枸櫞酸鎂激活鈣敏感受體抑制高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化

姚智會(huì)，韓 拓，范雅潔，鞏 紅，王麗霞，王怡雯，王聰霞

（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管病院，陜西西安 710004）

血管鈣化是慢性腎衰竭（chronic renal failure,CRF）患者常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥，目前國內(nèi)外缺乏有效治療方案[1]。CRF 患者的血管鈣化發(fā)生率顯著高于普通人群，54%～100% 的慢性腎衰竭終末期（ESRD）行透析患者存在不同程度的血管鈣化[2-3]。本課題組前期的meta 分析也顯示，全球范圍內(nèi)有68.5% ESRD 維持性透析患者存在腹主動(dòng)脈鈣化[4]。血管鈣化的存在使得血管壁僵硬度增加，順應(yīng)度降低，進(jìn)而導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生。血管鈣化是CRF患者心血管死亡率和全因死亡率增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。如果能有效抑制血管鈣化，則能顯著降低CRF患者的死亡率[1]。

鎂參與機(jī)體的多種生物學(xué)過程，如心臟節(jié)律、血管收縮和骨代謝等。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)鎂能有效抑制CRF 血管鈣化的發(fā)生發(fā)展[5]。在非糖尿病透析患者中，存在血管鈣化的患者與不存在鈣化的患者相比，血鎂水平顯著降低，這表明鎂是血管鈣化的保護(hù)性因素[6]。鎂鹽分無機(jī)鎂鹽（如硫酸鎂，氯化鎂）和有機(jī)鎂鹽（如枸櫞酸鎂，magnesium citrate, MgCit），在生物利用度和胃腸道不良反應(yīng)等方面，有機(jī)鎂鹽比無機(jī)鎂鹽的優(yōu)勢(shì)更明顯[7]。然而，檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，關(guān)于鎂抑制CRF 血管鈣化的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都采用無機(jī)鎂，有機(jī)鎂是否也能抑制細(xì)胞和動(dòng)物血管鈣化，未見相關(guān)研究。前期，本課題組利用CRF 血管鈣化大鼠模型，首次闡明MgCit 在體內(nèi)發(fā)揮抑制CRF 血管鈣化的作用[8]。本研究利用高磷誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）鈣化，探索MgCit 在VSMCs 鈣化中的作用，并初步探索其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

β-甘油磷酸（β-glycerophosphate, β-GP）、NPS-2143（鈣敏感受體抑制劑）購自上海源葉公司，鈣檢測試劑盒購自南京建成公司，Alizarin 染液購自西安赫特公司，堿性磷酸酶試劑盒購自碧云天生物科技公司，RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 反應(yīng)試劑盒購自TaKaRa 公司，核心轉(zhuǎn)錄因子（runt-related transcription factor 2, RUNX2）、骨形態(tài)蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）和平滑肌22α（smooth muscle 22 α,SM22α）的引物購自TaKaRa 公司，α-SMA和BMP2 一 抗 均 購 自ProteinTech，Runx2 一 抗 購 自Abcam 公司。

1.2 VSMCs 鈣化模型和分組

實(shí)驗(yàn)所用大鼠胸大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞A7r5（貨號(hào)：CL-0316）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。用含有50 g/mL 胎牛血清、10 g/mL 青-鏈霉素混合液、10 mmol/L β-GP 的DMEM 溶液培養(yǎng)VSMCs，定期更換新的培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d 誘導(dǎo)VSMCs 鈣化。細(xì)胞分為①對(duì)照組：普通培養(yǎng)基；②鈣化組：含10 mmol/L β-GP；③1.5 mmol/L MgCit 組：含10 mmol/L β-GP和1.5 mmol/L MgCit；④3 mmol/L MgCit 組：含10 mmol/L β-GP 和3 mmol/L MgCit；⑤MgCit+NPS2143 組：含10 mmol/L β-GP、3 mmol/L MgCit和15 μmol/L NPS2143。

