模擬航天失重病理特征的小鼠模型的制備*

梅天豪 陳 瑩 趙 夯 袁 野 童志前

（溫州醫(yī)科大學(xué)老年研究院，浙江省阿爾茨海默病研究重點實驗室，精神醫(yī)學(xué)學(xué)院，甌江實驗室，溫州 325035）

C57BL/6小鼠（Mus musculus），一種廣泛使用的實驗動物，適用于Ⅱ型糖尿病、肥胖、代謝綜合征、脂肪肝、動脈粥樣硬化等多種疾病的模型研究或造模。

近些年來“神舟”系列載人飛船的發(fā)射成功及中國空間站的建立，為中國航天員在太空中長時間工作提供了高科技平臺。但航天失重破壞宇航員的感覺、認知、平衡和運動功能，導(dǎo)致航天員返回地面后出現(xiàn)行走時空間方向感缺失［1］、肌肉激活模式改變［2-3］、步態(tài)和姿勢紊亂、運動協(xié)調(diào)能力下降［4］，嚴重影響宇航員返回地球后的正常生活。如何保障航天員健康是航空航天醫(yī)學(xué)研究的重點及難題。

歐洲、美國、日本、中國等航天中心為探索航天失重對宇航員健康的影響，開展了在地面模擬航天失重環(huán)境動物模型的制備。目前常規(guī)方法是后肢懸吊法（hindlimb unloading，HU）來制備模擬失重動物模型［5］，但也有一些缺點，如制備時間較長（一般為2 周）、受外界干擾因素多等。急需開發(fā)并制備耗時短、簡單可行的模擬航天失重病理特征的動物模型。

已有的一些研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源甲醛在小腦的蓄積破壞軀體平衡能力［6］。本文首先探索標準模型組的后肢懸吊小鼠小腦頂核中甲醛是否蓄積、甲醛代謝相關(guān)酶的活性及表達，以及甲醛濃度變化與運動功能紊亂之間關(guān)系；并進一步采用向健康成年小鼠小腦頂核內(nèi)注射病理濃度的甲醛（標準模型組小腦測得的濃度）來重現(xiàn)標準模型組的病理及行為特征。結(jié)果顯示頂核注射甲醛制備的小鼠模型和后肢懸吊法制備的標準模型的病理及行為較為一致，這為探索航天失重的危害提供了一種藥物篩選模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性C57BL/6J小鼠，2月齡，無特定病原體級（specific pathogen free，SPF）。動物進入動物房后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度控制在（25±2）℃，光照周期為12 h，白晝交替（7∶00～19∶00），動物自由進食及飲水，定期更換墊料。

1.2 實驗耗材

一次性防滑聚乙烯（PE）手套（海門市揚子醫(yī)療器械有限公司），1.5 ml 離心管（美國AXYGEN公司，貨號：CC-4213-05），陽離子防脫玻片（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZLI-9506），一次性蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司，貨號：10212432C），小鼠雙管微量給藥系統(tǒng)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，貨號：62028/62128/62228），PE管（1.5 mm×0.5 mm）（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，貨號：62329），徠卡一次性窄刀片（徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司，貨號：819）。

1.3 實驗儀器和設(shè)備

移液器（德國Eppendorf 公司， 貨號：31110008），微量進樣器（5 μl）（上海高鴿工貿(mào)有限公司），冰凍切片機（德國Leica 公司，型號：LEICA CM 1950），倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)（德國卡爾·蔡司股份公司，型號：AxiocamERc 5s），酶標儀（美國Molecular DEVICES 公司，型號：Spectra Max i3x），超低溫冰箱（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：905），小型臺式高速離心機（德國Eppendorf 公司，型號：5430 R），低速離心機（德國Eppendorf 公司，型號：5702），小鼠立體定位注射儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），渦旋振蕩器（海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號：VORTEX-5），凈化工作臺（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司，型號：SW-CJ-2FD），小鼠轉(zhuǎn)棒儀（西班牙Panlab公司），步態(tài)分析儀（美國Mouse Specifics 公司， 型號：DigiGait），超聲波破碎儀（美國SONICS，型號：VCX150PB），高度分散勻漿機（上海啟前電子科技有限公司，型號：FSH-2A）。

