斑馬魚“裂頭病”病原的分離與鑒定及常見疾病診斷*

柳力月 潘魯湲 孫永華

（中國科學院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室，國家水生生物種質資源庫國家斑馬魚資源中心，武漢 430072）

斑馬魚（Danio rerio）是開展脊椎動物遺傳發(fā)育及其代謝調節(jié)、人類疾病模型和藥物篩選、環(huán)境毒理、魚類生理與育種等研究的重要模式動物。

因性成熟周期短、繁殖可控、體外受精、體外發(fā)育、胚胎透明、管理方便等特點，斑馬魚（Danio rerio）已成為國際學術界應用最廣的實驗動物之一。為了保證斑馬魚的養(yǎng)殖健康和數(shù)據質量，實驗室飼養(yǎng)斑馬魚的養(yǎng)殖管理和疾病控制己成為研究過程中一個不容忽視的重要環(huán)節(jié)。然而，目前關于斑馬魚健康狀態(tài)的研究比較少，這在一定程度上限制了其在生命科學、健康科學、環(huán)境科學等各領域的推廣應用，也不利于中國斑馬魚研究的快速發(fā)展。自2012 年國家斑馬魚資源中心（China Zebrafish Resource Center，CZRC）成立以來，該中心長期致力于提供斑馬魚健康養(yǎng)殖咨詢服務，推廣規(guī)范的養(yǎng)殖技術方案，在斑馬魚健康養(yǎng)殖及魚病診療等方面積累了大量的數(shù)據和資料［1］。

“裂頭病”為近年來國內斑馬魚魚房中頻繁出現(xiàn)、死亡率高的新型魚病?！傲杨^病”過去在經濟魚類養(yǎng)殖中較為常見，主要出現(xiàn)在鲇形目的黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）和斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）中，由愛德華氏菌屬的細菌感染造成。但是關于該病致病機理尚不清晰，藥物治療效果有限，因此對其防治存在一定困難［2］。在斑馬魚魚房中，美國的實驗室分別于2013 年和2021 年報道過2 次，共計5 例“裂頭病”相關病例［3-4］。在2018年之前，CZRC未收集到國內斑馬魚魚房出現(xiàn)“裂頭病”的病例信息。2018 年1 月，CZRC 首次收到國內斑馬魚魚房出現(xiàn)“裂頭病”相關癥狀的魚病咨詢。2019 年7 月，CZRC 首次收集到“裂頭病”病魚。此后，中國斑馬魚魚房中陸續(xù)爆發(fā)多起裂頭病感染事件。

本文對該病的病原進行了分離和鑒定，確認其為鮰愛德華氏菌。同時，根據近5年來CZRC收集到的魚病數(shù)據，對國內斑馬魚魚房各類常見疾病及特征進行分析，并給出相應的魚房健康管理建議。

1 材料與方法

1.1 野生型斑馬魚

本文實驗使用的野生型斑馬魚為Tübingen 品系。斑馬魚飼養(yǎng)按照《實驗動物實驗魚質量控制》（GBT 39649-2020）進行養(yǎng)殖。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)

挑選表現(xiàn)出典型病癥，頭頂部位潰爛穿孔的“裂頭病”病魚個體（尚未死亡），安樂死后，用75%酒精擦拭全身消毒，在無菌操作臺中取裸露腦組織于100μl PBS 無菌緩沖液中勻漿，4000 r/min離心15 s 后，取上清涂布于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（brian heart infusion medium，BHIA，青島海博生物技術有限公司，貨號：HB8478）平板，培養(yǎng)48 h，分離病原菌。

1.3 16S rDNA基因序列鑒定及進化樹構建

使用DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號DP103）從純化培養(yǎng)的分離菌株中提取細菌基因組DNA，作為PCR模板。16S rDNA序列擴增引物如下：27F，5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'； 1492R， 5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。擴增條件：94℃預變性5 min，94℃30 s，55℃30 s，94℃90 s，30 個 循 環(huán)，94℃延 伸10 min，4℃保存。擴增產物經電泳檢測后送公司測序。測序結果通過NCBI中Blast檢索系統(tǒng)進行在線比對，選取與其同屬的細菌16S rDNA 基因序列，用MEGA7軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。選用鄰位相連法（neighbor-joining）獲得系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析（bootstraping）進行系統(tǒng)進化樹的評估自舉數(shù)據集為1000次。

