暗黑鰓金龜堿性磷酸酶HpALP的基因克隆、表達(dá)及其與Bt Cry8Ea3的結(jié)合特性

喬英翠, 趙 丹, 王 哲, 陸秀君,3,*, 郭 巍,2,*, 李瑞軍

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 河北保定 071001; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京 100081;3.河北省核桃工程技術(shù)研究中心, 河北臨城 054300)

暗黑鰓金龜Holotrichiaparallela屬鞘翅目(Coleoptera)鰓金龜科(Melolonthidae)，其幼蟲蠐螬是主要的地下害蟲之一，寄主范圍廣，防治困難(Zhangetal., 2018; Lietal., 2021)。目前常用的化學(xué)防治措施可能對(duì)天敵等非靶標(biāo)昆蟲產(chǎn)生危害，利用病原微生物防治害蟲的生物防治方法具有明顯優(yōu)勢(shì)，并已在農(nóng)林害蟲防治上應(yīng)用。蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)是目前研究最深入的微生物殺蟲劑，為了高效防控暗黑鰓金龜，對(duì)不同的Bt晶體蛋白的殺蟲活性進(jìn)行了篩選和評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，Cry3和Cry8類是對(duì)暗黑鰓金龜有高毒力的Cry蛋白，Cry1類對(duì)鱗翅目害蟲具高毒力而對(duì)鞘翅目暗黑鰓金龜無毒力(H?fte and Whiteley, 1989; 黃穎等, 2018)。Cry8類蛋白中尤以Cry8Ab, Cry8Ea, Cry8Ga和Cry8Na1等對(duì)暗黑鰓金龜具較高的殺蟲活性(Shuetal., 2009; Lietal., 2014)。

Cry蛋白的作用機(jī)制主要有細(xì)胞穿孔和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種模型，Cry類蛋白殺蟲的關(guān)鍵在于其與受體蛋白結(jié)合使昆蟲腸道形成孔洞導(dǎo)致死亡(Beletal., 2020)。目前Cry類蛋白的中腸受體主要有堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、鈣黏蛋白(cadherin,CAD)、氨肽酶N(aminopeptidase N, APN)和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC)及其他中腸蛋白(Zhangetal., 2017)。堿性磷酸酶是一類高度保守的磷酸水解酶，主要分布于柱狀細(xì)胞微絨毛上以及中腸上皮細(xì)胞(袁向東等, 2017)。 目前，堿性磷酸酶ALP作為Cry蛋白的受體已經(jīng)在煙草天蛾Manducasexta、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis、甜菜夜蛾Spodopteraexigua、斜紋夜蛾Spodopteralitura、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、二化螟Chilosuppressalis等多種鱗翅目昆蟲中進(jìn)行了報(bào)道(Qiuetal., 2017; Shuetal., 2017; Renetal., 2018)。 在埃及伊蚊Aedesaegypti、岡比亞按蚊Anophelesgambiae等雙翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)ALP蛋白與不同類型的Cry蛋白結(jié)合并發(fā)揮作用(Batooletal., 2019)。而有關(guān)鞘翅目昆蟲Cry蛋白堿性磷酸酶ALP受體的報(bào)道尚很缺乏，目前僅在黃粉蟲Tenebriomolitor中分離得到與Cry3Aa特異性結(jié)合的ALP蛋白(Zúiga-Navarreteetal., 2013)，并發(fā)現(xiàn)棉鈴象甲Anthonomusgrandis中腸的ALP是Cry1Ba6的受體蛋白(Martinsetal., 2010)。有關(guān)重要農(nóng)業(yè)害蟲暗黑鰓金龜Cry蛋白受體的研究尚不成熟，對(duì)暗黑鰓金龜Cry8Ea3的堿性磷酸酶受體蛋白的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定出cry8Ea及cry1Ab35，并構(gòu)建了相應(yīng)的工程菌株HD8Ea3和HD1Ab35。Cry8Ea3和Cry1Ab35分別對(duì)鞘翅目暗黑鰓金龜、鱗翅目美國(guó)白蛾Hyphantriacunea產(chǎn)生較高毒力，Cry8Ea3對(duì)暗黑鰓金龜1齡第12天幼蟲LC50為103.75 μg/g(王偉, 2017; Zhang, 2017)。為了明確Cry8Ea3蛋白對(duì)暗黑鰓金龜?shù)淖饔脵C(jī)制，本研究利用暗黑鰓金龜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆堿性磷酸酶基因HpALP并在體外進(jìn)行表達(dá)，制備多克隆抗體；對(duì)該基因進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析；將HpALP重組蛋白與Cry8Ea3進(jìn)行體外結(jié)合分析，以期為明確Cry蛋白對(duì)暗黑鰓金龜?shù)淖饔脵C(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