1.3 茜素紅染色

在蓋玻片上培養(yǎng)VSMCs，14 d 后棄去培養(yǎng)基，加入40 g/L 多聚甲醛固定10 min，PBS 洗滌后加入茜素紅染液，適當(dāng)孵育后PBS 沖洗；玻片在丙酮溶液中蘸20 下，在二甲苯與丙酮混合液中蘸20 下，在純二甲苯溶液中靜置5 min，封片，顯微鏡下觀察和拍照；Image J 軟件半定量分析橙紅色顆粒樣物質(zhì)。

1.4 胞內(nèi)鈣含量檢測

棄去培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 清洗后用2.5 g/L胰酶消化細(xì)胞并將細(xì)胞分成兩份：一份利用BCA 法檢測蛋白濃度，另一份在細(xì)胞沉淀中加入0.6 mol/L的稀鹽酸溶解細(xì)胞內(nèi)羥基磷灰石結(jié)晶（4 ℃，24 h）。根據(jù)鈣檢測試劑盒說明書，用甲基麝香草酚藍(lán)絡(luò)合法測定鹽酸溶液提取物中的鈣含量；最終鈣濃度用蛋白含量標(biāo)化。

1.5 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測

用不含堿性磷酸酶的RIPA 裂解液在冰上裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，4 ℃、12 000 g 離心10 min，取上清液，分成兩部分，一部分用BCA 法檢測蛋白濃度；另一部分按照堿性磷酸酶試劑盒說明書操作，即加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)，混勻，37 ℃孵育15 min，每孔加入100 μL反應(yīng)終止液，檢測吸光度A 值，用血管中的總蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化ALP 活性。

1.6 qRT-PCR 檢測VSMCs 成骨樣轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白的mRNA 表達(dá)

按照RNAiso Plus 試劑盒的步驟提取細(xì)胞總RNA；用NanoDrop 檢測提取RNA 的濃度和純度；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA；根據(jù)熒光PCR 試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)；以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。本研究所用到的引物序列見表1。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.7 免疫組化檢測VSMCs 成骨樣轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄去孔板中細(xì)胞培養(yǎng)上清液，PBS 清洗后40 g/L 多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗；用含Triton X-100 的PBS 溶液透膜20 min（膜表達(dá)抗原BMP2 省略該步驟，核表達(dá)抗原RUNX2 包含此步驟），PBS 清洗；用50 g/L BSA 溶液室溫封閉20 min，棄去液但不洗，用含一抗的孵育液在4 ℃孵育12～16 h。第2 天用PBS 清洗，按照二抗試劑盒說明書依次加入后續(xù)反應(yīng)液；滴加DAB 顯色液，孵育5 min；蘇木素染核30 s，蒸餾水清洗，后續(xù)常規(guī)脫水、透明并用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.8 Western blotting 檢測VSMCs 成骨樣轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白表達(dá)

在6 孔板中培養(yǎng)各組細(xì)胞，干預(yù)結(jié)束后，每孔加入含1 mmol/L PMSF 的RIPA 蛋白裂解液，吹打均勻后收集裂解液至EP 管中，冰上裂解30 min，期間要上下顛倒EP 管，使之充分裂解；提前預(yù)冷離心機(jī)，4 ℃、12 000 g 離心20 min，取上清至新的EP 管中；加入loading buffer 后在100 ℃水浴中加熱5 min，取含有40 μg 總蛋白的樣品電泳；將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用50 g/L 脫脂牛奶封閉2 h；一抗（α-SMA，1∶1 000；Runx2，1∶300；GAPDH，1∶2 000）孵育過夜；室溫孵育二抗（1∶1 000）40 min 至1 h，ECL 顯色和拍照。利用Image J 軟件對(duì)目的條帶和GAPDH 的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Graph-Pad Prism(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間數(shù)據(jù)比較用One-way ANOVA（≥3 組）統(tǒng)計(jì)方法，非配對(duì)兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MgCit 降低高磷誘導(dǎo)的VSMCs 鈣化

