四逆散對(duì)應(yīng)激性抑郁大鼠血清IL-1β及海馬組織5-HT 水平的影響*

姚春櫛，覃燕瓊，顏凡棋，賴 燕，張青萍

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

抑郁癥是目前臨床常見的精神障礙性疾病，主要表現(xiàn)為情緒低下、對(duì)生活沒有興趣、悲觀自責(zé)等，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)結(jié)束生命的行為。近年來，抑郁癥的患病率日漸上升［1］。抑郁癥已經(jīng)嚴(yán)重危害著人類的生命健康，但其發(fā)病機(jī)制不明確，目前仍是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。而針對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、炎癥、海馬神經(jīng)元損傷等學(xué)說，對(duì)抑郁癥進(jìn)行干預(yù)的西藥類藥物多具有起效緩慢、治愈率低、性功能障礙、心臟肝腎毒性等不良反應(yīng)［2］，因此，對(duì)抗抑郁藥物的研究止步不前［3］，從天然中藥中開發(fā)成為一個(gè)熱門方向［4］。大量研究表明，抑郁癥發(fā)生與下丘腦-垂體-腎上腺（The hypothalamic-pituitaryadrenal axis，HPA）軸失調(diào)密切相關(guān)，HPA 軸能夠調(diào)控釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）。而神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）則在HPA軸扮演著重要角色，它可以興奮性調(diào)節(jié)CRH的釋放［5-6］，故5-HT在情緒和精神調(diào)節(jié)方面具有重要作用。抑郁癥的另一病理機(jī)制為炎癥造成的神經(jīng)受損［7］，白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎癥因子的釋放可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［8］，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，有明顯的促神經(jīng)發(fā)生作用，抗炎可能作為治療抑郁癥的一種新途徑。

四逆散出自《傷寒論》，由柴胡、枳實(shí)、白芍、甘草等藥物組成，具有透邪解郁，疏肝理脾的功效，是疏肝理脾的古方。目前四逆散、四逆散加味方及其類方仍在臨床廣泛使用，有著明顯的抗抑郁效果。抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”范圍，中醫(yī)認(rèn)為本病因情而郁，乃至氣血失調(diào)，病于肝，及于心脾，治法理應(yīng)以疏肝解郁為關(guān)鍵?；谥嗅t(yī)疏肝健脾理論治療抑郁癥的證候研究成為從肝論治情志疾病研究的核心內(nèi)容［9］，因此本研究從中醫(yī)理論出發(fā)，觀察四逆散對(duì)應(yīng)激性抑郁大鼠行為學(xué)變化、血清IL-1β及海馬組織中5-HT 含量的影響，進(jìn)一步探討四逆散治療抑郁癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性清潔型SD 大鼠50 只，體質(zhì)量200～250 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（桂）2019-0002。飼養(yǎng)條件：實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所位于廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，所有動(dòng)物均于SPF 條件下飼養(yǎng)，溫度恒定于25～27℃，相對(duì)濕度維持在45%～55%，保證空氣流動(dòng)正常，飼料為標(biāo)準(zhǔn)固體混合無菌飼料，飲水為高壓滅菌蒸餾水，所有動(dòng)物均可自由攝食飲水。

1.2 藥品與試劑四逆散，藥物組成：柴胡10 g，甘草6 g，枳實(shí)15 g，芍藥10 g。藥材均購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，按一定比例用開水兌換成每毫升含4.25 g四逆散的溶液。鹽酸氟西汀分散片（禮來蘇州制藥有限公司，國藥準(zhǔn)號(hào)H20130512，規(guī)格：20 mg/片），生理鹽水配成濃度為0.2 g/L 的溶液。ELISA 檢測(cè)大鼠5-羥色胺酶聯(lián)免疫分析試劑盒（購于廣西南寧市晶厚生物試劑經(jīng)營(yíng)部，批號(hào)：CSB-E08364r）測(cè)定大鼠海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的含量，大鼠IL-1β試劑盒（廣西南寧市晶厚生物試劑經(jīng)營(yíng)部，批號(hào)：20180725）測(cè)定大鼠血清IL-1β含量。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器Ultmit 3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo 公司），TSQ ALtis 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Thermo公司），1-1SPK型高速冷凍離心機(jī)（美國Sartorius 公司）；Tissuelyser-48型組織勻漿器（上海凈信科技有限公司）、BHC-1300ⅡB2生物安全柜［（蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司）］、ProBlot 12 雜交箱（美國Labnet）、HQ-34CCS型純水儀（河北華清環(huán)境科技）、超低溫冷凍儲(chǔ)存箱（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司）、制冰機(jī)、UV-690 型紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)有限公司）；DNP-9022 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精其）、PowerPac型電泳儀［伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司］；自制敞箱（底面由面積40 cm×40 cm 的25塊正方形組成，高40 cm，內(nèi)壁和底面為黑色）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模方法 參考于林等［10-13］的造模方法并加以改進(jìn)，包括斷食24 h；禁水24 h；困于空瓶中1 h；整夜照明；夾尾5 min；50℃熱水刺激10 min；強(qiáng)迫在冰水游泳30 min；束縛3 h；點(diǎn)擊足底10 次等。每日隨機(jī)安排1 種應(yīng)激方式，每種刺激被采用次數(shù)不超過4 次，并且同一種刺激方式不得連續(xù)使用。實(shí)驗(yàn)持續(xù)28天，第28天的應(yīng)激處理為禁水24 h。造模成功表現(xiàn)：大鼠出現(xiàn)不同程度的眼瞼下垂、飲食及活動(dòng)減少，體質(zhì)量下降、弓背緊張、大便稀爛等情況。