1.4 生理生化特性鑒定

選取14 種常見生化指標進行生化測定，按細菌生化鑒定管（青島海博生物技術有限公司，貨號SHBG08）的說明對分離菌株進行測定，按《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行鑒定。

1.5 回歸感染試驗

將體長2～3 cm的野生型斑馬魚40尾暫養(yǎng)1周，水溫保持在27～28℃，未發(fā)現(xiàn)異常情況后，平均分成4組進行人工感染試驗。將分離菌株的培養(yǎng)物用0.80%無菌生理鹽水洗滌、重懸，麥氏比濁法稀 釋 菌 液 至1.5×1010CFU/L、 1.5×109CFU/L、1.5×108CFU/L 濃度梯度。取以上3 個濃度的菌懸液，采用腹腔注射方式對斑馬魚進行腹腔注射，每組注射10 尾魚，注射劑量為100μl/尾，同時設置生理鹽水對照組，連續(xù)觀察14 d，實驗期間不投喂，每天觀察記錄死亡情況。

2 斑馬魚“裂頭病”病原的分離與鑒定結果

2.1 “裂頭病”在中國斑馬魚魚房的發(fā)病趨勢與分布

2018年之前，CZRC未收集到國內斑馬魚魚房出現(xiàn)“裂頭病”的病例信息。2018 年1 月，CZRC首次收到國內斑馬魚魚房出現(xiàn)“裂頭病”相關癥狀的魚病咨詢。2019年7月，CZRC首次在國內斑馬魚魚房內收集到“裂頭病”病魚活體。之后相關發(fā)病數(shù)據和咨詢數(shù)量逐年增加：2018 年收集發(fā)病信息1例，2019年收集發(fā)病信息4例，2020年收集發(fā)病信息8例，2021年收集發(fā)病信息11例。5年共收集“裂頭病”發(fā)生信息24 例，分布于19 家斑馬魚魚房，魚房所在城市包括北京、上海、濟南、杭州、武漢、西安、重慶、南寧、廣州等地，無明顯地理位置偏好。對發(fā)病魚房進行的回訪調查顯示，發(fā)病魚房間無明顯的傳播關系，即發(fā)病之前3 個月，無斑馬魚或相關生物樣本的直接傳遞?！傲杨^病”的發(fā)病表現(xiàn)為，魚房內短時間爆發(fā)大量斑馬魚死亡，發(fā)病后1周內，整體致死率從10%至60%不等。病魚主要癥狀為體側皮膚紫斑、鰓蓋后部出血、頭頂部出血潰爛、頭頂穿孔，暴露整個腦組織等。病癥首次發(fā)現(xiàn)后，如繼續(xù)日常實驗工作，不進行控制，則在魚房內迅速傳播，主要傳播途徑為接觸式傳染及攝入式傳染，包括病魚傳染同缸其他魚、病死魚尸體被其他魚啃食、病魚與未染病魚交配產卵、對未染病魚使用了接觸過病魚且未消毒的漁撈和配種缸等。

2.2 病原的分離與純化

從患病斑馬魚的腦組織分離獲得一株優(yōu)勢菌落，在BHIA培養(yǎng)基經30℃、48 h培養(yǎng)后可形成灰白色、半透明、邊緣光滑、圓形細小菌落（圖1），選取其中1 株（E1）進行純化培養(yǎng)，以方便后續(xù)鑒定。

2.3 細菌16S rDNA基因序列測定與進化樹分析

菌株E1 進行16S rDNA 擴增后片段長度約為1400 bp。通過NCBI DNA數(shù)據庫BLAST分析，結果顯示，菌株E1 測序序列與GenBank 中鮰愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）序列的16S rDNA 序列一致性為100.00%，而與遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）序列的16S rDNA 序列一致性為99.65%。根據比對結果，構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)菌株E1與鮰愛德華氏菌序列聚為一類（圖2）。

2.4 病原的生理生化鑒定

鮰愛德華氏菌和遲緩愛德華氏菌生理生化反應存在細微差別：鮰愛德華氏菌為愛德華氏菌中生化活性最低的1 個種，其不產生H2S，且吲哚反應為陰性，遲緩愛德華氏菌則二者均為陽性［5］。因此對菌株E1 的常規(guī)生理生化進行測定，根據《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，菌株E1最終鑒定為鮰愛德華氏菌（表1）。