采 用10 mmol/L β-GP 誘 導(dǎo)VSMCs 鈣 化，利 用茜素紅染色半定量各組細(xì)胞的鈣含量。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，細(xì)胞鈣化模型組中鈣含量明顯增加（P＜0.000 1），表現(xiàn)為大量橙紅色物質(zhì)沉積明顯升高；與細(xì)胞鈣化模型組相比，MgCit 干預(yù)組的鈣含量明顯降低（P=0.001 5），且高劑量MgCit 組的鈣含量明顯低于低劑量MgCit組（P=0.000 4，圖1）。

圖1 MgCit 對(duì)高磷誘導(dǎo)的VSMCs 鈣化影響Fig.1 The effects of MgCit on hyperphosphorus-induced VSMCs calcification

2.2 MgCit 抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs 成骨樣轉(zhuǎn)分化

高磷環(huán)境下，VSMCs 鈣化過程中伴隨成骨樣轉(zhuǎn)分化，包括RUNX2和BMP2表達(dá)降低，以及SM22α表達(dá)下降。本研究發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，高磷模型組細(xì)胞發(fā)生成骨樣轉(zhuǎn)分化，包括BMP2 和RUNX2 的mRNA 和 蛋 白 表 達(dá) 升 高、SM22α 的mRNA 表 達(dá) 升高。與高磷模型組相比，MgCit 干預(yù)組的成骨樣轉(zhuǎn)分化水平降低（圖2）。

2.3 MgCit 激活CaSR 抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs 鈣化和成骨樣轉(zhuǎn)分化

鎂是鈣敏感受體（calcium sensing receptor,CaSR）激動(dòng)劑。而研究表明，激活CaSR 能抑制CRF 血管鈣化[9]。在本部分研究中，我們初步探索MgCit抑制高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化的機(jī)制。結(jié)果表明：MgCit能抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs成骨樣轉(zhuǎn)分化和鈣化，但當(dāng)同時(shí)給予CaSR 抑制劑時(shí)，MgCit抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化和成骨樣轉(zhuǎn)分化的作用被部分抑制。與MgCit干預(yù)組相比，MgCit+NPS2143組的細(xì)胞鈣含量（392vs.513 μg/mg蛋白）、ALP活性（193.5vs.258.2 U/mg蛋白）明顯增加（P＜0.001）；Western blotting 提示，MgCit+NPS2143組的RUNX2蛋白表達(dá)量較MgCit干預(yù)組明顯增加，而α-SMA蛋白表達(dá)量明顯降低（圖3）。

圖3 CaSR 抑制劑對(duì)MgCit 抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs 鈣化和成骨樣轉(zhuǎn)分化的影響Fig.3 The effects of CaSR inhibitor on MgCit inhibiting hyperphosphorus-induced osteogenic transdifferentiation and calcification of VSMCs

Control：正常對(duì)照；β-GP：β-甘油磷酸（β-glycerophosphate）；MgCit：枸櫞酸鎂（magnesium citrate）。A、B、C：SM22α、BMP2 和RUNX2 的mRNA 表達(dá)比較；D：RUNX2 和BMP2 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。與正常對(duì)照組（control）比較，aP＜0.05；與β-GP 組比較，bP＜0.05；與β-GP+1.5 mmol/L MgCit 組比較，cP＜0.05。

3 討 論

CRF 患者腎小球?yàn)V過率下降，導(dǎo)致磷排泄受阻，引起高磷血癥。眾所周知，高磷是CRF 患者發(fā)生血管鈣化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高磷誘導(dǎo)VSMCs 鈣化是應(yīng)用廣泛的CRF 鈣化模型。高磷能通過直接和間接途徑促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生發(fā)展：一方面，磷與鈣結(jié)合形成羥基磷灰石，當(dāng)沉積在血管中時(shí)，會(huì)直接引發(fā)血管鈣化；另一方面，高磷通過增加氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，增加促鈣化作用因子分泌等作用，間接促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生發(fā)展[10]。血管鈣化的存在，使得CRF 患者死亡率顯著提高[1]，因此找到有效抑制CRF 血管鈣化的新藥物至關(guān)重要。