1.4 小鼠分組

動物于造模前進行平衡木和轉(zhuǎn)棒行為實驗訓(xùn)練，選取合格的小鼠隨機分為4組：a.對照組（不做任何處理）；b.后肢懸吊組；c.假手術(shù)組（磷酸緩沖液（PBS）注射）；d.頂核甲醛注射組。每組8只，單籠飼養(yǎng)。

1.5 后肢懸吊組標準模型

標準模型參照常規(guī)的小鼠后肢懸吊法制備［5］。注意調(diào)節(jié)繩子長度使小鼠后肢剛好離地，身體長軸與水平地面形成30°的傾斜角度。保證小鼠前爪著地可以在鼠籠的一定范圍內(nèi)活動（自由攝食和飲水）。造模持續(xù)2 周。造模結(jié)束后進行平衡木、轉(zhuǎn)棒、步態(tài)分析等行為學(xué)評估。

1.6 頂核注射組模型

1.6.1 小腦頂核立體定位

參照《小鼠腦立體定位圖譜》確定頂核注射位點 坐 標（x= -6.25 mm，y= ±0.75 mm，z=-2.25 mm），向健康野生成年雄性小鼠頂核內(nèi)注射細胞膜紅色熒光探針，檢測位點坐標是否準確。

1.6.2 小鼠雙側(cè)頂核導(dǎo)管埋入及給藥

向頂核注射組的小鼠腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉，待小鼠完全麻醉后，將其固定在立體定位儀上［7］，用刀片剔除頭皮上的毛發(fā)后進行雙側(cè)頂核埋管手術(shù)。手術(shù)后將套管內(nèi)芯拔出，插入內(nèi)導(dǎo)管，為保證藥物進入目標腦區(qū)，內(nèi)導(dǎo)管比套管長0.5 mm。用PE 管將5 μl 微量進樣器與內(nèi)導(dǎo)管露在外面的一端相連，并將含有1.5 mmol/L甲醛的微量進樣器固定于微量進樣泵上，參數(shù)設(shè)置為10 min內(nèi)注射5 μl，注射完后停留5 min，使藥物充分擴散。緩慢拔出內(nèi)導(dǎo)管，插入內(nèi)芯。給藥過程中注意維持小鼠體溫，密切觀察小鼠狀態(tài)。每天給藥1次，持續(xù)14 d。造模結(jié)束后進行行為學(xué)評估。

1.7 小鼠運動功能檢測

1.7.1 平衡木實驗

小鼠通過平衡木的時間可用來評估小鼠的平衡和協(xié)調(diào)能力。8 mm 平衡木兩端10 cm 處分別用無味的筆做標記，兩標記之間的距離為80 cm，小鼠通過標記即開始或停止計時。記錄小鼠在120 s 內(nèi)通過80 cm 距離的時間（潛伏期，s），超過120 s，仍未通過的記為120 s。訓(xùn)練期第1 天在訓(xùn)練之前，先把小鼠放入平衡木一端的逃生箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境30 min，適應(yīng)結(jié)束之后將小鼠放在平衡木上距逃生箱5 cm 處，小鼠能自行爬回箱內(nèi)則開始訓(xùn)練，每天3 次，每次間隔5 min，造模結(jié)束后進行測試，選取訓(xùn)練期第3天和測試期小鼠通過較細平衡木的潛伏期平均值作為造模前后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計［8］。

