抗豬繁殖與呼吸障礙綜合征中藥單體成分的體外篩選

張淼丹，布瑋瑋，張春杰

（1.洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南洛陽 471000；2.南召縣紀(jì)委監(jiān)委，河南南陽 474650；3.河南科技大學(xué)，河南洛陽 471000）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗稱豬藍(lán)耳病，是由PRRSV病毒引起的以母豬出現(xiàn)繁殖障礙，仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸道癥狀的傳染病。該病以急性、高熱性和致死率高為特征，嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

此疾病主要癥狀是母豬免疫力下降，進(jìn)而使機(jī)體出現(xiàn)一些病原微生物的繼發(fā)感染，死亡率增加，目前尚無有效治療藥物。由于商業(yè)疫苗只能提供部分保護(hù)，接種滅活疫苗后，抗體產(chǎn)生的速度慢且滴度低，對機(jī)體產(chǎn)生的保護(hù)力度不夠（Nilubol等，2004），弱毒疫苗雖免疫效果較好，但本身仍有毒性，存在一定的危險性（毋安雄等，2003；Meng等，1995）。因此，提高機(jī)體免疫力是抗 PRRSV 感染的關(guān)鍵（Botner等，1999）。中國中藥資源豐富，有的藥材具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒作用（張紅英等，2010），中藥提取物在治療動物病毒感染性疾病方面具有獨特的優(yōu)勢（Todorov等，2014；Sabde 等，2011；Tan 和 Vanitha，2004；Shan等，1999）。本試驗按照前期試驗結(jié)果擬選取4種較理想的抗病毒中藥單體進(jìn)行體外抗PRRSV作用的研究，以期獲得有較好抗PRRSV效果的中藥單體及其有效濃度。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒 猴腎上皮樣細(xì)胞（Marc145），PRRSV標(biāo)準(zhǔn)毒（SD-16），均由河南科技大學(xué)動物疫病與公共衛(wèi)生實驗室保存。

1.2 試劑 奎寧酸、綠原酸、連翹苷、黃芩苷中藥單體，HPLC≥98%，購買于西安飛達(dá)生物有限公司；胰酶，DMEM培養(yǎng)基，DMSO，購自碧云天生物工程公司。

1.3 體外培養(yǎng) 參照布瑋瑋（2014）的方法進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗。根據(jù)試驗設(shè)計進(jìn)行觀察，記錄每次觀察到的細(xì)胞形態(tài)。中藥單體的安全濃度范圍已由課題組確定。詳細(xì)中藥單體安全范圍見布瑋瑋（2014）的研究。

1.4 有效中藥單體體外抗病毒試驗

1.4.1 有效中藥單體對PRRSV阻斷作用的測定在安全濃度范圍內(nèi)將各有效中藥單體稀釋6個濃度待用。觀察96孔板內(nèi)培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞，待孔底鋪滿單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，按100 μl/孔加入稀釋單體，試驗設(shè)置每個稀釋度分別重復(fù)4孔。37℃作用4 h，棄上清，加100 μl/孔的100 TCID50PRRSV，分別設(shè)8孔的細(xì)胞和病毒作為對照組，培養(yǎng)箱37℃ 5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)，每天需觀察細(xì)胞病變（CPE）。待病毒對照組CPE達(dá)到75%以上時記錄各孔CPE情況。繼續(xù)培養(yǎng)至120 h，用酶標(biāo)儀570 nm/630 nm雙波長模式測各孔內(nèi)細(xì)胞OD值。

1.4.2 有效中藥單體對PRRSV抑制作用的測定 觀察96孔板內(nèi)培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞，待孔底鋪滿單層細(xì)胞，棄上清，按100 μl/孔加入100 TCID50的 PRRSV，37℃ 5% CO2培 養(yǎng) 箱 培養(yǎng)2 h。棄去毒液，100 μl/孔加入稀釋好的藥物，試驗設(shè)置每個稀釋度分別4孔重復(fù)操作，另外設(shè)置8孔的空白細(xì)胞和病毒作為對照組，培養(yǎng)箱37℃ 5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)，每天需觀察細(xì)胞病變（CPE）。待病毒對照組CPE達(dá)到75%以上時記錄各孔CPE情況。繼續(xù)培養(yǎng)至120 h，用酶標(biāo)儀570 nm/630 nm雙波長模式測各孔內(nèi)細(xì)胞OD值。

