一種分離培養(yǎng)及鑒定小鼠牙齦間充質干細胞的方法

陳麗玲 徐振健 徐安平

【摘要】 目的 探討建立一種新型、簡便易行的小鼠牙齦間充質干細胞（GMSC）體外提取及培養(yǎng)方法。方法 選擇C57BL/6小鼠，使用Ⅳ型膠原酶消化分離其牙齦組織，種板培養(yǎng)并傳代。利用細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（CCK-8法）觀察小鼠GMSC的增殖規(guī)律，流式細胞術檢測小鼠GMSC的細胞表面標志物，進行成脂、成骨誘導分化實驗，觀察所提取GMSC的多向分化潛能。結果 CCK-8試驗顯示小鼠GMSC在培養(yǎng)第3～4日增殖活躍（第2～5日相鄰時間點間，P均< 0.05），第5日開始增殖進入平臺期（第5～8日的相鄰時間點間比較，P均> 0.05）。流式細胞術結果顯示，與小鼠口腔黏膜上皮細胞相比，GMSC高表達CD29、CD44、CD73、CD90和CD105（P均< 0.05），幾乎不表達CD34、CD45（P均> 0.05）;多向分化誘導實驗中，GMSC成功分化為對應的組織細胞，證實了GMSC的多向分化功能。結論 本研究成功提取小鼠GMSC，首次發(fā)現了一種新的、操作簡便的、對原代細胞傷害少且有較高細胞獲得率的科學提取GMSC方法，并鑒定了其細胞標志物和分化功能。

【關鍵詞】 牙齦間充質干細胞;提取培養(yǎng);誘導分化;鑒定

【Abstract】 Objective To establish a novel and simple method for isolation and culture of mouse gingival mesenchymal stem cells （GMSCs） in vitro. Methods The gingival tissues from C57BL/6 mice were separated and digested with type IV collagenase， cultured in a dish and passaged. The proliferation pattern of mouse GMSCs was investigated by Cell Counting Kit-8 （CCK-8） assay. The surface markers of GMSCs were detected by flow cytometry， and adipogenic and osteogenic differentiation experiments were carried out to explore the multi-directional differentiation potential of the extracted GMSCs. Results CCK8 assay showed that mouse GMSCs actively proliferated at 3 to 4 d after culture （all P < 0.05 between any two consecutive days from 2nd to 5th d）， and began to become steady on day 5 （all P > 0.05 between any two consecutive days from 5th to 8th d）. Flow cytometry showed that GMSCs highly expressed CD29， CD44， CD73， CD90 and CD105 （all P < 0.05）， but basically did not express CD34 and CD45 compared with mouse oral mucosal epithelial cells （both P > 0.05）. Multi-directional differentiation induction experiment demonstrated that GMSCs successfully differentiated into corresponding tissue cells， confirming the multi-directional differentiation potential of GMSCs. Conclusions In this study， mouse GMSCs are successfully isolated by a new and simple method for the first time， which causes slight damage to primary cells and yields high cell acquisition rate. The cell markers and differentiation function are also identified.

【Key words】 Gingival mesenchymal stem cell; Isolation and culture; Induction differentiation; Identification

間充質干細胞（MSC）具有自我更新、多能分化和免疫調節(jié)的作用。近年研究顯示，MSC可在包括變應性結膜炎、變應性鼻炎、急性青光眼、阿爾茨海默病和1型糖尿病等多種疾病中發(fā)揮治療作用[1-6]。MSC可以從不同的組織中分離出來，包括骨髓、臍帶、胎盤、脂肪組織和人的牙齦[7]。牙齦MSC（GMSC）是一種從牙齦組織中獲得的MSC亞群，2009年Zhang等首次從人牙齦組織中分離出GMSC，并證實了其表型及功能活性[8]。與其他MSC類似，GMSC也具有抑制炎癥和調節(jié)免疫反應的作用。小鼠和人源化動物模型研究顯示，GMSC能夠通過減少效應性T淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、破骨細胞和增加調節(jié)性T淋巴細胞等治療包括類風濕關節(jié)炎、1型糖尿病、SLE、動脈粥樣硬化等多種疾病[7， 9-14]。既往文獻提及的小鼠GMSC的提取方法需使用多種酶及復雜的培養(yǎng)基等[15-16]。本研究以C57BL/6小鼠進行實驗，旨在建立更為簡便、高效的GMSC體外提取及培養(yǎng)體系，現報道如下。

材料與方法

一、動 物

SPF級C57BL/6小鼠5只，雌雄不限，8～10周齡，體質量15～20 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。實驗過程中嚴格遵循減少、替代、優(yōu)化的倫理規(guī)范操作，做到充分考慮動物的利益，善待動物，防止或減少動物的應激、痛苦和傷害，尊重動物生命，采取痛苦最少的方法處置動物。

