氯胺酮與七氟醚誘導老齡小鼠POCD的病理機制比較*

黃鈺媛 韋雪梅 鄭育秀 劉麗麗

(海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院麻醉科，海南 海口 570311)

外科手術中全身麻醉起效快，可迅速引起患者意識、感覺和反射可逆性消失，骨骼肌松弛[1]。然而，老年患者因常伴有心、腦、肺等多個臟器的生理性功能衰退，全身麻醉會帶來一系列不良反應[2]。氯胺酮與七氟醚分別用于全身麻醉中吸入型和靜脈注射型麻醉，常在髖關節(jié)置換術[3]、腫瘤切除等手術中應用[4]。全身麻醉會增加老年患者術后認知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)的風險[5]，這嚴重限制了其在老年人手術中的應用。但是多數(shù)手術無法避免全麻，因此需要一項針對氯胺酮與七氟醚誘導認知功能障礙的比較研究，為臨床中麻醉方式、藥物的選擇甚至進一步的聯(lián)合應用提供一些理論基礎。Aβ屬于細胞毒性多肽，可促進膠質細胞活化，加劇氧化應激反應，促進Tau蛋白過度磷酸化形成神經纖維纏結，進而引起神經元死亡與樹突棘的萎縮[6]。而老齡患者海馬神經元樹突棘萎縮會阻滯神經信號傳遞，最終導致記憶的存儲與記憶的障礙[7]。基于Aβ沉積與樹突棘萎縮都是小鼠認知功能損傷的原因，本研究擬構建氯胺酮靜脈注射型與七氟醚吸入型全麻模型，比較兩種麻醉方式對腦組織中Aβ斑塊沉積和神經元樹突棘狀態(tài)的影響，分析小鼠POCD的嚴重程度，為臨床上全麻的選擇提供一些指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 36只C57BL/6小鼠，12月齡，體質量35～40 g，由海南醫(yī)學院動物實驗中心提供。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為12 h晝夜循環(huán)，(22±2)℃恒溫空間，充足食物、水源。所有涉及動物的實驗方案均按照《實驗動物的護理和使用指南》進行，且本實驗研究方案已獲得海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 實驗方案 將小鼠隨機分為對照組，七氟醚組與氯胺酮組，每組12只，開始水迷宮測試。小鼠禁食12 h后，靜脈注射氯胺酮(浙江九旭藥業(yè)有限公司)或者吸入七氟醚(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)麻醉，麻醉時間維持在6 h以上。參考預實驗與文獻中報道[8-9]，七氟醚麻醉方案：3%七氟醚持續(xù)通入麻醉盒中，維持180 min。氯胺酮麻醉方案：0 min時注射80 mg/kg，30 min時注射40mg/kg，90 min時注射40 mg/kg，180 min時注射40 mg/kg，總劑量200 mg/kg。麻醉完成后2周，開始水迷宮測試，隨后CO2處死，取腦組織用于長時程電位測試，高爾基染色，免疫組化染色，Western blot。

1.3 Morris水迷宮測試 水迷宮裝置(江蘇賽昂斯生物技術公司，型號：SA201)是直徑1.2 m，深50 cm的圓形水池，分為4個象限。第Ⅰ象限中央設置一個低于水面1 cm的圓形平臺，直徑12 cm。四周貼有不同圖形幫助小鼠定位。麻醉后14 d開始，每天將小鼠自各個象限依次投入水中，記錄90 s內尋找到平臺的時間，取平均時間記為當日逃避潛伏期。訓練4天后，撤去平臺，將小鼠自第Ⅲ象限投入水中，記錄90 s內小鼠運行軌跡，計算機分析小鼠平均游泳速率、首次到達平臺時間、穿越平臺次數(shù)、第Ⅰ象限停留時間。

1.4 長時程電位測試 小鼠以CO2處死后，用氧飽和高糖切片液心臟灌流，取完整腦組織，修塊后固定于切片機上切片。轉移腦組織切片至32℃的氧飽和人工腦脊液(ACSF，北京酷來搏科技有限公司)中。取出海馬切片，自內側穿通路(The medial perforant path，MPP)插入刺激電極，在海馬 DG區(qū)插入記錄電極，充灌 ACSF作為記錄電極內液。電極連接MultiClamp 700B放大器，記錄興奮性突觸后電位(Excitatory postsynaptic potential，EPSP)；不斷調整調整刺激強度和記錄電極的位置和深度，用 0.033 Hz的刺激頻率誘發(fā)場電位(Filed EPSP，fEPSP)直到記錄典型的場電位波形，然后固定刺激強度與記錄電極。在基線穩(wěn)定記錄20 min后，以高頻刺激誘發(fā)長時程增強(Long term potentiation，LTP)，連續(xù)20串高頻脈沖，每串包含200個脈沖，頻率為200 Hz，波寬200 μs，串間隔30 s，高頻刺激連續(xù)記錄60 min。