1.4.3 有效中藥單體對PRRSV直接殺滅作用的測定 將100 TCID50病毒液與各濃度的單體混合，4℃作用4 h，然后將混合液分別加到長成單層的Marc-145細(xì)胞的96孔板中，100 μl/孔，試驗設(shè)置每個稀釋度分別4孔重復(fù)操作，另外設(shè)置8孔的空白細(xì)胞和病毒對照，培養(yǎng)箱37℃ 5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)，及時觀察病毒對照組細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），達(dá)到75%以上時記錄各孔CPE情況。繼續(xù)培養(yǎng)至120 h，用酶標(biāo)儀570 nm/630 nm雙波長模式測各孔內(nèi)細(xì)胞OD值。

1.5 CPE結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)與方法 細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）效果判定標(biāo)準(zhǔn)主要觀察以下指標(biāo)：培養(yǎng)液顏色是否變暗；觀察Marc-145細(xì)胞表面是否附著PRRSV；Marc-145細(xì)胞細(xì)胞集堆、萎縮、脫落甚至裂解。觀察細(xì)胞，記錄CPE情況?！?”表示為正常細(xì)胞，“+”表示出現(xiàn)CPE的細(xì)胞有25%，“++”表示出現(xiàn)CPE的細(xì)胞有25%～50%，“+++”表示出現(xiàn)CPE的細(xì)胞有50%～75%，“++++”表示出現(xiàn)CPE的細(xì)胞有75%～100%。

1.6 MTT法判斷方法 細(xì)胞培養(yǎng)到120 h棄上清，用預(yù)熱37℃的PBS漂洗2次；在培養(yǎng)板中加20 μl/孔的 MTT（5 mg/mL），37℃培養(yǎng) 4 h后 ；在培養(yǎng)板中每孔加130 μl二甲基亞砜，置于振蕩器上輕微振蕩10 min，將細(xì)胞中的紫色結(jié)晶充分溶解；酶標(biāo)儀用570 nm/630 nm雙波長模式測定每孔的OD值，以敏感波長與非敏感波長OD值之差作為中藥單體抗PRRSV感染細(xì)胞的指標(biāo)，OD值越大，抗PRRSV作用效果越好。藥物保護(hù)率的計算方法如下：

藥物對細(xì)胞的保護(hù)率/%=（加藥孔OD值-病毒對照孔OD值）/（細(xì)胞對照孔OD值-病毒對照孔OD值）×100。

2 結(jié)果

2.1 有效中藥單體體外抗病毒的結(jié)果

2.1.1 中藥單體阻斷病毒吸附的檢測結(jié)果 每天按時觀察Marc-145細(xì)胞CPE情況，及時觀察病毒對照組的細(xì)胞病變效應(yīng)，如果CPE達(dá)到75%以上，繼續(xù)培養(yǎng)至120 h，用MTT法，570 nm/630 nm雙波長模式測細(xì)胞OD值。依據(jù)所得OD值計算各中藥濃度對細(xì)胞的保護(hù)率，如圖1。較高濃度的4種中藥單體對細(xì)胞的保護(hù)率均能達(dá)到50%左右。4種藥物單體的6個濃度見表1。

表1 不同中藥單體體外抗PRRSV活性的濃度

圖1 對Marc-145細(xì)胞的保護(hù)率（先加藥再接毒）

2.1.2 中藥單體抑制病毒復(fù)制的檢測結(jié)果 每天按時觀察Marc-145細(xì)胞CPE情況，及時觀察病毒對照組的細(xì)胞病變效應(yīng)，如果CPE達(dá)到75%以上繼續(xù)培養(yǎng)至120 h，用MTT法，570 nm/630 nm雙波長模式測細(xì)胞OD值。依據(jù)所得OD值計算各中藥濃度對細(xì)胞的保護(hù)率。見圖2。

由圖2可知，奎寧酸和黃芩苷的保護(hù)率較低，綠原酸和連翹苷相對較好，保護(hù)率能達(dá)到50%以上。100 μmol的連翹苷對細(xì)胞的保護(hù)率達(dá)90%，100 μmol的綠原酸也能達(dá)到較好的保護(hù)作用。且數(shù)據(jù)顯示，綠原酸和連翹苷雖均有高的保護(hù)率，但安全范圍內(nèi)各濃度間的數(shù)據(jù)差異比較顯著，說明其保護(hù)作用均不穩(wěn)定。