暗黑鰓金龜成蟲采集于河北省保定市蓮池區(qū)軍校廣場(chǎng)，室內(nèi)用榆樹葉片飼養(yǎng)得到蟲卵，孵化后用無毒自制飼料飼養(yǎng)至3齡幼蟲。

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、BL21以及質(zhì)粒pET-30a由本實(shí)驗(yàn)室保存；HD8Ea3和HD1Ab35工程菌株由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存。限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ，T4 DNA連接酶，高保真酶(PrimeSTAR?Max DNA Polymerase)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(cDNA Synthesis Kit)，熒光定量酶(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ)等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京天根生化科技有限公司；羊抗小鼠IgG-AP抗體、羊抗兔IgG-AP抗體均購(gòu)自中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 HpALP的克隆

選取狀態(tài)良好的暗黑鰓金龜3齡幼蟲，置于冰上預(yù)冷3 min，解剖取中腸置于1%焦碳酸二乙酯(DEPC)中，反復(fù)沖洗直至無殘?jiān)捌渌M織，迅速放于液氮中，于-80℃保存?zhèn)溆?。參照?dòng)物組織總RNA提取試劑盒說明書提取暗黑鰓金龜3齡幼蟲中腸RNA。以提取的RNA作模板用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

根據(jù)已知的暗黑鰓金龜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用DNAMAN V6.0設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)BamHⅠ和Hind Ⅲ的特異性引物HpALP-F和HpALP-R(表1)，以暗黑鰓金龜幼蟲中腸cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(25 μL): 中腸cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 2×PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL, 滅菌的ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件: 94℃ 3 min; 95℃ 45 s, 59℃ 45 s, 72℃ 2 min, 30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與pET30a質(zhì)粒進(jìn)行連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，驗(yàn)證正確的重組子送至華大基因測(cè)序。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

下劃線分別為BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。The restriction sites ofBamH Ⅰ andHind Ⅲ are underlined, respectively.

1.3 HpALP的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用DNAMAN V6.0軟件對(duì)HpALP基因序列的開放閱讀框以及編碼氨基酸、蛋白分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用SignalP 5.0 Server(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)和Big-PI Predictor(https:∥mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html)對(duì)信號(hào)肽及GPI錨定位點(diǎn)(glycosylphos-phatidyl-inositol anchor, GPI-anchor)進(jìn)行分析，利用NetOGlyc 4.0 Server(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)和NetNGlyc1.0 Server(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)分別對(duì)O-糖基化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。將得到的HpALP蛋白在NCBI上進(jìn)行Blast，檢索到10種鞘翅目昆蟲即蜂巢小甲蟲Aethinatumida、白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis、光肩星天牛Anoplophoraglabripennis、中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae、玉米根螢葉甲Diabroticavirgifera、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata、食糞金龜Onthophagustaurus、北美螢火蟲Photinuspyralis、米象Sitophilusoryzae和赤擬谷盜Triboliumcastaneum的ALP氨基酸序列，利用ClustalX 和MEGA 5軟件進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 HpALP的原核表達(dá)和抗體制備

將1.2節(jié)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-30a-HpALP轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取重組子，活化培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和PCR驗(yàn)證。篩選出正確的重組菌過夜培養(yǎng)，次日轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600=0.5加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)4, 6和8 h后取樣各1 mL，以未誘導(dǎo)的菌液作為陰性對(duì)照，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離HpALP蛋白，并將HpALP蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以實(shí)驗(yàn)室前期保存的Anti-His抗體為一抗，帶有堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體為二抗，Western blot分析重組蛋白的表達(dá)情況。將HpALP蛋白大量表達(dá)后，利用親和層析方法純化重組蛋白，送至河北省生物研究所制備特異抗體。