1.5 高爾基染色及計數(shù) 小鼠以CO2處死后，取完整腦組織浸泡于溶液1、溶液2混合液中(溶液1、2及下面提到的溶液3、4、5均來自于美國Hitobiotec公司生產的Hito Golgi-Cox Optimstain Kit高爾基染色試劑盒)，4℃避光孵育14天。取出腦組織浸入5倍體積的溶液3中，4℃避光孵育12 h后更換等量溶液3，4℃下繼續(xù)孵育48 h。將腦組織放入預冷的異戊烷中冷凍，冰凍切片機將組織切成10 μm切片，轉移至滴有溶液3的載玻片中貼片，放入溶液4、5混合溶液中反應30 min。將玻片以梯度酒精脫水，經二甲苯透化后封片。使用顯微鏡(日本奧林巴斯科技公司，型號：BX53)捕獲圖像。

1.6 免疫組化染色 小鼠以CO2處死后，生理鹽水心臟灌流，取腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，再經梯度酒精脫水，以二甲苯透化，石蠟包埋后切片，厚度約10 μm。取切片，高溫烘烤15 min修復抗原，將切片置于4%胎牛血清封閉液中封閉2 h，加入Anti-Aβ抗體稀釋液[1:100，艾博抗(上海)貿易有限公司]，4℃孵育過夜。次日，取出切片，PBST清洗并加入HRP標記的山羊抗兔IgG(H+L)抗體稀釋液[1:2000，艾博抗(上海)貿易有限公司]，4℃條件下避光孵育2 h。PBST洗滌切片，DAB顯色30 s，再次使用蘇木精復染20 s，蒸餾水分化，在不同梯度酒精中脫水，二甲苯透化后封片，顯微鏡下觀察拍片。

1.7 Western blot 小鼠以CO2處死后，取海馬組織，加入RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)，研磨成細胞懸液，12000 rpm離心20 min，加入上樣緩沖液。取出凝膠上樣梳，每孔加入約10 μg樣品。設置電泳條件：60 V/30 min，120 V/60 min，以上樣緩沖液到達凝膠底部為電泳終點。截取目標蛋白條帶，濕法轉膜法將凝膠上蛋白轉移至PVDF膜上，設置轉膜條件：2 mA/60 min，整個過程冰水浴。取出PVDF膜，4%胎牛血清封閉，以目的蛋白一抗稀釋液孵育PVDF膜，4℃過夜，包括Anti-NMDAR1，Anti-NMDAR2A，Anti-NMDAR2B，Anti-Caspase-3，Anti-bcl-2，Anti-bax(1:1000，武漢三鷹生物技術有限公司)。次日，取出PVDF膜，HRP標記IgG(H+L)二抗稀釋液(1:5000，武漢三鷹生物技術有限公司)孵育2 h。將發(fā)光液滴加的PVDF膜上，顯影儀(上海天能科技有限公司，型號：1600/1600R)下顯影獲得蛋白條帶。

2 結果

2.1 氯胺酮與七氟醚對老齡小鼠Morris水迷宮指標的影響 Morris水迷宮結果顯示，訓練期間，隨著時間的推移，各組小鼠逃避潛伏期都出現(xiàn)了一定程度降低。麻醉前，各組小鼠之間逃避潛伏期沒有差異；麻醉后，自第3天起，與對照組相比，氯胺酮組與七氟醚組小鼠逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)，且氯胺酮組小鼠逃避潛伏期低于七氟醚組。測試中，麻醉前各組小鼠各項指標均沒有差異；麻醉后，各組小鼠雖然游泳速率沒有差異，但與對照組相比，氯胺酮組與七氟醚組小鼠首次到達平臺時間明顯增加(P<0.05)，第Ⅰ象限停留時間與穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)。與此同時，測試中氯胺酮組小鼠各項指標，雖然沒有明顯性差異，但全部都優(yōu)于七氟醚組。見圖1～3。

圖1 各組小鼠訓練期間逃避潛伏期的變化(n=12)Figure 1 Changes in escape latency of mice in each group during training