1.7.2 轉(zhuǎn)棒實驗

小鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時間可用來評估小鼠運動協(xié)調(diào)能力。在造模前先對小鼠進行為期3 d 的訓(xùn)練。第1天先設(shè)置5 r/min的速度使小鼠適應(yīng)轉(zhuǎn)棒環(huán)境及運動方式1 min，期間掉落的小鼠仍然放回繼續(xù)適應(yīng)，間隔5 min后開始訓(xùn)練，以4 r/min的初始速度，勻加速5 min 至最大速度40 r/min，記錄這期間小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間，潛伏期不足1 min的小鼠放回轉(zhuǎn)棒重新計時，超過1 min后掉落或抓緊轉(zhuǎn)棒后跟隨轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)動2 周均停止計時，5 min 內(nèi)未掉落者記錄為300 s。造模結(jié)束后進行正式測試1 d，設(shè)置條件同造模前訓(xùn)練實驗（5 min 內(nèi)從4 r/min勻加速至40 r/min）。訓(xùn)練和測試均為每天3次，每次間隔5 min，選取訓(xùn)練期第3 天和測試期的潛伏期平均值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計［9］。

1.7.3 步態(tài)分析

步態(tài)分析儀由DigigaitTM成像和分析軟件（Digigait，Mouse Specifics，Boston，USA）自動量化動物行走或跑步步態(tài)的空間信息，包括步寬、擺幅、推動力、步進順序等參數(shù)，本研究只統(tǒng)計了步寬。正式測試前先將小鼠放在跑步機上以5 cm/s的速度適應(yīng)5 min，休息5 min后開始測試。跑步機的測試速度設(shè)為15 cm/s，至少采集5個步伐。

1.8 小鼠小腦組織學(xué)檢測

1.8.1 小腦甲醛熒光成像

三組小鼠腹腔內(nèi)注射10 μm/L 的Na-FA（甲醛熒光探針）［10］，30 min 后用2%戊巴比妥鈉溶液深度麻醉，將小鼠頸椎脫臼處死，取出小鼠腦組織，PBS沖洗表面血液及雜質(zhì)。將不同組的腦組織置于同一玻璃器皿中，吸干腦組織周圍水分后放入成像暗箱平臺。以上步驟在冰上避光操作。選擇激發(fā)和發(fā)射濾片（λex/em=430 nm/543 nm），調(diào)整軟件進行成像。

1.8.2 小腦組織甲醛和甲醛代謝相關(guān)酶類的檢測

a.樣本制備

行為學(xué)評估結(jié)束后注射2%戊巴比妥鈉將小鼠麻醉，頸椎脫臼處死，冰上剝離小腦組織。電子天平快速稱重腦組織并記錄，加入預(yù)冷的PBS 液（pH=7.4）。組織勻漿機在冰浴條件下將小腦組織充分勻漿，4℃，12000g離心5 min，取上清液備用。

b.小腦組織蛋白質(zhì)濃度檢測

配制蛋白質(zhì)標準品和BCA 工作液，加樣后用酶標儀在562 nm 處檢測吸光度。以蛋白質(zhì)標準品的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線，根據(jù)所得公式計算待測樣本的蛋白質(zhì)濃度。

c.小腦組織甲醛含量檢測

吸取0.5 ml 樣本，加入等體積的10%三氯乙酸，渦旋5 s，放入預(yù)冷至4℃的離心機中，10000 r/min，離心30 min。吸取0.4 ml 上清液加入到新的EP 管中，再向管中加入0.1 ml DNPH（1 g/L） 和0.5 ml 乙腈，充分混勻，60℃水浴30 min。再次離心后吸取上清液，注射到高效液相色譜儀專用測量瓶中檢測甲醛含量［11］。

d. 小腦組織氨基脲敏感胺氧化酶（semicarbazide-sensitive amine oxidase，SSAO）活性檢測

根據(jù)SSAO 試劑盒說明書進行（GMS50538.1，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，上海）。向待測樣品中加入25 μl 混合液，37℃孵育待測樣品20 min。用酶標儀測定498 nm 波長處的吸光度，37℃孵育1 h 后再次測定A498。繪制標準曲線，根據(jù)公式計算待測樣本中的SSAO活性。