Fig.2 Phylogenetic tree of the 16S rDNA gene of isolated strain E1

Table 1 Physiological and biochemical characteristics of isolated strain E1

2.5 回歸感染試驗

將分離到的E1菌株培養(yǎng)菌懸液，梯度稀釋為3種濃度，分別對健康野生型斑馬魚進行腹腔注射，同時設置生理鹽水注射作為對照，4組樣品，每組10尾魚。注射3個梯度的菌懸液試驗組，在第2天陸續(xù)開始出現(xiàn)與自然發(fā)病相似的頭頂出血、頭頂骨潰爛至裸露整個腦組織（圖3）等癥狀，觀察14 d后死亡率達80%。對照組在觀察14 d內，無死魚出現(xiàn)，也無明顯疾病癥狀。從人工感染后出現(xiàn)病癥的病魚身上再次分離的菌株，與原感染菌分子序列、生化特征完全相同，證實所分離的菌株E1，即鮰愛德華氏菌，為斑馬魚“裂頭病”致病病原。

Fig.3 Natural infection and artificial infection of zebrafish“hole in the head”disease(a)Natural infection;(b)artificial infection;(c)negative control.

3 中國斑馬魚魚房近5年魚病分析

CZRC一直堅持為中國斑馬魚學界提供免費的魚房健康和魚病診療咨詢，從而收集到大批斑馬魚魚房病例信息。2017～2021 年CZRC 累計收集到來自全國65 家機構的78 個斑馬魚魚房的魚病病例121 例，發(fā)病數(shù)量逐年上升（圖4a）。對這些病例的病癥情況進行分析發(fā)現(xiàn)，主要病癥依次為：體表出血（30 例）、潰瘍（28 例）、頭頂穿孔并出血（23 例）、豎鱗（18 例）、腹水（17 例）、異常瘦弱（8例）、魚體有氣泡（8例）、附有白毛（3例）、爛鰓（2例）、魚鰭腐爛（1例）等。

分析發(fā)病原因發(fā)現(xiàn)，國內斑馬魚魚房50.4%的魚病是由于非生物因素直接或者間接導致的（圖4b）。這些非生物因素主要是設備系統(tǒng)故障或實驗操作不當引發(fā)水質問題，繼而誘發(fā)魚病。主要水質問題包括：pH 異常（19 例）、氨氮異常（13 例）、水溫異常（8 例）、溶氧異常（8 例）、紫外燈損壞（5例）等。

在已知病原中細菌性病原最為常見，占比83.46%，真菌類病原占比2.47%，寄生蟲類病原占比1.65%（圖4b）。

Fig.4 Statistical analysis of f zebrafish diseases in China(a) Statistics of consultation times for zebrafish disease; (b) statistics of the cause for zebrafish disease; (c) classification of bacterial pathogens in zebrafish;(d)statistics of etiology on regional characteristics.

在細菌性病原中，氣單胞菌屬占比34.65%，愛德華氏菌屬占比23.76%，弧菌屬占比8.16%，柱狀黃桿菌屬占比2.04%，而其他未知病原占比31.68%（圖4c）。檢出的氣單胞菌屬的病原主要為嗜水氣單孢菌和溫和氣單胞菌，都是條件性致病菌。愛德華氏菌屬的病原為鮰愛德華氏菌，也是條件性致病菌，但鮰愛德華氏菌感染導致的“裂頭病”傳播迅速，發(fā)病急，死亡率可超過50%［3-4］。

實驗用斑馬魚生活在室內循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)內，一般條件下情況受外界氣候環(huán)境影響較小，但是從目前掌握的數(shù)據來看，部分魚病的發(fā)生存在一定的地理位置偏好性（圖4d），其中真菌性疾病未在北方地區(qū)發(fā)現(xiàn)，而主要分布于長江流域及華南地區(qū)。