1.5 HpALP在暗黑鰓金龜幼蟲組織中的表達(dá)檢測(cè)

參考1.2節(jié)方法分別制備暗黑鰓金龜3齡第2天幼蟲的前腸、中腸、直腸、回腸、馬氏管、脂肪體和體壁等組織的cDNA模板。HpALP及內(nèi)參基因Hpactin的qRT-PCR引物見表1。利用SYBR GREEN法進(jìn)行qRT-PCR，每樣品來自3頭個(gè)體，3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系(20 μL): SYBR(2×)10 μL, cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 滅菌ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。以內(nèi)參基因的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量，利用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Cry8Ea3毒素與HpALP蛋白配體結(jié)合特性分析

活化培養(yǎng)工程菌HD8Ea3，等電點(diǎn)法提取Cry8Ea3毒素蛋白，27℃胰蛋白酶(trypsin)消化1 h活化毒素，活化后得到大小為60 kD的Cry8Ea3毒素蛋白(王偉, 2017)，參考常夢(mèng)穎等(2019)的方法，以同處理對(duì)鱗翅目美國(guó)白蛾高毒力的Cry1Ab35(Zhangetal., 2017)毒素(實(shí)驗(yàn)室保存的活性毒素蛋白)為對(duì)照。將純化的1.4節(jié)制備的HpALP重組蛋白用5×上樣緩沖溶液溶解，分別與2 μg Cry8Ea3和Cry1Ab35活性毒素蛋白孵育1 h，在Cry8Ea3和Cry1Ab35抗體稀釋10 000倍條件下進(jìn)行配體印記實(shí)驗(yàn)，分析HpALP蛋白與Cry8Ea3毒素的結(jié)合特性。

1.7 Cry8Ea3與HpALP的親和力測(cè)定

運(yùn)用ELISA方法，以Cry1Ab35為對(duì)照，分別測(cè)定Cry8Ea3和Cry1Ab35毒素與HpALP重組蛋白的親和力。將1.4節(jié)制備的經(jīng)磷酸鹽緩沖液稀釋為終濃度5 μg/mL的HpALP重組蛋白100 μL加入酶標(biāo)板于4℃包被過夜。次日加入200 μL 1% BSA于37℃封閉1 h后，用TBST/TBS清洗，分別加入濃度為0, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1 000和2 000 nmol/L的Cry8Ea3的活性毒素于37℃孵育1 h，經(jīng)TBST/TBS清洗后，加入一抗(實(shí)驗(yàn)室保存的Cry8Ea3)于37℃孵育1 h，再次用TBST/TBS清洗，加入二抗(AP標(biāo)記羊抗兔)于37℃孵育1 h，經(jīng)pNPP顯色15 min，加入3 mol/L NaOH終止反應(yīng)，使用iMark酶標(biāo)儀在單波長(zhǎng)405 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定。采用同樣方法對(duì)Cry1Ab35與HpALP親和力進(jìn)行測(cè)定(實(shí)驗(yàn)室保存的Cry1Ab35抗體)，計(jì)算Cry8Ea3和Cry1Ab35毒素與HpALP蛋白間解離常數(shù)Kd與最大親和力Bmax。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行整理，利用SPSS Statistics 26.0單因素分析方法進(jìn)行差異顯著性分析。解離常數(shù)Kd、最大親和力Bmax及作圖采用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析整理。

2 結(jié)果

2.1 HpALP基因的克隆及序列特征

PCR擴(kuò)增獲得了HpALP的cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào): MZ004964)，長(zhǎng)1 536 bp，共編碼512個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)分別為57.32 kD和4.70；SignalP 5.0 Server預(yù)測(cè)N端具有17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列；NetNGlyc1.0 Server預(yù)測(cè)N端具有1個(gè)N-連接型糖蛋白的糖基化位點(diǎn)(292N)；NetOGlyc 4.0 Server預(yù)測(cè)有3個(gè)O-糖基化位點(diǎn)(257S，406S，413T)；不具有C端GPI錨定位點(diǎn)。

將暗黑鰓金龜HpALP氨基酸序列與10種鞘翅目ALPs蛋白通過MEGA5分析，結(jié)果顯示，暗黑鰓金龜HpALP氨基酸序列與食糞金龜OtALP(GenBank登錄號(hào): XM 023060601.1)聚為一支，相似性最高，支持率為94%(圖1)。

圖1 基于氨基酸序列構(gòu)建的暗黑鰓金龜與10種鞘翅目昆蟲ALPs的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of ALPs from Holotrichia parallela and 10 Coleoptera insects based on amino acid sequences