二、主要試劑

包括：α-MEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清（FBS），均購自美國Gibco公司;Ⅳ型膠原酶、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、人胰島素、油紅O染液，均購自美國Sigma公司;細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（CCK-8法）購自美國APExBio公司;結晶紫染液、茜素紅染液，均購自上海碧云天生物技術有限公司;抗小鼠流式抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105，均購自美國BD公司。

三、培養(yǎng)液配制

原代細胞培養(yǎng)液為α-MEM培養(yǎng)基+20%FBS。完全培養(yǎng)液為α-MEM+10%FBS。成脂誘導液為α-MEM培養(yǎng)基+10%FBS+200 μmol/L吲哚美辛+10 mg/L胰島素+1 μmol/L地塞米松+500 μmol/L?IBMX。成骨誘導液為α-MEM+10%FBS+10 nmol/L地塞米松+50 mg/L抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉。

四、實驗方法

1. 小鼠GMSC的分離培養(yǎng)

處死C57BL/6小鼠，取小鼠下頜骨，清除多余皮膚及肌肉組織，用含有5%雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗下頜骨多次。用注射器針頭輕輕分離磨牙區(qū)牙齦。收集分離到的組織于培養(yǎng)皿中，加入1 mg/L Ⅳ型膠原酶，于37 ℃中消化30 min，加入含有 FBS的α-MEM終止消化，離心，棄上清。將組織鋪于6孔板中，每孔加1 ml含20%FBS的α-MEM，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待2～3 d后細胞爬出，換液把剩余組織塊洗出，每孔加2 ml 20%FBS的α-MEM，3 d換1次液。細胞長滿板底80%后傳代，傳代后更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2. 小鼠GMSC的增殖能力檢測

按細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（CCK-8法）說明書進行操作，連續(xù)8 d在同一時間使用酶標儀測量 450 nm 處的吸光度，根據結果繪制GMSC生長曲線。

3. 小鼠GMSC的表面標志物流式細胞術檢測

將第2代 GMSC（約1×106個細胞）細胞懸液用PBS洗滌2次，用100 μl PBS重懸后分別加入流式抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105，4℃避光孵育20 min后，PBS洗滌3次，流式細胞儀檢測上述細胞表面標志物的表達。

4. 小鼠GMSC的多向分化潛能誘導

成脂誘導分化：取第2代GMSC接種于6孔板，每孔約3×103個細胞，待細胞鋪滿板底70%，更換培養(yǎng)液為成脂誘導液，每隔3 d換1次液。誘導21 d后，PBS洗滌細胞1次，4%多聚甲醛固定30 min，去離子水洗滌2次后油紅O染液染色20 min，蒸餾水清洗3次，干燥后倒置顯微鏡下觀察并拍照。

成骨誘導分化：取第2代GMSC接種于6孔板，每孔約3×103個細胞，待細胞鋪滿板底70%，更換為成骨誘導液，每隔3 d換1次液。誘導28 d后，PBS洗滌細胞1次，4%多聚甲醛固定30 min，去離子水洗滌2次后茜素紅染液染色30 min，蒸餾水清洗3次，干燥后倒置顯微鏡下觀察并拍照。

五、統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析。數據均符合正態(tài)分布，以? 表示，組間比較采用t檢驗，多個時間點的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、小鼠GMSC的分離培養(yǎng)結果

培養(yǎng)2～3 d后，普通光學倒置顯微鏡下可見原代細胞從組織爬出，貼壁生長，細胞呈長梭狀（圖1A）?？梢娫毎囵B(yǎng)至10～14 d時細胞鋪滿皿底80%（圖1B、C），可進行傳代培養(yǎng)。

二、小鼠GMSC的增殖能力檢測結果

CCK-8法結果顯示，GMSC在第3～4日增長最快，在第5～8日增長變得緩慢，出現平臺期。普通光學倒置顯微鏡下可見GMSC在第3～4日數量增長明顯，在第5～8日數量逐漸到達最大值，并進入平臺期。各時間點的變化組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 339.90，P < 0.001）， 其中第0～2日、第5～8日的相鄰時間點比較差異無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），第2～5日相鄰時間點比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均< 0.05），見圖2。

三、小鼠GMSC的細胞表面標志物流式細胞術檢測結果

小鼠GMSC高表達CD29、CD44、CD90、CD105，最高的表達率達90%及以上，CD73最高表達率高于70%，CD39最高表達率為26.3%，同時結果顯示所提取細胞幾乎不表達CD34、CD45，表達率均低于5%，說明所提取的細胞純度較高。以小鼠口腔黏膜上皮細胞為對照細胞，可見GMSC的CD29（t = 2.686，P = 0.036）、CD44（t = 22.582，P < 0.001）、CD73（t = 3.183，P = 0.019）、CD90（t = 62.944，P < 0.001）、CD105（t = 8.590，P < 0.001）、CD39（t= 5.799，P < 0.001）的表達均高于對照細胞，兩者CD34（t = 1.572，P = 0.140）、CD45（t = -1.643，P = 0.151）表達相似，見圖3。