根據近5 年來CZRC 收集到的魚病咨詢數(shù)據，本文對國內斑馬魚魚房各類常見疾病及特征進行分析。

3.1 細菌性疾病

3.1.1 氣單胞菌屬細菌感染

氣單胞菌屬為國內斑馬魚魚房最常見病原，2017～2021 年在28 家斑馬魚魚房內發(fā)現(xiàn)34 例。其中以致病性嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）為最主要致病菌，它也是人畜水產動物共患病病原菌［6-8］。病原可通過受損的皮膚或鰓進入體內導致魚體表、鰓絲、眼眶嚴重充血發(fā)紅，腹部及身體兩側呈點狀或斑狀充血，鰭基充血發(fā)紅，嚴重病魚肌肉充血，眼球突出，部分或全部鱗片張開豎起似松果狀，造成豎鱗?。▓D5a）及細菌性敗血癥（圖5b）等［9-10］。該屬病原都屬于條件行致病菌，魚發(fā)病多為病原、體表損傷和環(huán)境因素共同作用的結果［9］。該病的初步診斷可以通過觀察外觀出血情況進行判斷，確診則需要分離病原菌，參照《致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法》（GB/T 18652-2002）進行。保持良好的水質和合理的養(yǎng)殖密度可有效預防致病性嗜水氣單胞菌感染，室內養(yǎng)殖斑馬魚中盡量避免魚體損傷，保存良好水質對于該病的早期預防具有重要意義。采用卡那霉素、慶大霉素等藥物進行藥浴治療具有一定的療效［9］。

3.1.2 鮰愛德華氏菌感染

在細菌性病原中，鮰愛德華氏菌為出現(xiàn)頻次第二的常見病原，2018 年以來在19 家斑馬魚魚房內發(fā)現(xiàn)24 例。病魚表現(xiàn)為食欲減退、游動遲緩，嚴重時頭朝上尾垂直向下懸浮，受到刺激時不停地快速旋轉或不規(guī)則游動；魚體腹部膨大，口腔、下頜、眼眶、鰓蓋、肛門及鰭條基部等部位明顯充血、出血，頭頂正中部位皮下發(fā)紅，頭背部顱側皮膚壞死、潰爛，病情嚴重的頭骨裂開暴露出腦組織［4］（圖3a）。該菌感染途徑有2 個：a.經鼻孔侵入嗅神經，然后進入腦內，最后侵害顱骨和皮膚；b.經腸壁進入血液引起敗血癥［3］。CZRC病原調查結果顯示，鮰愛德華菌感染近兩年來在國內多家斑馬魚實驗室內爆發(fā)，傳播迅速，死亡率高達50%，造成損失巨大；感染存活下來的斑馬魚依舊可以攜帶病原，其糞便經由水進入健康魚體，或者通過攝食已感染魚尸體而傳染給其他健康魚類造成第二次該類魚病爆發(fā)［12］。國內斑馬魚中分離出的鮰愛德華氏菌與其同屬的其他菌在16S rDNAs 上差別不大，但因該菌為愛德華菌中生化活性最低的1 個種，不能產生吲哚和H2S，該屬其他菌可產生吲哚和H2S，故鮰愛德華氏菌的鑒定方法推薦以傳統(tǒng)的生化分離鑒定為主，分子鑒定為輔。關于特異性鑒定鮰愛德華氏菌的方法還有待進一步開發(fā)。關于該病的防治，建議遵循“以防為主”的方針，即保持良好的養(yǎng)殖內外環(huán)境，嚴格衛(wèi)生管理，提高養(yǎng)殖斑馬魚的免疫力，做好外來魚的隔離，切斷一切可能的傳播途徑。再者，一旦魚房內出現(xiàn)鮰愛德華氏菌感染要及時撈出，所在缸內魚建議全部處死，所有接觸過病/死魚的漁具需全部消毒處理；如因研究需要無法全部處死同缸內其他魚，可考慮靜水養(yǎng)殖2～3 d，減少應激降低死亡率。

3.1.3 柱狀黃桿菌感染

幾乎所有的淡水魚類均對柱狀黃桿菌（Flavobacterium cloumnare）敏感［12-13］，在國內斑馬魚魚房內目前出現(xiàn)次數(shù)不多，僅發(fā)現(xiàn)2例，但造成的死亡率約30%。該病原感染斑馬魚體后體表部分區(qū)域體色變淺（圖5c），體表、鰭條、鰓絲腐爛，鰓蓋骨內表皮充血［12］。柱狀黃桿菌檢測先分離出病原菌，然后參照2007 年Panangala 等［14］建立的一種多重PCR 方法進行確認。預防該病的方法是避免養(yǎng)殖密度過高，保證良好水質，避免魚體損傷［15］。藥物治療方面，Bowker 等［16］研究顯示6～15 mg/L 氯胺T 重復浸泡可以治愈感染柱狀黃桿菌的鱖魚，但該藥物尚未在斑馬魚驗證。