圖2 對Marc-145細(xì)胞的保護(hù)率（先接毒再加藥）

2.1.3 中藥單體直接殺滅病毒的檢測結(jié)果每天按時觀察Marc-145細(xì)胞CPE情況，及時觀察病毒對照組的細(xì)胞病變效應(yīng)，如果CPE達(dá)到75%以上繼續(xù)再培養(yǎng)至120 h，用MTT法，570 nm/630 nm雙波長模式測細(xì)胞OD值。根據(jù)所得OD值計算各中藥濃度對細(xì)胞的保護(hù)率，如圖3。

由圖3可知，黃芩苷對PRRSV基本上沒有殺滅作用；連翹苷在100 μM時保護(hù)率在80%，但隨著濃度變化，其保護(hù)作用變化很大；奎寧酸和綠原酸均有明顯的保護(hù)作用，且隨濃度變化趨勢緩慢。

圖3 對Marc-145細(xì)胞的保護(hù)率（藥物與病毒作用）

綜合對病毒的阻斷作用、抑制作用和殺滅作用3種結(jié)果，4種中藥單體均有較好的抗PRRSV活性，并呈一定的量效關(guān)系。4種中藥單體均能有效阻斷病毒吸附；綠原酸和連翹苷能有效抑制病毒復(fù)制，且連翹苷在100 μmol時保護(hù)率最高；綠原酸和奎寧酸對PRRSV直接殺滅作用較為明顯，連翹苷在100 μmol也有明顯的保護(hù)作用。

3 討論

近年來，中藥對動物疾病的治療研究已成熱點，傳統(tǒng)中藥對動物具有毒性小、安全性高、副作用小、不容易產(chǎn)生抗藥性和依賴性等優(yōu)點，受到養(yǎng)殖戶的青睞，因此，本文采用4種中藥單體來探索其對豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中藥物濃度高于某一值時，會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，當(dāng)中藥單體稀釋液作用于Marc-145細(xì)胞后，濃度過高會導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，開始壞死、脫落，最終溶解；但當(dāng)藥物濃度持續(xù)降低時，細(xì)胞病變效應(yīng)CPE會下降，說明藥物對細(xì)胞的毒性也隨之下降；當(dāng)藥物濃度持續(xù)下降到某點時，細(xì)胞病變效應(yīng)基本消失，這也說明，天然藥物毒性與其濃度呈正相關(guān)，與國內(nèi)外其他研究者的觀點一致（秦書敏等，2017；秦華珍等，2009）。

本研究采用CPE法和MTT法同時來確定藥物的抗病毒活性。本試驗采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，設(shè)計了3種給藥方式探討中藥單體的抗病毒作用機(jī)理。第一，先加藥入細(xì)胞再接毒，觀察藥物能否阻斷病毒的吸附和進(jìn)入；第二，先接毒于細(xì)胞再加藥，目的為了觀察藥物是否對細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制起到抑制效果；最后，采用中藥和病毒先自行作用數(shù)段時間后，再加入細(xì)胞，目的是為了觀察藥物是否對病毒有直接殺滅作用。

通過CPE法觀測和MTT法測得的OD值，本研究選用的奎寧酸、綠原酸、黃芩苷和連翹苷4種最為有效的抗病毒中藥單體對PRRSV均有很好的阻斷吸附效果，保護(hù)率都能達(dá)到50%以上（布瑋瑋，2014）；綜合對病毒的阻斷作用、抑制作用和殺滅作用3種結(jié)果，4種中藥單體均有較好的抗PRRSV活性，能給細(xì)胞提供較好的保護(hù)作用，初步探索到了最佳有效濃度，為PRRS的治療藥物開發(fā)提供了理論數(shù)據(jù)，也為研究中藥抗病毒作用機(jī)理提供了新的探索途徑。本試驗采用體外培養(yǎng)法測定中藥物對豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的抑制效果。在當(dāng)今畜牧業(yè)養(yǎng)殖過程中，我們應(yīng)合理用藥，綜合考慮個體、環(huán)境及出現(xiàn)的眾多因素，從而選擇出最佳的臨床用藥劑量。在實踐中如何應(yīng)用有效藥物治療豬繁殖與呼吸障礙綜合征還需進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

4種中藥單體對PRRSV均有很好的阻斷吸附效果，保護(hù)率均在50%以上，其中綠原酸和連翹苷的抗病毒復(fù)制活性也很明顯，都在100 μM時能達(dá)到最好的抗病毒效果；奎寧酸、綠原酸和連翹苷對病毒還具有較好的直接殺滅效果。綜合3種情況，奎寧酸、綠原酸和黃芩苷、連翹苷均有抗PRRSV活性，尤其是綠原酸和連翹苷能給細(xì)胞提供較好的保護(hù)作用。