四、小鼠GMSC的成脂誘導及鑒定結果

小鼠GMSC經成脂誘導液培養(yǎng)21 d后，分化為脂肪細胞并分泌出脂滴，經油紅O染液染色后，在光學顯微鏡下可見葡萄串狀紅色脂滴形成，見圖4。

五、小鼠GMSC的成骨誘導及鑒定結果

小鼠GMSC經成骨誘導液培養(yǎng)后，細胞逐漸從長紡錘形變?yōu)槎噙呅?，并呈多層覆蓋生長，可見陸續(xù)出現小的鈣化。成骨誘導28 d后，小鼠GMSC經茜素紅染液染色后可見紅褐色鈣化結節(jié)，見圖5。

討 論

近年來，GMSC在自身免疫性和炎癥性疾病中的抗炎和免疫調節(jié)作用越來越受到重視[17]。與其他組織來源的MSC相比，GMSC具有易于分離、便于獲取、增殖快、不具致瘤性、同源性好、免疫調節(jié)作用及再生功能強于其他MSC等優(yōu)點[18-20]。

目前，小鼠等動物GMSC的提取方法為組織消化法或組織塊法：組織消化法使用膠原酶和分離酶消化分離的組織塊，再通過過濾器獲得單細胞懸液進行種板，操作步驟繁雜，且多種酶的消化易對原代GMSC造成損傷，導致細胞提前分化失去其生物學特性;組織塊法則將沖洗無菌的組織塊直接種板，通過倒立培養(yǎng)瓶的方法獲取原代細胞，該法提取細胞數量少、效率低且成功率不穩(wěn)定[15]。

本研究將2種提取原代GMSC的方法相結合并加以改良，對分離的牙齦組織僅用Ⅳ型膠原酶消化半小時，然后把消化后的牙齦組織直接種板，2～3 d后可見細胞爬出。由此可見該改良方法具有以下優(yōu)點：①步驟過程簡單、易操作;②僅用一種消化酶，減短了消化時間，不僅減少了消化酶對原代細胞的損傷，而且節(jié)約了試劑成本;③經膠原酶處理的牙齦組織變軟后再進行種板，更有利于種板后GMSC從組織中爬出，短時間內有較高的細胞獲得率，節(jié)約時間成本，同時通過換液、傳代可進一步純化細胞;④培養(yǎng)液成分更為簡單。與組織消化法及組織塊法相比，新的提取GMSC方法更為簡便、易行，見表1。

本研究中小鼠GMSC生長曲線從一定程度上可反映GMSC的增殖規(guī)律，第3～4日增殖活躍，第5日始增殖進入平臺期，第7～8日由于培養(yǎng)時間過長細胞生長過密，細胞開始出現凋亡，數量有少許下降。本研究所提取的細胞高表達CD29、CD44、CD90、CD105，最高表達率均高于90%，CD73最高表達率高于70%，基本不表達造血細胞的細胞表面標志物CD34、CD45，最高表達率均低于5%，符合GMSC細胞標志物特性，同時提示所取取的細胞純度較高。多向分化誘導實驗中，小鼠GMSC在各自特定誘導條件下成功分化成對應組織，證實了GMSC的多向分化功能。本研究表明，改良法提取的GMSC具有快速增殖的優(yōu)點，同時通過該法所分離的細胞有較高的純度，且能表現多向分化的干細胞特性，因此該法提取GMSC是可行的。

對GMSC的相關研究表明，GMSC在倫理學、獲取方法和分化潛能等方面具有明顯優(yōu)勢，被認為是一種較好的MSC來源，在細胞治療、再生醫(yī)學等方面具有重要的研究意義[21-22]。本研究的動物GMSC提取技術的研究與改良有助于促進各類疾病動物模型GMSC的自體移植的實現，有利于深入研究GMSC對疾病治療作用的可能機制。

參 考 文 獻

[1] Su W， Wan Q， Huang J， et al. Culture medium from TNF-α-stimulated mesenchymal stem cells attenuates allergic conjunctivitis through multiple antiallergic mechanisms. J Allergy Clin Immunol， 2015， 136（2）： 423-432.e8.

[2] Fan X L， Zeng Q X， Li X， et al. Induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells activate quiescent T cells and elevate regulatory T cell response via NF-κB in allergic rhinitis patients. Stem Cell Res Ther， 2018， 9（1）： 170.