3.2 寄生蟲類疾病

3.2.1 微孢子蟲感染

噬神經微孢子蟲（Pseudoloma neurophilia）為專性細胞內寄生真核生物，有報道該病原普遍存在于斑馬魚魚房內［17］。該病原通常寄生于斑馬魚腦、脊髓等部位，一般感染后無明顯外觀癥狀，發(fā)病嚴重的斑馬魚表現(xiàn)異常瘦弱，無光澤，脊柱彎曲（圖6a）［18］。噬神經微孢子蟲感染會影響斑馬魚生長繁殖［19］，對神經生物學及骨骼發(fā)育生物學方面的研究存在干擾［20-21］。該病原診斷可以參照Whipps等［18］發(fā)表的微孢子蟲PCR分子檢測方法，利用擴增引物Pn18S5F和Pn18S5R對病魚腦部組織微孢子蟲進行檢測。噬神經微孢子蟲的孢子體對消毒劑有抗藥性，F(xiàn)erguson 等［18］發(fā)現(xiàn)斑馬魚設施常規(guī)使用50 ppm 的次氯酸鈉消毒胚胎10 min 仍無法有效殺死其孢子體。因此，建議目前對斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)內微孢子蟲感染以預防為主，主要集中在對養(yǎng)殖水的紫外燈照度（照度大于30000 μw·s/cm2）進行控制［22］，此外引進魚的隔離和胚胎消毒也是目前阻斷微孢子蟲傳播的一項重要措施。

Fig.5 Bacterial diseases in zebrafish（white arrows point to typical symptom）(a) Scale protrusion; (b) bacterial septicemia; (c) gliding bacteria disease.

3.2.2 毛細線蟲感染

病 原 為 毛 細 線 蟲 （Pseudocapillaria tomentosa），雌蟲全長7～12 mm，雄蟲全長4～7 mm，蟲體大小肉眼可見［10］，是國內魚房檢出過的主要寄生蟲病原，過去5 年內有2 家斑馬魚魚房內出現(xiàn)過線蟲感染。病魚主要表現(xiàn)為體表發(fā)黑、游動緩慢、瘦弱、剖檢可見蟲卵或者蟲體。該病原主要寄生在斑馬魚的腸壁黏膜層，破壞組織，從而引起腸壁發(fā)炎［23］，因此病原診斷以腸道內剖檢或HE染色見到蟲體或蟲卵為據或者以分子方法在養(yǎng)殖環(huán)境或者魚組織內檢出蟲體DNA為據［24］。毛細線蟲可以采用三氯殺螨酮和甲苯咪唑的混合物進行有效治療［25］。在毛細線蟲的防控方面，建議要嚴格控制中間宿主寡毛綱蠕蟲，例如水蚯蚓等進入循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)內，魚卵表面消毒到位。

3.3 真菌類疾病

水霉菌（Saprolegnia）為國內斑馬魚房內出現(xiàn)的主要真菌感染病原，2017～2021 年，CZRC 共發(fā)現(xiàn)有3家實驗室出現(xiàn)過水霉感染。一般情況下，水霉在水體中廣泛存在，并不對魚的健康造成危害，但當魚體表受傷時，水霉菌孢子體可粘在傷口處，在魚體表面繁殖，導致魚或魚卵感染［10］，大量菌絲的附著可能增加魚體負擔，使魚游動遲緩，食欲減退，最終瘦弱而死。而在胚胎孵化過程中，該病也常發(fā)生，其菌絲黏附在卵上然后穿透卵膜引起卵死亡，又稱卵絲?。?0］。斑馬魚感染后?？梢婔~體表覆蓋一層白色棉花狀的絮狀物（圖6b）。由于水霉病的發(fā)生主要與體表受傷密切相關，對該病的預防主要是避免魚體受傷，魚卵養(yǎng)殖密度不可太高，防止氧氣不夠窒息死亡感染水霉后再危及其他健康魚卵［9］。在斑馬魚水霉病防治方面發(fā)現(xiàn)，患病早期用2.5 mg/L的亞甲基藍浸泡有一定作用。

