Tricellulin在結(jié)直腸癌中表達(dá)的臨床意義及其與血管生成的關(guān)系*

李夢(mèng)詩(shī)，張金秀，覃蒙斌，廖存，孫娟，吳晴茹，黃杰安△

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 廣西南寧 530007

2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科 廣西南寧 530021

國(guó)際癌癥研究中心2020年的研究數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌是全球第三大癌癥，其死亡人數(shù)占所有癌癥死亡人數(shù)的9.4%，成為癌癥死亡的第二大原因[1]。由于大部分患者確診時(shí)已為癌癥晚期，因此結(jié)直腸癌患者5年生存率較低[2]。血管生成是導(dǎo)致結(jié)直腸癌高死亡率和不良預(yù)后的主要原因之一，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）是刺激腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子[3-4]。VEGF促進(jìn)血管生成的過(guò)程涉及許多蛋白和信號(hào)通路，如PI3K-AKT和MAPK信號(hào)通路等[5-6]。目前靶向VEGF的抗血管生成治療可使更多的結(jié)直腸癌患者獲益，但仍然有一部分患者對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性[7]，因此血管生成的其他可能機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。三細(xì)胞緊密連接蛋白（tricellulin）作為緊密連接相關(guān)MARVEL蛋白家族中的一員，主要分布在三個(gè)細(xì)胞連接處[8]，在調(diào)控細(xì)胞膜的通透性以及大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[9]。有研究表明tricellulin的異常表達(dá)與扁桃體鱗狀細(xì)胞癌[10]、肝癌[11]、膽管癌[12]、胰腺癌[13]等的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。李思漫等[14]研究表明，tricellulin在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，提示tricellulin與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。緊密連接蛋白家族中的其他成員如ZO-1、occludin和claudin-5等與血管生成密切相關(guān)[15-16]，但tricellulin與結(jié)直腸癌血管生成的關(guān)系尚不清楚。本研究通過(guò)分析人結(jié)直腸癌組織中tricellulin、VEGF的表達(dá)情況及其與微血管密度（microvascular density，MVD）的相關(guān)性，探索tricellulin在結(jié)直腸癌中表達(dá)的臨床意義及其與血管生成的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年3月至2013年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科收治的21例結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象，收集外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（距離癌組織大于10 cm）標(biāo)本各21例?；颊吣挲g25～76歲，平均（56.0±14.0）歲；男性12例，女性9例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期9例，Ⅲ+Ⅳ期12例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者10例。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞18歲，性別不限；（2）經(jīng)組織病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前接受抗腫瘤治療（放療、化療、免疫治療或靶向治療）；（2）患者臨床病理資料不完整；（3）合并有其他惡性腫瘤；（4）伴有其他腸道器質(zhì)性疾病。

1.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)

組織標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度約為4 μm），并將切片貼附于載玻片上。將制好的玻片置于65℃恒溫烘箱中烘烤2 h，再浸泡于二甲苯中脫蠟，然后依次置于100%、95%、85%、75%梯度乙醇中水化，用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)10 min，接著用3% H2O2室溫孵育15 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5 min。滴加山羊血清室溫封閉15 min后，加入一抗（tricellulin濃度為1:100，VEGF濃度為1:100，CD34濃度為1:200）4℃恒溫孵育過(guò)夜。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗。第二天室溫復(fù)溫1 h，用PBS洗滌3次后加入二抗于37℃恒溫孵育15 min。然后，用PBS洗滌3次后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素孵育15 min，洗滌3次后加入DAB顯色2 min，清水沖洗干凈后再用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核5 min，最后，中性樹(shù)膠封片。通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況，并進(jìn)行MVD計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)使用的主要試劑有：tricellulin多克隆抗體（Sigma-Aldrich，美囯），VEGF多克隆抗體（Proteintech Group，美國(guó)），CD34抗體（北京傲銳東源生物公司，中國(guó)），免疫組化SP試劑（北京中杉金橋公司，中國(guó)），DAB顯色試劑盒、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液和蘇木精（北京索萊寶生物公司，中國(guó)）。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）tricellulin以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染色呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，VEGF以細(xì)胞質(zhì)染色呈黃色或棕色為陽(yáng)性細(xì)胞。采用半定量法結(jié)合細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例判定表達(dá)結(jié)果[17]。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。將上述兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為陰性（-），1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中度陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），以（-）和（+）定義為陰性表達(dá)，以（++）和（+++）定義為陽(yáng)性表達(dá)。（2）MVD計(jì)數(shù)采用Weidner法[18]，計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：任何可被CD34染成棕黃色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，與鄰近血管、腫瘤細(xì)胞或其他組織之間存在明顯分隔的視為1個(gè)微血管。于顯微鏡低倍鏡下（×100）在找到微血管密集區(qū)域，然后在高倍鏡下（×400）計(jì)數(shù)5個(gè)視野的微血管數(shù)，取平均值。所有切片均采用雙盲法閱片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用[n(%)]或（n）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。等級(jí)資料采用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中tricellulin、VEGF表達(dá)情況及MVD比較