[3] Su W， Li Z， Jia Y， et al. microRNA-21a-5p/PDCD4 axis regulates mesenchymal stem cell-induced neuroprotection in acute glaucoma. J Mol Cell Biol， 2017， 9（4）： 289-301.

[4] Shin J Y， Park H J， Kim H N， et al. Mesenchymal stem cells enhance autophagy and increase β-amyloid clearance in Alzheimer disease models. Autophagy， 2014， 10（1）： 32-44.

[5] Stiner R， Alexander M， Liu G， et al. Transplantation of stem cells from umbilical cord blood as therapy for type I diabetes. Cell Tissue Res， 2019， 378（2）： 155-162.

[6] 石凌峰， 任宇， 楊新娜，等. 間充質干細胞治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究進展. 新醫(yī)學， 2015， 46（9）： 574-579.

[7] Zhang X， Huang F， Li W， et al. Human gingiva-derived mesenchymal stem cells modulate monocytes/macrophages and alleviate atherosclerosis. Front Immunol， 2018， 9： 878.

[8] Zhang Q， Shi S， Liu Y， et al. Mesenchymal stem cells derived from human gingiva are capable of immunomodulatory functions and ameliorate inflammation-related tissue destruction in experimental colitis. J Immunol， 2009， 183（12）： 7787-7798.

[9] Wu W， Xiao Z X， Zeng D， et al. B7-H1 promotes the functional effect of human gingiva-derived mesenchymal stem cells on collagen-induced arthritis murine model. Mol Ther， 2020， 28（11）： 2417-2429.

[10] Luo Y， Wu W， Gu J， et al. Human gingival tissue-derived MSC suppress osteoclastogenesis and bone erosion via CD39-adenosine signal pathway in autoimmune arthritis. EBioMedicine， 2019， 43： 620-631.

[11] Wu W， Xiao Z， Chen Y， et al. CD39 produced from human GMSCs regulates the balance of osteoclasts and osteoblasts through the Wnt/β-catenin pathway in osteoporosis. Mol Ther， 2020， 28（6）： 1518-1532.

[12] Chen M， Su W， Lin X， et al. Adoptive transfer of human gingiva-derived mesenchymal stem cells ameliorates collagen-induced arthritis via suppression of Th1 and Th17 cells and enhancement of regulatory T cell differentiation. Arthritis Rheum， 2013， 65（5）： 1181-1193.

[13] Zhang W， Zhou L， Dang J， et al. Human gingiva-derived mesenchymal stem cells ameliorate Streptozoticin-induced T1DM in mice via suppression of T effector cells and up-regulating Treg subsets. Sci Rep， 2017， 7（1）： 15249.

[14] Dang J， Xu Z， Xu A， et al. Human gingiva-derived mesenchymal stem cells are therapeutic in lupus nephritis through targeting of CD39 - CD73 signaling pathway. J Autoimmun， 2020， 113： 102491.

[15] Xu X， Chen C， Akiyama K， et al. Gingivae contain neural-crest- and mesoderm-derived mesenchymal stem cells. J Dent Res， 2013， 92（9）： 825-832.

[16] Gu Y， Shi S. Transplantation of gingiva-derived mesenchymal stem cells ameliorates collagen-induced arthritis. Arthritis Res Ther， 2016， 18（1）： 262.

[17] Wang X， Song H， Zhao S， et al. Gingival-derived mesenchymal stem cells protect against sepsis and its complications. Infect Drug Resist， 2021， 14： 3341-3355.

[18] Huang F， Chen M， Chen W， et al. Human gingiva-derived mesenchymal stem cells inhibit xeno-graft-versus-host disease via CD39-CD73-adenosine and IDO signals. Front Immunol， 2017， 8： 68.

[19] Al Bahrawy M， Ghaffar K， Gamal A， et al. Effect of inflammation on gingival mesenchymal stem/progenitor cells’ proliferation and migration through microperforated membranes： an in vitro study. Stem Cells Int， 2020， 2020： 5373418.

[20] Ni X， Xia Y， Zhou S， et al. Reduction in murine acute GVHD severity by human gingival tissue-derived mesenchymal stem cells via the CD39 pathways. Cell Death Dis， 2019， 10（1）： 13.

[21] Zhao J， Wang J， Dang J， et al. A preclinical study-systemic evaluation of safety on mesenchymal stem cells derived from human gingiva tissue. Stem Cell Res Ther， 2019， 10（1）： 165.

[22] Kim D， Lee A E， Xu Q， et al. Gingiva-derived mesenchymal stem cells： potential application in tissue engineering and regenerative medicine — a comprehensive review. Front Immunol， 2021， 12： 667221.

（收稿日期：2022-01-20）

（本文編輯：林燕薇）