1.4.2 分組及給藥 雄性清潔型SD 大鼠50 只，正常喂養(yǎng)7 天使大鼠適應(yīng)環(huán)境后按隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組，模型組，四逆散組高、低劑量組，氟西汀組，每組10只，每籠5只飼養(yǎng)。空白組正常喂養(yǎng)，其余組適應(yīng)環(huán)境后均采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性應(yīng)激的方法進(jìn)行抑郁模型造模，接受28 天不同應(yīng)激。造模同時(shí)各組開始給藥，四逆散高、低劑量組分別給予四逆散12.8、3.5 g/kg灌胃，氟西汀組予1.8 mg/kg鹽酸氟西汀分散片溶液灌胃。空白組及模型組予以同體積的生理鹽水灌胃，即每天20 mL/kg。各組連續(xù)給藥28天。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 體質(zhì)量 記錄各組大鼠的體質(zhì)量，比較各組體質(zhì)量變化的差異。

1.5.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 觀察各只大鼠的敞箱行為。底面由面積為40 cm×40 cm的25塊正方形組成，高40 cm，內(nèi)壁和底面為黑色。將大鼠放在敞箱中央格，記錄3 min 內(nèi)大鼠穿越方格數(shù)，穿越每個(gè)格子為1分（至少三爪進(jìn)入1格即為穿越），直立次數(shù)得分（雙前肢抬起次數(shù)），每次抬起距離地面1 cm 以上記1分，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5.3 糖水消耗實(shí)驗(yàn) 大鼠對(duì)糖水的喜好程度能反應(yīng)大鼠內(nèi)源性快感缺失情況。實(shí)驗(yàn)前大鼠予糖水適應(yīng)，于實(shí)驗(yàn)第0、14、28 天進(jìn)行糖水消耗實(shí)驗(yàn)，在進(jìn)行糖水實(shí)驗(yàn)前24 h，對(duì)各組大鼠禁水禁食，將大鼠的飲用水更換成1 瓶1%濃度的蔗糖水和1 瓶自來水，每瓶150 mL，做好稱量計(jì)算，1 h 后撤回2 瓶水并記錄所有瓶的剩余數(shù)值，做差值計(jì)算出糖水消耗量，計(jì)算總液體消耗、糖水消耗、糖水偏愛（糖水消耗/總液體消耗×100%），進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.5.4 IL-1β水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉后取腹主動(dòng)脈血，取上層血清并保存于-80℃冰箱保存，室溫下充分解凍后，根據(jù)ELISA 檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)大鼠血清IL-1β的濃度。

1.5.5 5-HT 水平 采血后將大鼠斷頭處死，快速剝離腦海馬，4℃生理鹽水清洗并用濾紙吸干水分，迅速放置液氮冷凍保存。大鼠海馬組織以10%勻漿，10 mg與100 mL生理鹽水勻漿，嚴(yán)格按照ELISA 試劑說明書操作，測(cè)定海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析；方差齊時(shí)采用Post Hot 方法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Tamhane's T2 方法檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量給藥14、28 天后，與空白組比較，其余各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢（P＜0.5）；與模型組比較，氟西汀組、四逆散高劑量組體質(zhì)量顯著增加（P＜0.5）。給藥28天后，與氟西汀組比較，四逆散高劑量組體質(zhì)量增加明顯（P＜0.5）。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較（±s） g

