入的同時(shí)有5個堿基缺失，在2號靶位點(diǎn)附近有19個堿基缺失；3號單克隆在1號靶位點(diǎn)附近有21個堿基插入的同時(shí)有1個堿基缺失，在2號靶位點(diǎn)附近有5個堿基的缺失；4號單克隆在1號靶位點(diǎn)附近有9個堿基插入，在1號和2號靶位點(diǎn)附近有170個堿基缺失（圖7）。

圖7 Hand2-KO-F0代注射胚胎的有效性檢測測序結(jié)果Fig. 7 Sequencing results of the effectiveness of the Hand2-KO-F0 generation injected embryos

2.3.2Hand2-KO-F0代成魚打靶的有效性檢測

Hand2-KO-F0代胚胎在培養(yǎng)過程中死亡率很高，培養(yǎng)至3個月左右性成熟后剩余6尾魚。對其剪尾并提取基因組，進(jìn)行有效性檢測。圖8a結(jié)果顯示，未見明顯陽性條帶，但不能排除是否有小片段缺失。圖8b結(jié)果顯示，注射組6號斑馬魚在約400 bp處有較弱的陽性條帶，可能為突變嵌合體。

圖8 Hand2-KO-F0代成魚的有效性電泳檢測Fig. 8 Electrophoresis detection of the validity of Hand2-KO-F0 generation adult fish（a）1～4號Hand2-KO-F0代成魚剪尾電泳檢測；（b）5～6號Hand2-KO-F0代成魚剪尾電泳檢測。M：DNA Marker；WT：野生型對照組。 (a) Electrophoresis detection of clipped tail of Hand2-KO-F0 No. 1～4 adult fish; (b) Electrophoresis detection of clipped tail of Hand2-KO-F0 No. 5～6 adult fish. M: DNA Marker; WT: Wild type as control.

2.3.3Hand2-KO-F2代胚胎及成魚打靶有效性檢測

將F0代突變嵌合體斑馬魚成魚分別與野生型斑馬魚雜交，得到F1代個體，檢測后篩選F1代嵌合體自交，獲得F2代純合突變體，進(jìn)行鑒定。圖9a結(jié)果顯示，F(xiàn)2代胚胎1號和2號管均出現(xiàn)目的條帶。圖9b結(jié)果顯示，F(xiàn)2代成魚中13號和21號個體在400 bp處發(fā)現(xiàn)較弱的陽性條帶。

圖9 Hand2-KO-F2代的有效性電泳檢測Fig. 9 Electrophoresis detection of the validity of Hand2-KO-F2 generation（a）Hand2-KO-F2代胚胎的有效性電泳檢測；（b）Hand2-KO-F2代成魚的有效性電泳檢測。M：DNA Marker；WT：野生型對照組。(a) Electrophoresis detection of the validity of Hand2-KO-F2 generation embryos; (b) Electrophoresis detection of the validity of Hand2-KO-F2 generation adult fish. M: DNA Marker; WT: Wild type as control.

3 討論

斑馬魚是研究心臟發(fā)育遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)的經(jīng)典動物模型之一，可以通過遺傳修飾來模擬人類疾病［11］。斑馬魚的體型小，產(chǎn)卵量大，養(yǎng)殖成本低，體外受精和發(fā)育，早期胚胎透明，易于觀察心臟和血管的形態(tài)變化以及血流特點(diǎn)［12-13］。在發(fā)育的早期，斑馬魚的生存不依賴于循環(huán)系統(tǒng)，即使患有嚴(yán)重心臟缺陷的胚胎也能夠存活，因而能夠用于研究哺乳動物模型中無法適用的基因突變類型，尤其是某些致死性心血管疾病的研究［14］。CRISPR/Cas9是繼鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc-finger nuclease，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease，TALEN）之后出現(xiàn)的第三代基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，現(xiàn)已在多種模式生物中實(shí)現(xiàn)了DNA序列的點(diǎn)突變、大片段基因的敲除以及外源基因的插入等基因修飾［15-17］。憑借著成本低廉、操作方便、效率高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，CRISPR/Cas9迅速風(fēng)靡全球的實(shí)驗(yàn)室，成為生命醫(yī)學(xué)研究的重要技術(shù)，并逐漸應(yīng)用于臨床疾病的診斷及治療［18-20］。本研究中，斑馬魚Hand2基因敲除F0代胚胎基因打靶的效能是很高的，隨機(jī)挑取的5個單克隆就有4個單克隆出現(xiàn)堿基突變，而且有小片段的缺失、插入，也有大片段的缺失。但是在后期的培育過程中，斑馬魚的死亡率很高，F(xiàn)0代突變嵌合體培養(yǎng)至3個月左右性成熟時(shí)僅存活6尾魚，直接影響到了F1代突變嵌合體和F2代純合體的篩選與培育，這可能與斑馬魚Hand2基因的種屬特異性導(dǎo)致基因編輯后不易穩(wěn)定遺傳、樣本基數(shù)不足等因素有關(guān)。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了斑馬魚Hand2基因敲除品系，在斑馬魚胚胎水平進(jìn)行了Hand2基因的敲除，篩選獲得了穩(wěn)定遺傳的F2代突變純合體，為后期的功能研究奠定了重要的基礎(chǔ)。