3.4 水質因素引起的中毒

3.4.1 氣體中毒

當水中總的溶解氣體或是氮氣過飽和都可引起魚類氣體中毒，俗稱氣泡?。?6-28］，該病是國內斑馬魚魚房內已知出現(xiàn)的發(fā)病最急、死亡率最高的一種疾病。2017～2021 年，氣體中毒事件共在8 家使用自動化循環(huán)系統(tǒng)的斑馬魚魚房內發(fā)生過，造成的死亡率高達80%。氣泡病可分為急性氣泡病和慢性氣泡病。急性氣泡病可見魚鰓、背鰭、胸鰭、腹鰭等部位有無法消除的小氣泡（圖6c），同時還會造成下頜及鰓蓋基部充血，突眼；急性氣泡病多數(shù)發(fā)病快，難以控制，造成損失嚴重［29-31］。而慢性氣泡病則表現(xiàn)為腸道出現(xiàn)氣泡［28］，一般造成的死亡量較小，但隨之而來會有繼發(fā)性感染影響魚的健康［32］。斑馬魚魚房內，氣泡病的主要發(fā)生原因為增氧泵故障、循環(huán)系統(tǒng)溶氧探頭故障、人為操作不當?shù)取Ｗ罱K管道內積壓多余氣體使系統(tǒng)水氣體過飽和，這些過飽和部分氣體游離出來，在水中形成微小氣泡，氣泡在魚鰓部阻塞血液循環(huán)從而影響鰓部的生理功能，造成斑馬魚急性死亡；或者導致斑馬魚機體生理功能受到影響后免疫力降低，容易產生繼發(fā)性感染，進而導致斑馬魚大批量出現(xiàn)爛身、潰瘍、爛鰓、水霉、甚至死亡［26］。魚房內氣泡病應以預防為主，宜實時監(jiān)測水體含氧量并設立自動報警，應定期檢修增氧泵、溶氧探頭、進水管等元器件，應嚴格按照規(guī)范操作更換循環(huán)系統(tǒng)的過濾耗材，應嚴格控制進入循環(huán)系統(tǒng)的水溫，不可相差太大。一旦發(fā)現(xiàn)有魚出現(xiàn)氣泡病癥時，應立即關閉增氧泵，排出系統(tǒng)水，同時注入溫度較低的水，在系統(tǒng)內加入適量海鹽也可以改變魚體皮膚滲透壓，使患病魚體內的氣泡逸出體外從而在一定程度上緩解氣泡病。

3.4.2 氨氮中毒

養(yǎng)殖水體中的氨氮主要以兩種存在形式：非離子氨（NH3）和離子氨（NH4+）。其中，NH3對所有養(yǎng)殖動物均具有致毒性，而離子氨的毒性較小或無毒；通常所說的氨氮中毒主要是指NH3超標引起的魚病。過去5 年內，CZRC 供收集到國內斑馬魚魚房發(fā)生的13 例氨氮異常死魚事件。氨氮中毒的斑馬魚體表發(fā)紅、鰓發(fā)暗紅、鰓絲腫脹、呼吸急促、四處游竄［33］，常見皮膚潰爛（圖6d）。由于非離子氨不帶電荷，容易穿透脂質性生物膜的疏水性微孔進入生物體內，可對魚類造成諸多不利的影響，例如損傷魚類的鰓組織，導致組織充血，影響氣體交換，呼吸下降導致個體缺氧［34-36］。斑馬魚氨氮中毒現(xiàn)象多見于長途運輸后進入新循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的情況，或發(fā)生于硝化菌群失衡的養(yǎng)殖系統(tǒng)內。日常管理中，需定期監(jiān)控養(yǎng)殖水體NH3的含量，一旦發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)氨氮含量超標，應立即增大系統(tǒng)換水量，加入硝化細菌有助于重建和穩(wěn)定水處理系統(tǒng)中硝化菌群，平衡氨氮含量。

Fig.6 Parasites disease,fungi disease,water quality caused problems in zebrafish(white arrows point to typical symptom)(a)Microsporidiosis;(b)saprolegniasis;(c)gas bubble disease;(d)ammonia toxicity.