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較（±s） g

注：△表示與空白組比較，P＜0.01；▲表示與模型組比較，P＜0.05；○表示與氟西汀組比較，P＜0.05

組別空白組模型組氟西汀組四逆散高劑量組四逆散低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10給藥前0天214.61±9.42 216.89±7.66 213.41±7.26 212.94±9.86 215.03±11.81給藥14天后269.02±14.42 234.4±11.66△247.66±12.51△▲261.35±8.6△▲241.86±12.36△給藥28天后321.15±12.72 248.35±10.36△278.39±14.76△▲306.17±13.52△▲○256.24±14.51△

2.2 曠場(chǎng)行為計(jì)分給藥14、28 天后，與空白組比較，其余各組大鼠運(yùn)動(dòng)計(jì)分明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組、四逆散高劑量組水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)計(jì)分顯著增加（P＜0.5）。給藥28天后，與氟西汀組比較，四逆散高劑量組水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)計(jì)分較多（P＜0.5）。見表2。

表2 各組大鼠不同給藥時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)計(jì)分比較（±s） 分

表2 各組大鼠不同給藥時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)計(jì)分比較（±s） 分

注：△表示與空白組比較，P＜0.01；▲表示與模型組比較，P＜0.05；○表示與氟西汀組比較，P＜0.05

組別空白組模型組氟西汀組四逆散高劑量組四逆散低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10水平運(yùn)動(dòng)0天32.4±13.2 35.2±12.6 33.9±9.1 32.6±11.6 35.3±8.2 14天34.5±7.6 12.6±4.3△23.3±5.3△▲28.7±8.1△▲15.3±5.4△28天30.7±8.8 6.8±3.4△28.1±9.2△▲35.2±10△▲○18.7±9.5△▲垂直運(yùn)動(dòng)0天7.7±4.3 6.4±2.8 6.9±3.6 6.8±2.7 7.3±3.8 14天5.2±2.8 3.5±2.0△4.1±1.7△5.3±2.8▲○3.7±2.3△▲28天6.3±2.7 1.7±1.3△4.5±2.4△▲7.6±3.1△▲○4.4±3.3△

2.3 糖水偏好給藥14、28 天后，與空白組比較，其余各組大鼠糖水偏好率明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組，四逆散高、低劑量組糖水偏好率顯著增加（P＜0.05）。給藥28 天后，與氟西汀組比較，四逆散高劑量組糖水偏好率明顯增多（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)糖水偏好比較（±s） %

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)糖水偏好比較（±s） %

注：△表示與空白組比較，P＜0.01；▲表示與模型組比較，P＜0.05；○表示與氟西汀組比較，P＜0.05

組別空白組模型組氟西汀組四逆散高劑量組四逆散低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10給藥前0天81.76±9.19 83.35±7.43 82.85±8.32 80.74±7.71 81.59±9.16給藥14天后80.65±7.51 47.32±6.95△51.92±10.01△▲59.83±9.4△▲○48.67±6.1△▲給藥28天后79.53±5.43 42.82±4.53△74.94±7.52△▲81.71±7.06△▲○56.19±8.72△▲

2.4 血清IL-1β、海馬組織5-HT水平與空白組比較，模型組、四逆散低劑量組血清IL-1β水平明顯升高（P＜0.05），海馬組織5-HT 水平明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組、四逆散高劑量組血清IL-1β水平明顯下降（P＜0.05），海馬組織5-HT水平明顯升高（P＜0.05）；與四逆散高、低劑量比較，氟西汀組血清IL-1β水平下降（P＜0.05），海馬組織5-HT 水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，四逆散低劑量組血清IL-1β、5-HT 水平，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清IL-1β、海馬組織5-HT水平比較（±s）

表4 各組大鼠血清IL-1β、海馬組織5-HT水平比較（±s）

注：△表示與空白組比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，P＜0.05；○表示與四逆散高、低劑量組比較，P＜0.05

組別空白組模型組氟西汀組四逆散高劑量組四逆散低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 IL-1β（pg/mL）59.12±7.55 88.37±9.48△61.29±8.18▲○73.62±6.92▲84.57±5.69△5-HT（ng/g）196.91±22.19 98.43±18.28△189.52±15.65▲○180.49±17.17▲152.71±16.22△