1.8.3 小腦SSAO免疫熒光組化

在行為學(xué)檢測后，參照小鼠腦組織切片的方法制備樣本［12］。同時為了防止切片出現(xiàn)冰晶，使用用蔗糖溶液（PBS配制）脫水。包埋前將腦組織塊表面的液體用吸水紙吸干。一抗：VAP-1/SSAO（1 mg/L，ab42885，Abcam，Cambridge，MA），熒光二抗：Alexa Fluor 488 單抗鼠IgG（green，1∶400，Thermo Fisher Scientific）；其 他抗 體：rabbit IgG（1 mg/L，R&D Systems，Minneapolis，MN）。一抗和二抗孵育后進行腦片免疫熒光染色［13］， 用 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡（BZ-9000，BIOREVO，Keyence，Japan）進行圖像采集。

1.8.4 小腦切片尼氏染色

尼氏體是神經(jīng)元內(nèi)合成蛋白質(zhì)合成的重要部位，當神經(jīng)元受到刺激后，胞體內(nèi)的尼氏體會明顯減少。通常尼氏體能被堿性染料如硫堇、亞甲藍、甲苯胺藍和焦油紫等染料染成紫藍色。本實驗使用的是焦油紫法。使用改良后的尼氏體染色法（C0117，碧云天，中國）對小腦切片進行染色［14］，再用無水乙醇迅速脫水，并使用二甲苯透明和中性樹膠封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 后肢懸吊小鼠小腦甲醛蓄積及運動功能受損

小鼠的后肢懸吊，使其身體長軸與地面呈30°角（圖1a）。采用甲醛熒光探針Na-FA 的小動物熒光成像觀察到第14 天的后肢懸吊小鼠小腦中內(nèi)源甲醛熒光強度增強（圖1b，c），同時用高效液相色譜儀（HPLC） 測得的甲醛濃度急劇上升（圖1d）。這和以前的研究中失重條件下甲醛含量增加基本一致［15］。

后肢懸吊第14 天用轉(zhuǎn)棒（圖1e）和平衡木（圖1g）檢測小鼠的平衡能力，結(jié)果顯示較對照組模型組小鼠在棒時間縮短（圖1f），通過平衡木的時間延長（圖1h），說明模擬失重的后肢懸吊使小鼠平衡協(xié)調(diào)能力受到了損傷。這和以前的研究結(jié)果一致［16］。

Fig.1 Move disorders of HU model mice assessed by rotating bar instrument and balance beam(a) Schematic diagram of mice model of hindlimb unloading (HU). (b) Formaldehyde fluorescence imaging of mouse cerebellum by injection of Na-FA probe on day 7 and 14, respectively. Con, Control; FA, formaldehyde. (c) Elevated fluorescence intensity of FA in cerebellum of HU model.(d)Increased levels of FA in cerebellum of HU model.(e)Schematic diagram of rotating rod instrument.(f)Comparison of staying time between HU and Con group.(g)Schematic diagram of balance beam.(h)Time of crossing balance beam in HU and Con group.***P<0.001,ns P>0.05,n=8.

2.2 后肢懸吊小鼠腦中甲醛產(chǎn)生酶活性及表達增加

采用組織免疫熒檢測后肢懸吊組和對照組小鼠小腦內(nèi)SSAO 含量，用SSAO 活性試劑盒檢測了血液、小腦勻漿中SSAO的活性。結(jié)果顯示：與對照組相比，后肢懸吊組小鼠小腦內(nèi)SSAO 含量增加（圖2a），活性增強（圖2b），血漿中SSAO 的活性增強（圖2c）。同時，SSAO 的組織免疫熒光結(jié)果也顯示后肢懸吊組小鼠小腦血管壁中SSAO熒光強度較對照組顯著增加（圖2d，e）。