4 討論

中國的斑馬魚研究在近10 年來取得突飛猛進的發(fā)展，越來越多的實驗室建立斑馬魚魚房。與之相隨，魚病病例數(shù)量也逐漸增加。國內魚房近5年的魚病咨詢數(shù)目急劇增長，其中細菌性感染最多。在細菌性感染案例中，約38%是由于設備維護不當導致水質（pH、氨氮、水溫、溶氧）或紫外燈殺菌功能異常引起繼發(fā)性細菌感染死魚，此外單純由設備維護不當，造成水質問題引起的死魚也占比12.39%。因此對自動化循環(huán)養(yǎng)殖設備進行定期維護，對于斑馬魚健康養(yǎng)殖十分重要。在可追溯病原的魚病病例中，細菌類疾病占比83.6%，這很可能是因為斑馬魚并非生活在一個無菌的環(huán)境下，養(yǎng)殖水體、飼料、糞便排泄物及室內空氣均存在有很多細菌，這些細菌在特定因素下可以變成病原感染斑馬魚造成魚病。與之相對，自動化循環(huán)可控過濾養(yǎng)殖系統(tǒng)及嚴格的魚卵消毒措施，在一定程度上可有效減少生活環(huán)境中寄生蟲類病原的影響，因此寄生蟲類疾病僅占比1.7%。

“裂頭病”斑馬魚是近幾年國內斑馬魚魚房內出現(xiàn)的一種新型魚病，其發(fā)病急、傳播快、死亡率高，本文通過對“裂頭病”病原進行分離和鑒定，最終確定該病原為鮰愛德華氏菌。在收集到的魚病數(shù)據中發(fā)現(xiàn)，從2018 年起有18 家斑馬魚魚房共累計出現(xiàn)24次（2018年1例、2019年4例、2020年8例、2021 年11 例）鮰愛德華氏菌的感染，總發(fā)病數(shù)目呈逐年增加的趨勢。然而，這些魚房之間也缺少具有明確關聯(lián)性傳播鏈，因此懷疑該病原是某種環(huán)境因素引入，后續(xù)將做進一步追蹤研究。在這些病例中也發(fā)現(xiàn)，該病原可通過魚體接觸傳播或吞食傳播；也可以通過接觸過病魚且未消毒的漁撈和配種缸等養(yǎng)殖器皿傳播。一些常見的抗菌藥物無法有效控制住病情。同時還發(fā)現(xiàn)，該病征首次出現(xiàn)后，如不進行人為控制（如衛(wèi)生管理和隔離措施），該病會在魚房內迅速傳播導致高死亡率，發(fā)病2周左右，整體死亡率逐漸降低，但在3～6個月之后，該病往往又卷土重來。因此，嚴格的魚房衛(wèi)生管理和隔離措施被認為是目前最有效控制鮰愛德華氏菌的手段。

實驗室飼養(yǎng)的斑馬魚大多數(shù)時候生活于流動的水體，其活動不易被察覺，病魚往往無法被及時發(fā)現(xiàn)，即使發(fā)現(xiàn)也治療困難。因此日常斑馬魚魚房的工作中，需要牢固樹立“防重于治”的思想，盡量完善并落實日常環(huán)境衛(wèi)生及設備管理制度，把日常巡視、設備維護和水質監(jiān)控作為維系魚房健康必不可少的重點工作。盡管2020 年《實驗魚質量控制標準》（GB∕T 39649-2020）對實驗用斑馬魚養(yǎng)殖環(huán)境、遺傳質量、病原檢疫等幾個方面進行規(guī)范，但整體而言，斑馬魚研究領域尚缺乏一套斑馬魚魚病診斷、魚房健康及日常管理操作的詳細標準與規(guī)范。本文通過總結CZRC在日常工作實踐中收集到的各類健康養(yǎng)殖問題，對一些常見斑馬魚疾病給出了在實驗室目前所知的切實可行的診斷、預防或者治療方案，為今后疾病的診斷和防治提供一定的依據和參考，預期更好的服務于斑馬魚科學家和科研工作。

5 結論

本文對“裂頭病”的病原進行了分離和鑒定，并根據近5年來CZRC收集到的魚病數(shù)據，對國內斑馬魚魚房中出現(xiàn)的各類常見疾病及特征進行分析。結果發(fā)現(xiàn)：“裂頭病”病原為鮰愛德華氏菌；斑馬魚疾病發(fā)病率最高的為細菌性疾病，近一半斑馬魚健康問題是由非生物因素直接或者間接導致的，致死率最高的情況是氣體中毒。這為斑馬魚房健康管理提供了重要的參考數(shù)據，有力地證明了設備良好運轉、水質優(yōu)良穩(wěn)定是保證斑馬魚健康的重要前提，嚴格的魚房日常衛(wèi)生管理是防止魚病發(fā)生的主要手段，細菌性疾病的預防是斑馬魚養(yǎng)殖的重中之重。