3 討論

目前醫(yī)學(xué)仍未能夠完全闡明抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，較一致公認(rèn)抑郁癥發(fā)生的主要原因是HPA 軸失調(diào)，HPA 軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要部分，參與多種控制應(yīng)激的反應(yīng)，并能夠調(diào)節(jié)消化、免疫系統(tǒng)、心情和情緒等許多身體活動(dòng)。HPA 調(diào)控和釋放CRH，并影響促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）的生成和分泌。而5-HT 是CRH 的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)［14-15］，5-HT 含量減少影響CRH的釋放，使得人體激素失衡，故5-HT及其受體在HPA軸反饋調(diào)節(jié)中能夠起到重要作用［16-17］。研究表明，海馬區(qū)是5-HT 能神經(jīng)元胞體投射到的初級(jí)腦區(qū)靶目標(biāo)之一［18］。研究表明，海馬組織5-HT 的含量可直接反映出HPA 軸的情況，5-HT 在人的情緒中扮演著重要的角色，它參與人體情緒、睡眠等多種基礎(chǔ)生物的功能調(diào)節(jié)［19］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT 水平含量的多少可影響情緒，同時(shí)會(huì)對(duì)大腦中其他遞質(zhì)如DA 等的活動(dòng)造成影響，引發(fā)抑郁癥［20］。

炎癥反應(yīng)是近些年發(fā)現(xiàn)的抑郁癥相關(guān)病理之一。炎癥因子作為調(diào)控人體神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的重要因子，在人體內(nèi)能夠起到調(diào)控免疫應(yīng)答生物活性的作用。炎癥反應(yīng)的過程中會(huì)釋放炎癥因子，大量炎癥因子會(huì)損害神經(jīng)元、突觸，對(duì)神經(jīng)元的功能及突觸的可塑性造成影響，產(chǎn)生抑郁行為［21-22］。IL-1β作為一種炎癥因子，關(guān)于其導(dǎo)致抑郁發(fā)生的機(jī)理，有以下相關(guān)研究：IL-1β可能通過SSH1/Cofilin/F-actin 信號(hào)通路介導(dǎo)CUMS 大鼠mPFC 部位突觸可塑性的發(fā)生［23］；IL-1β能夠上調(diào)5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA 和蛋白水平，使突觸間隙5-HT濃度降低［24］；IL-1β等炎癥因子通過介導(dǎo)p38MAPK的信號(hào)通路能夠快速啟動(dòng)5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體，合成5-HT減少［25］。臨床研究［26］表明，抑郁癥患者血液IL-1β水平普遍升高。

中醫(yī)理論認(rèn)為，郁證的主要病機(jī)為情志所傷，肝氣郁結(jié)，使肝失輸泄、脾失健運(yùn)、心失所養(yǎng)，臟腑陰陽氣血失調(diào)。臨床上中醫(yī)藥治療抑郁癥多從肝論治，四逆散是調(diào)和肝脾的代表方，方中柴胡為君藥，不僅疏解肝郁，而且能升清陽，使得郁熱外透；芍藥為臣藥，養(yǎng)血斂陰，與柴胡相配，一升一斂，解郁熱而不傷陰；枳實(shí)為佐藥，行氣散結(jié)，使氣機(jī)更為舒暢；炙甘草緩急和中，調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，具有透邪解郁、疏肝理脾之功效。臨床和實(shí)驗(yàn)研究［27］均證明四逆散抗抑郁取得良好效果，并且發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者大腦神經(jīng)元再生減少與炎癥因子含量密切相關(guān)，四逆散可減少炎癥因子的釋放，增強(qiáng)細(xì)胞免疫力，調(diào)節(jié)HPA 軸，達(dá)到抗抑郁目的。亦有研究［28-29］證明，加味四逆散能使大鼠海馬及前額葉皮質(zhì)5-HT 及其受體含量顯著升高，從而改善抑郁狀態(tài)。但因中藥成分自身的復(fù)雜性與抑郁癥發(fā)病機(jī)制仍不明確，四逆散抗抑郁的機(jī)制未能確切。

本研究通過慢性不可預(yù)性溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)方式建立抑郁大鼠模型，觀察四逆散對(duì)抑郁模型大鼠行為學(xué)改變、血清IL-1β、海馬組織5-HT含量變化的影響。結(jié)果顯示，與模型組相比，氟西汀組、四逆散高劑量組在體質(zhì)量、行為學(xué)、糖水偏愛情況方面明顯改善，但與氟西汀組相比，四逆散高劑量組表現(xiàn)更為優(yōu)勢(shì)；與模型組相比，氟西汀組、四逆散高劑量組血清IL-1β明顯下降，海馬組織5-HT 含量明顯增多，表明四逆散可以有效下調(diào)CUMS 抑郁模型大鼠血清IL-1β含量，提高海馬組織5-HT 表達(dá)水平，這可能是四逆散抗抑郁作用的機(jī)制。但因本實(shí)驗(yàn)具有局限性，未能深入研究四逆散抗抑郁作用的具體信號(hào)通路機(jī)制，有待進(jìn)一步研究四逆散調(diào)節(jié)炎癥因子、神經(jīng)遞質(zhì)的作用靶點(diǎn)。