圖2 各組小鼠測試期間Morris水迷宮軌跡圖(n=12)Figure 2 Morris water maze trajectory of mice in each group during test

圖3 各組小鼠測試期間Morris水迷宮指標的變化(n=12)Figure 3 Changes in Morris water maze indexes of mice in each group during test

2.2 氯胺酮與七氟醚對老齡小鼠神經元突觸狀態(tài)的影響 高爾基染色顯示，對照組小鼠神經元突觸豐富且樹突棘密集。與對照組相比，氯胺酮與七氟醚都造成了小鼠神經元中樹突棘密度和樹突棘長度降低(P<0.05)；與氯胺酮組相比，七氟醚造成樹突棘密度降低，且樹突棘長度明顯減少(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組小鼠神經元樹突棘狀態(tài)(高爾基染色，1000×，n=3)Figure 4 Dendritic spines of mice in each group

2.3 氯胺酮與七氟醚對老齡小鼠長時程電位的影響 長時程電位測試顯示，與對照組相比，氯胺酮與七氟醚都造成了小鼠MPP-DG回路的fEPSP斜率降低(P<0.05)；與氯胺酮組相比，七氟醚組小鼠MPP-DG回路中fEPSP斜率更低(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組小鼠長時程電位的變化(n=3)Figure 5 Changes in long-term potential of mice in each group

2.4 氯胺酮與七氟醚對老齡小鼠Aβ沉淀的影響 免疫組化染色顯示，對照組小鼠腦組織中幾乎沒有Aβ沉淀。氯胺酮與七氟醚誘導小鼠，無論是皮層還是海馬區(qū)，都造成了Aβ沉積明顯增加(P<0.05)；與氯胺酮組相比，七氟醚造成皮層和海馬區(qū)Aβ沉積增加，且海馬區(qū)Aβ沉積具有明顯差異(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組小鼠腦組織中Aβ沉積(免疫組化染色，10×，40×，n=3)Figure 6 Aβ deposition in brain of mice in each group

2.5 氯胺酮與七氟醚對老齡小鼠NMDA受體的影響 Western blot結果顯示，與對照組相比，氯胺酮與七氟醚造成了NMDAR表達降低(P<0.05)；與七氟醚組相比，氯胺酮對NMDAR表達的降低作用更明顯(P<0.05)。見圖7。

圖7 各組小鼠海馬中NMDAR表達(n=3)Figure 7 NMDAR expression in hippocampus of mice in each group

2.6 氯胺酮與七氟醚對老齡小鼠Caspase-3凋亡信號的影響 Western blot結果顯示，與對照組相比，氯胺酮與七氟醚造成了Caspase-3表達升高，bcl-2表達降低，bax表達升高(均P<0.05)；與七氟醚組相比，氯胺酮組bcl-2表達更高(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組小鼠海馬中Caspase-3凋亡信號蛋白的表達(n=3)Figure 8 The expression of Caspase-3 apoptotic signal protein in hippocampus of mice in each group

3 討論

氯胺酮與七氟醚是臨床常用全麻藥物。七氟醚是一種無色透明，無刺激性易揮發(fā)的液體，患者戴上面罩吸入濃度為3%～6%七氟醚2 min，即會出現(xiàn)意識消失的情況[10]。氯胺酮一種無色透明液體，具有強效的陣痛作用，且安全性較高，麻醉過程易管理[11]。已有較多研究比較了兩者在髖關節(jié)置換術，疝囊高位結扎術等手術中的麻醉效果[12-13]。與氯胺酮相比，七氟醚具有多方面優(yōu)勢，如術前誘導期較為平靜、術中血液動力學較為穩(wěn)定，肌松藥使用較少，術后蘇醒較快[14-15]。然而，兩種麻醉藥物在POCD的研究中卻鮮有比較。

POCD是以學習記憶能力損傷為特征的并發(fā)癥。Morris水迷宮中，小鼠以空間四周標記作為參照物，經反復訓練，在其腦中形成空間參考記憶，能夠借助參照物來辨別方位，登上逃生平臺[16]。本研究中，麻醉前各組小鼠學習認知功能相似，但經歷了七氟醚或氯胺酮麻醉后的小鼠各項指標都明顯劣于對照組小鼠，提示本研究小鼠認知功能障礙模型構建成功。與七氟醚組相比，雖然沒有明顯性差異，但氯胺酮麻醉小鼠Morris水迷宮各項指標中都優(yōu)于七氟醚組。