以上結(jié)果說明，后肢懸吊模擬失重確實導(dǎo)致了小鼠運動功能的紊亂，小腦中的甲醛蓄積可能與模擬失重導(dǎo)致的運動障礙密切相關(guān)［17］，而SSAO 表達增加及肌氨酸脫氫酶（sarcosine dehydrogenase，SARDH）與甲醛蓄積有著緊密聯(lián)系（圖2f）［18］。這提示：向小鼠的小腦頂核內(nèi)注射病理濃度的甲醛有可能用來制備類似失重誘發(fā)運動紊亂的病理小鼠模型。

Fig.2 Increased in the levels of expression and activity of SSAO protein in the cerebellum of HU group detected by using immunofluorescence and SSAO kits，respectively(a,b)Elevated in the levels of expression and activity of SSAO enzyme in the cerebellum of HU mice than Con mice.(c)Increased in the activity of serum SSAO in HU mice than Con mice.(d,e)Enhanced immunofluorescence of SSAO in the cerebellum of HU mice.(f)Schematic diagram of FA accumulation in the cerebellum caused by increasing SSAO enzyme expression in blood and activating mitochondrial SARDH of neurons.Sarcosine dehydrogenase(SARDH).*P<0.05,***P<0.001,n=8.

2.3 頂核注射病理濃度甲醛小鼠的病理特征及行為變化

為探索是否小腦中甲醛蓄積是后肢懸吊模型小鼠出現(xiàn)運動功能紊亂的關(guān)鍵誘因，采用立體定位微量注射技術(shù)向健康成年雄性小鼠小腦的頂核注射病理濃度（1.5 mmol/L，2 μl/側(cè)）的甲醛，觀察小腦神經(jīng)元死亡及運動行為變化。

為確定立體定位注射位點的準確性，將細胞膜紅色熒光探針（Dil，25 μmol/L，C1036，碧云天，中國）量注射到小腦頂核（圖3a），制作冰凍切片后用細胞核藍色熒光染液（DAPI，C1002，碧云天，中國）孵育5～10 min，激光共聚焦的結(jié)果顯示小鼠小腦頂核出現(xiàn)紅色熒光，說明注射位置準確。

為檢測病理濃度甲醛對小腦頂核神經(jīng)元的毒性，將頂核微量注射甲醛后的小鼠腦組織灌注固定，制作冰凍切片后進行尼氏染色。結(jié)果顯示：后肢懸吊組（HU）和頂核注射組（FA-1.5 mmol/L）的小鼠較對照組（Con）的小腦頂核神經(jīng)元中紫藍色尼氏體顯著減少，說明神經(jīng)元死亡增加（圖3a）。

為檢測病理濃度甲醛對小腦運動功能調(diào)節(jié)的影響，采用轉(zhuǎn)棒儀、平衡木、步態(tài)分析儀檢測小鼠的運動功能。結(jié)果顯示小腦頂核微量注射甲醛后，小鼠在棒時間縮短（圖3b），穿過平衡木的時間延長，表明平衡能力減弱（圖3c）。特別是后肢懸吊組（HU）和頂核注射組（FA-1.5 mmol/L）的小鼠較對照組（Con）的步寬明顯增加（圖3d）。以上說明頂核注射組和HU 組的運動行為紊亂基本一致。

以上數(shù)據(jù)表明，頂核立體定位注射病理濃度的甲醛可使神經(jīng)元死亡，并誘發(fā)小鼠表現(xiàn)出現(xiàn)運動失調(diào)、步態(tài)紊亂癥狀［19］，與后肢懸吊組小鼠運動功能紊亂的行為特征類似。