Tricellulin主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，細(xì)胞膜上有少量表達(dá)，VEGF在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，CD34在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，且這三者在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

結(jié)直腸癌組織中tricellulin、VEGF陽(yáng)性表達(dá)比例均高于癌旁正常組織，MVD大于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中tricellulin、VEGF表達(dá)情況及MVD比較

2.2 結(jié)直腸癌組織中tricellulin與VEGF表達(dá)情況的相關(guān)性分析

結(jié)直腸癌組織中tricellulin與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.79，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 結(jié)直腸癌組織中tricellulin與VEGF表達(dá)情況的相關(guān)性分析

2.3 結(jié)直腸癌組織中tricellulin、VEGF的表達(dá)情況與MVD的關(guān)系

Tricellulin陽(yáng)性表達(dá)、VEGF陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中的MVD分別大于tricellulin陰性表達(dá)、VEGF陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 結(jié)直腸癌組織中tricellulin和VEGF的表達(dá)情況與MVD的關(guān)系

2.4 Tricellulin、VEGF的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

Tricellulin、VEGF的表達(dá)與患者年齡、性別無(wú)關(guān)（均P＞0.05）；tricellulin、VEGF的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 Tricellulin、VEGF的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系n

表4（續(xù)）

2.5 不同結(jié)直腸癌臨床病理特征的MVD比較

不同性別、年齡的結(jié)直腸癌患者的MVD比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的MVD大于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的結(jié)直腸癌患者的MVD大于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的結(jié)直腸癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 不同結(jié)直腸癌臨床病理特征的MVD比較

3 討論

Tricellulin是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的緊密連接跨膜蛋白，主要分布在三個(gè)相鄰細(xì)胞連接處[8]。既往研究顯示，tricellulin在扁桃體鱗狀細(xì)胞癌[10]和肝癌[11]中低表達(dá)；此外tricellulin的表達(dá)還與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)，在低分化的胰腺導(dǎo)管癌中tricellulin表達(dá)更低[13]。這些研究表明，tricellulin的低表達(dá)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，可能是由于tricellulin的減少導(dǎo)致細(xì)胞間的連接不夠緊密，破壞細(xì)胞屏障，影響細(xì)胞極性和細(xì)胞粘附，從而影響腫瘤進(jìn)展。此外，Takasawa等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在低分化的胰腺癌組織中，tricellulin主要分布在胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，且tricellulin的核定位能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲。Kyuno等[20]的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，tricellulin主要分布在低分化的胰腺癌細(xì)胞PANC-1的細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Masuda等[21]的研究顯示，tricellulin分布在胃正常組織的三細(xì)胞緊密連接處，而在胃癌組織中，tricellulin則分布于細(xì)胞質(zhì)中。本研究結(jié)果顯示，tricellulin在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)較癌旁正常組織高，且主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，這與Takasawa、Kyuno和Masuda等的研究結(jié)果相一致。