突觸是神經元之間功能聯(lián)系的接觸點，是信息傳遞的關鍵結構。突觸通過樹突棘的增加和萎縮使信息傳遞效率發(fā)生變化，因此，樹突棘數(shù)量、密度、長度的變化可反應突觸可塑性變化[17]。突觸可塑性指突觸基于樹突棘結構產生的不斷變化的傳遞效能，與個體的學習和記憶能力相關[18]。以往探索中，POCD患者腦組織中都有發(fā)現(xiàn)樹突棘萎縮[19]，而新生幼鼠中，樹突棘密度往往隨著腦組織結構的發(fā)育而增加[20]。宏觀上，海馬區(qū)LTP效應也反映了突觸可塑性，與認知行為有明顯相關性[21]。Sakusic等[22]分析顯示提高學習和記憶的因素往往能誘發(fā)LTP；反之，抑制LTP的因素也能影響學習和記憶過程。本研究中，氯胺酮與七氟醚組中可見明顯的樹突棘密度與長度降低，且LTP水平明顯降低，反映了氯胺酮與七氟醚組小鼠的學習與記憶能力的損傷，七氟醚對樹突棘密度和LTP水平的影響都要明顯高于氯胺酮組，也反映了七氟醚造成的學習與記憶能力損傷要高于氯胺酮。

Aβ是β和γ分泌酶對淀粉樣前體蛋白連續(xù)水解和切割的產物，是阿爾茲海默病認知功能障礙進展的病理基礎[23]。氯胺酮與七氟醚組小鼠腦組織中可見明顯的Aβ斑塊沉積。在海馬組織中，與氯胺酮組相比，七氟醚造成海馬區(qū)Aβ沉積明顯增加。有研究證實，老齡患者早期輕度認知功能損傷是由于寡聚態(tài)Aβ的聚集引起的突觸功能障礙所致，并且這種寡聚體Aβ的沉積現(xiàn)象的出現(xiàn)是早于廣泛的突觸喪失和神經變性之前[24]。由于海馬區(qū)是影響動物學習與記憶能力的生理區(qū)域，因此海馬區(qū)Aβ增加是造成神經元樹突棘萎縮，LTP強度降低的主要原因，也是導致七氟醚組小鼠學習與記憶功能劣于氯胺酮組的生理因素之一。

回顧氯胺酮與七氟醚組對小鼠造成的學習與記憶能力損傷，其涉及的信號終點主要是Caspase-3凋亡途徑激活以造成的海馬神經元凋亡[25]。Bax與Bcl-2分別是促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白，協(xié)同調控線粒體外膜的透化。在七氟醚或氯胺酮誘導過程中，Bax表達增加而Bcl-2表達減少會導致線粒體外膜破壞，釋放細胞色素C，促進Apaf-1的寡聚化，致使下游Caspase-3的凋亡途徑的激活[26]。然而，氯胺酮與七氟醚介導的學習與記憶損傷的差異性，可能是由NMDA-NO信號通路介導的。NMDA受體廣泛表達于海馬神經突觸后膜，氯胺酮是NMDA特異性拮抗劑[27]。NMDA受體組成亞基中NMDAR2B是一種被認可的“聰明基團”，針對此基團已有設計并上市了用于抑郁治療的藥物[28-29]。無論是抑郁癥研究，還是POCD的研究中，都有顯示較低劑量的氯胺酮被發(fā)現(xiàn)是通過減少NMDA受體蛋白的表達，抑制下游炎性細胞因子，從而發(fā)揮神經保護作用。本研究中使用的氯胺酮介導的Caspase-3凋亡途徑激活的效應高于NMDA信號通路的抗炎作用，最終導致了老齡小鼠突觸損傷、Aβ沉積增加。此外，我們也發(fā)現(xiàn)，與七氟醚組相比，氯胺酮組NMDA表達減少，且Bcl-2表達增加，因此對于細胞凋亡認知功能的影響較小。

4 結論

七氟醚與氯胺酮都會造成老齡小鼠出現(xiàn)學習與記憶能力損傷。其生理機制涉及Caspase-3信號通路的激活造成神經元樹突棘損傷與Aβ沉積，然而氯胺酮基于NMDA信號的抑制，可能在一定程度上減輕了小鼠認知功能的損傷。因此，在臨床上應用中，氯胺酮誘導患者出現(xiàn)認知功能損傷的幾率較低，在可能造成患者認知功能損傷的手術中應將氯胺酮使用的優(yōu)先級提高。