Fig.3 Mimicking pathological characters of HU model mice by injecting of excessive FA into the fastigial nucleus of male healthy mice(a)Injection site of the fastigial nucleus(FN)and Nissl staining showed neuronal death after injection of FA into FN of the cerebellum.(b)Decreased in the staying time in the rotarod in FA-injected mice.(c)Decline in the staying time in the beam waling in FA-injected mice.(d)Gait analysis of the stance widthin Con, HU model, and FA-injected mice. Con: the wild-type mice; HU: hindlimb unloading; FA: formaldehyde.(e) Presumed mechanisms of HU-induced move disorders through SSAO-derived FA impairing FN-pathway.VL:ventrolateral nucleus of thethalamus.***P<0.001,ns P>0.05,n=8.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)標準模型組的后肢懸吊小鼠小腦頂核中甲醛生成酶——SSAO 的活性及表達急劇增加，導(dǎo)致小腦中甲醛蓄積、神經(jīng)元死亡，并伴隨運動功能紊亂；而向健康成年小鼠小腦頂核內(nèi)注射病理濃度的甲醛可以重現(xiàn)標準模型組的病理及行為特征。這說明航天失重導(dǎo)致小腦內(nèi)源甲醛蓄積，而過高濃度的甲醛是誘發(fā)小腦運動調(diào)節(jié)功能紊亂的關(guān)鍵原因（圖3e）。這提示消除小腦內(nèi)過多的甲醛可能有助于挽救航天失重誘發(fā)的運動功能失調(diào)。

人類經(jīng)過千萬年的進化，形成了與地球重力環(huán)境相適應(yīng)的生理結(jié)構(gòu)與功能特點。而宇航員長時間處于航天失重環(huán)境下人腦和身體出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變［20］。特別是宇航員完成長期太空飛行任務(wù)返回地面后，常常出現(xiàn)與神經(jīng)肌肉系統(tǒng)退化相關(guān)的運動功能障礙，如手靈活性降低［21］、肌肉萎縮、肌肉力量下降［22-23］、小腦共濟失調(diào)和空間定向障礙等表現(xiàn)［24］，嚴重影響航天員的健康和工作效率。急需在地面環(huán)境探索和開發(fā)能模擬航天失重病理特征的動物，為應(yīng)對航天失重的危害提供新的藥物篩選模型。本研究采用后肢懸吊法來制備模擬航天失重小鼠模型［25-26］。造模2 周后，行為學(xué)結(jié)果顯示，HU 組小鼠比對照組小鼠通過平衡木的時間延長、在轉(zhuǎn)棒上停留的時間縮短，較難保持身體的平衡；組織生化指標檢測結(jié)果顯示，HU 組小鼠腦內(nèi)和血液中的SSAO活性增強，甲醛代謝紊亂，導(dǎo)致小腦內(nèi)甲醛急劇蓄積。這說明航天失重誘發(fā)了小腦中甲醛蓄積，而高濃度的甲醛直接誘發(fā)神經(jīng)元死亡，破壞了小腦對運動功能的精細調(diào)節(jié)功能。

為探索小腦蓄積的甲醛是導(dǎo)致運動功能紊亂的直接誘因，本研究采用了頂核立體定位注射病理濃度的甲醛來制備新型模型，檢驗是否與標準的后肢懸吊模型的病理特征一致，包括SSAO 活性增強［27］，小腦甲醛蓄積，小腦神經(jīng)元數(shù)目減少，出現(xiàn)步態(tài)紊亂、平衡功能失調(diào)等。結(jié)果顯示，頂核注射組小鼠的小腦受損及運動功能紊亂與后肢懸吊準模型的生化指標、行為特征基本一致，特別是小腦頂核中內(nèi)源甲醛蓄積［28］。而過多的甲醛直接誘發(fā)神經(jīng)元死亡，破壞頂核到大腦皮層的運動環(huán)路，導(dǎo)致運動功能紊亂（圖3e）。

4 結(jié)論

本研究建立了航天失重病理特征的模型小鼠。此模型較好地模擬了失重環(huán)境下病理及運動行為的改變。這為探索失重環(huán)境下的運動障礙機制提供了新思路，同時也為應(yīng)對航天失重危害的藥物篩選提供了新的、潛在的動物病理模型。