2.2 HpALP的原核表達(dá)

重組質(zhì)粒pET-30a/HpALP經(jīng)BamHⅠ單酶切后得到約7 kb大小的條帶；經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后產(chǎn)生的兩片段分別為約5.4 kb的pET-30a載體和約1.5 kb的HpALP的目的基因(圖2)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Western blot結(jié)果表明(圖3)，獲得約60 kD的HpALP重組蛋白，大小與預(yù)期一致，誘導(dǎo)8 h時(shí)表達(dá)量最高。

圖2 pET-30a/HpALP重組質(zhì)粒驗(yàn)證Fig.2 Validation of pET-30a/HpALP recombinant plasmidM: λ-EcoT14 digest; 1: pET-30a/HpALP質(zhì)粒BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切產(chǎn)物Digestion products of pET-30a/HpALP plasmid with BamHⅠ and Hind Ⅲ; 2: pET-30a/HpALP質(zhì)粒BamH Ⅰ單酶切產(chǎn)物Digestion products of pET-30a/HpALP plasmid with BamH Ⅰ; 3: pET-30a; 4: HpALP PCR產(chǎn)物PCR product of HpALP.

圖3 HpALP重組蛋白Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of the recombinantHpALP proteinM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1: 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-30a/HpALP pET-30a/HpALP non-induced by IPTG; 2-4: pET-30a/HpALP經(jīng)IPTG分別誘導(dǎo)4, 6和8 h pET-30a/HpALP induced by IPTG for 4, 6 and 8 h, respectively.

2.3 HpALP基因在暗黑鰓金龜幼蟲不同組織中的表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果表明，HpALP在3齡第2天幼蟲的前腸中豐度最高，在中腸中次之，在直腸和回腸中的表達(dá)量最低，且兩者之間無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

圖4 HpALP基因在暗黑鰓金龜3齡第2天幼蟲不同組織中的表達(dá)譜Fig.4 Expression profiles of HpALP in different tissuesof the day-2 3rd instar larvae of Holotrichia parallela圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示基因表達(dá)量在不同組織間經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著。Data in the figure are mean±SE. Different small letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different tissues (P<0.05, Duncan’s new multiple range test).

2.4 Cry8Ea3和HpALP蛋白的配體結(jié)合特性

配體印記結(jié)果表明，HpALP重組蛋白與Cry8Ea3孵育，出現(xiàn)了57 kD的目的條帶，而同處理的HpALP重組蛋白與對(duì)照Cry1Ab35孵育，未出現(xiàn)條帶(圖5)，表明HpALP與Cry8Ea3能夠特異結(jié)合，推測(cè)HpALP為Cry8Ea3毒素的中腸受體蛋白。

圖5 HpALP重組蛋白與Cry8Ea3和Cry1Ab35的配體印記實(shí)驗(yàn)Fig.5 Ligand blot analysis of Cry8Ea3 and Cry1Ab35 with the recombinant HpALP proteinM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1: HpALP蛋白未與Cry8Ea3蛋白孵育HpALP protein was not incubated with Cry8Ea3 protein; 2: HpALP蛋白與Cry8Ea3蛋白孵育HpALP protein was incubated with Cry8Ea3 protein; 3: HpALP蛋白與對(duì)照Cry1Ab35蛋白孵育HpALP protein was incubated with the control Cry1Ab35 protein.

2.5 Cry8Ea3與HpALP蛋白的親和力

ELISA結(jié)果顯示，活化的Cry8Ea3與HpALP重組蛋白發(fā)生結(jié)合，且結(jié)合存在飽和現(xiàn)象。在Cry8Ea3蛋白濃度為0～500 nmol/L范圍內(nèi)，吸光度隨著Cry8Ea3蛋白濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)Cry8Ea3蛋白濃度大于500 nmol/L時(shí)，二者的結(jié)合近乎飽和狀態(tài)；兩者間的解離常數(shù)Kd值為76.21±26.44 nmol/L，最大親和力Bmax為0.59±0.068(圖6: A)。而對(duì)照組活化的Cry1Ab35與HpALP重組蛋白的解離常數(shù)Kd值為142.50±137.30 nmol/L，Bmax為0.013±0.005(圖6: B)。Cry8Ea3與HpALP重組蛋白的解離常數(shù)Kd值顯著低于Cry1Ab35與HpALP重組蛋白的Kd值，證明Cry8Ea3與HpALP間親和力強(qiáng)。