基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)補(bǔ)充鎂制劑能抑制CRF 血管鈣化。近期一項(xiàng)雙盲對(duì)照研究以CRF3-4期患者為研究對(duì)象，并隨機(jī)分為對(duì)照組和口服氧化鎂（magnesium oxide, MgO）組，2 年后評(píng)價(jià)這些患者冠狀動(dòng)脈鈣化（coronary artery calcification, CAC）評(píng)分的變化情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，口服MgO 組CAC 積分的變化更低（11.3%vs.39.5%），并且在CAC 積分變化≥15%的人群中，對(duì)照組占62%，而口服MgO 組只占23.9%，表明鎂在抑制CAC 進(jìn)展中有重要作用[11]。RUNX2 是VSMCs 成骨樣轉(zhuǎn)分化指標(biāo)，CRF 環(huán)境下，VSMCs 存在成骨樣轉(zhuǎn)分化，即RUNX2表達(dá)升高，而α-SMA 表達(dá)下降?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，用含腺嘌呤和高磷的飼料飼養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)CRF 血管鈣化模型，同時(shí)給予高鎂飲食的大鼠主動(dòng)脈鈣化水平顯著低于CRF 血管鈣化模型組大鼠；同時(shí)，高鎂飲食組的RUNX2 水平低于鈣化模型組，而α-SMA 水平高于鈣化模型組，這表明鎂通過抑制高磷誘導(dǎo)VSMCs 成骨樣轉(zhuǎn)分化抑制CRF 大鼠血管鈣化[8]。補(bǔ)充含鎂制劑不僅能抑制CRF 相關(guān)血管鈣化，還能抑制非CRF相關(guān)的血管鈣化。例如，Abcc6 基因突變會(huì)導(dǎo)致彈性纖維假黃瘤，該疾病存在全身廣泛異位鈣化，以Abcc6 基因缺失小鼠制備血管鈣化模型，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充含鎂制劑能明顯降低小鼠血管鈣化水平[12]；DBA/2 小鼠常因營養(yǎng)不良發(fā)生心肌鈣化，可能與該品系小鼠血漿鎂水平低有關(guān)系，給該品系小鼠增加飲食中的鎂鹽后，可以降低心臟鈣含量，在一定程度上抑制心肌鈣化[13]。

CaSR 是G 蛋白耦聯(lián)受體C 家族成員，在骨和礦物質(zhì)代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來，CaSR 在心血管疾病中的作用逐漸引起關(guān)注。CaSR 激活能抑制CRF 血管鈣化，而鎂是CaSR 的激動(dòng)劑，活化CaSR能抑制血管鈣化，因此鎂可能通過激活CaSR 發(fā)揮抑制血管鈣化的作用[9]。

本研究通過高磷誘導(dǎo)VSMCs 鈣化模型，給予MgCit 干預(yù)，證明MgCit 能抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs成骨樣轉(zhuǎn)分化和鈣化。當(dāng)給予CaSR 抑制劑后，MgCit 抑制高磷誘導(dǎo)VSMCs 鈣化和成骨樣轉(zhuǎn)分化的能力降低，這表明MgCit 可能通過激活CaSR 發(fā)揮抑制高磷誘導(dǎo)VSMCs 鈣化的作用。本研究利用MgCit干預(yù)高磷誘導(dǎo)VSMCs，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探索，對(duì)探索抑制CRF 血管鈣化的新藥物具有重要意義。當(dāng)然，本研究也存在一定的局限性：①本研究利用高磷誘導(dǎo)VSMCs 鈣化，模擬CRF 血管鈣化模型展開研究，而CRF 血管鈣化是多種因素共同作用的結(jié)果，利用CRF 患者血清進(jìn)行模型誘導(dǎo)可能更符合生理狀態(tài)；②本研究只構(gòu)建VSMCs 鈣化模型，缺少動(dòng)物模型，利用動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更加能說明問題；③本研究利用NPS2143——一種CaSR 抑制劑，對(duì)CaSR 蛋白表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，證明鎂通過激活CaSR 抑制血管鈣化，后續(xù)我們將構(gòu)建CaSR siRNA，從基因水平干預(yù)CaSR，進(jìn)一步證明鎂抑制血管鈣化的機(jī)制。