血管生成是腫瘤細(xì)胞的生存機(jī)制之一，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移在很大程度上依賴(lài)于血管生成[22]。血管生成的特征主要是活化的血管擴(kuò)張，血管通透性增加，周?chē)|(zhì)降解，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移[22-24]。有研究表明，細(xì)胞缺氧會(huì)誘導(dǎo)一氧化氮、VEGF和血管緊張素等血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生，血管活性物質(zhì)與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶相互作用增加毛細(xì)血管壁的通透性，引起內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，從而促進(jìn)血管生成以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[23-24]。VEGF表達(dá)于人體各類(lèi)細(xì)胞中，在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)新生血管的形成方面起著重要作用[25]。Simonetti等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤微血管的形成，并在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用。MVD作為評(píng)估腫瘤血管形成的良好指標(biāo)，一定程度上反映腫瘤血供豐富程度，腫瘤組織中MVD越豐富，腫瘤生長(zhǎng)越快，間接預(yù)示患者預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中tricellulin的表達(dá)與VEGF呈正相關(guān)，且tricellulin和VEGF陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中的MVD大于tricellulin和VEGF陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織，提示結(jié)直腸癌中tricellulin的表達(dá)與血管生成相關(guān)。Erickson等[27]的研究表明，視網(wǎng)膜中VEGF的改變會(huì)影響緊密連接蛋白相關(guān)蛋白o(hù)ccludin磷酸化水平以及血管的通透性，具體的作用機(jī)制尚不清楚，但緊密連接蛋白很有可能通過(guò)激活或抑制相關(guān)信號(hào)通路改變血管通透性，從而影響血管生成。而tricellulin作為緊密連接蛋白的家族成員之一，其與血管生成的關(guān)系尚不明確，也鮮少有關(guān)于tricellulin與腫瘤血管生成的研究報(bào)道。Shimada等[28]的研究發(fā)現(xiàn)敲除脂解刺激蛋白受體（LSR）可誘導(dǎo)tricellulin從三細(xì)胞緊密連接處移位至雙細(xì)胞緊密連接處，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Cording等[29]的研究發(fā)現(xiàn)在缺血或缺氧條件下，tricellulin也可發(fā)生由三細(xì)胞間向雙細(xì)胞間的重分布。我們推測(cè)tricellulin分布的改變可能與血管代償性生成有關(guān)，以滿(mǎn)足腫瘤生長(zhǎng)所需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

在不同腫瘤中，tricellulin與疾病預(yù)后的關(guān)系也不完全一致。Schlachter等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，tricellulin過(guò)表達(dá)的肝母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后較好。tricellulin低表達(dá)與膽管癌不良預(yù)后相關(guān)，而肝細(xì)胞癌的不良預(yù)后卻與tricellulin過(guò)表達(dá)相關(guān)[12]。此外，tricellulin過(guò)表達(dá)與胰腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較短的生存期有關(guān)[19]。本研究結(jié)果與上述研究一致，我們發(fā)現(xiàn)tricellulin表達(dá)與患者年齡、性別無(wú)關(guān)，而與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。此外，研究表明MVD與結(jié)直腸癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間（RFS）和總生存期（OS）呈負(fù)相關(guān)，VEGF高表達(dá)預(yù)示著較差的RFS[31]。Carvalho等[32]發(fā)現(xiàn)，MVD越大，乳腺癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)就越高。隨著MVD數(shù)量的增加，腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移的可能性增加[33-34]。本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的結(jié)直腸癌患者的VEGF陽(yáng)性表達(dá)比例分別高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的結(jié)直腸癌患者；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的結(jié)直腸癌患者的MVD分別大于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的結(jié)直腸癌患者。

綜上所述，tricellulin可能參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌血管生成，影響腫瘤轉(zhuǎn)移和發(fā)展。然而，本研究?jī)H局限于臨床樣本的檢測(cè)，未來(lái)還需要開(kāi)展細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以探究tricellulin參與調(diào)節(jié)血管生成及其影響腫瘤轉(zhuǎn)移和發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制。

利益沖突聲明全體作者均聲明不存在與本文相關(guān)的利益沖突。