圖6 Cry8Ea3(A)和Cry1Ab35(B)與HpALP重組蛋白的親和力Fig.6 Affinities of Cry8Ea3 (A) and Cry1Ab35 (B) with the recombinant HpALP protein

3 討論

為了高效防治暗黑鰓金龜幼蟲蠐螬，前期本實(shí)驗(yàn)室得到了暗黑鰓金龜幼蟲蠐螬高毒力蛋白Cry8Ea3基因，并得到了工程菌。為了明確Cry8Ea3對(duì)暗黑鰓金龜幼蟲蠐螬作用機(jī)制，本研究進(jìn)行了Cry蛋白中腸受體蛋白基因的克隆與鑒定工作，克隆得到暗黑鰓金龜HpALP基因并進(jìn)行序列分析；組織表達(dá)譜結(jié)果表明HpALP基因在暗黑鰓金龜3齡第2天幼蟲前腸中表達(dá)量最高(圖4)，而甜菜夜蛾和美國(guó)白蛾的SeALP和HcALP均在中腸中表達(dá)量最高(袁向東等, 2017; 常夢(mèng)穎等, 2019)，而鞘翅目其他昆蟲該類基因的組織表達(dá)差異性相關(guān)研究未見報(bào)道。推測(cè)該類基因的豐度在組織的差異表現(xiàn)可能與物種差異有關(guān)，該基因的分布可能因昆蟲種類不同存在差異。

研究表明，配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定是體外研究蛋白互作的重要技術(shù)，在Cry蛋白與昆蟲中腸受體蛋白互作機(jī)制研究中應(yīng)用廣泛。Hu等(2018)利用這兩種技術(shù)研究推斷小菜蛾P(guān)lutellaxylostella中腸的Cadherin-like(CR7-CR11)蛋白可能是Cry1Ac的受體蛋白;展恩玲等(2017)采用Western blot及配體結(jié)合技術(shù)證實(shí)Polycalin蛋白可能是Cry1Ac 毒素的受體蛋白；王哲等(2020)利用Western blot及配體結(jié)合技術(shù)對(duì)美國(guó)白蛾中腸受體蛋白HcCAD-1, HcCAD-2, HcALP1和HcALP3與Cry2Ab毒素蛋白結(jié)合特性進(jìn)行了研究，推測(cè)可能為Cry2Ab殺蟲蛋白的受體。本研究采用Western blot及配體印記技術(shù)分析了暗黑鰓金龜HpALP與Cry8Ea3毒素蛋白的結(jié)合特性，結(jié)果表明HpALP與Cry8Ea3發(fā)生特異結(jié)合，而與Cry1Ab35不結(jié)合(圖5)，研究結(jié)果為明確Cry8Ea3對(duì)暗黑鰓金龜?shù)淖饔脵C(jī)制提供了材料。

RNAi和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合生物測(cè)定是體內(nèi)研究Cry蛋白中腸受體蛋白的重要手段。Zhang等(2018)利用ELISA及RNAi技術(shù)研究了埃及伊蚊Cry蛋白的受體蛋白，并鑒定得到ALP1中腸受體蛋白，ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ALP與Cry11Aa的結(jié)合，RNAi實(shí)驗(yàn)得到了與ELISA同樣的結(jié)論；Pan等(2017)利用配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和RNAi技術(shù)研究了小菜蛾P(guān)xAPN5蛋白與Cry2Ab蛋白的互作;趙丹等(2021)同樣利用配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)及RNAi技術(shù)證實(shí)了美國(guó)白蛾HcALP3為Cry1Ab35毒素的潛在功能受體。以上研究結(jié)果均表明，受體蛋白與Cry蛋白之間結(jié)合，即可推斷此受體蛋白為Cry蛋白的潛在受體，能夠與體內(nèi)RNAi實(shí)驗(yàn)得出相同的結(jié)論，配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)與ELISA體外研究方法可作為判定是否為Cry蛋白受體的重要依據(jù)。

本研究利用配體印記及ELISA技術(shù)分別分析了HpALP蛋白與Cry8Ea3活化毒素體外結(jié)合特性和親和力，結(jié)果表明Cry8Ea3與HpALP的解離常數(shù)Kd值顯著低于與對(duì)照組Cry1Ab35的，說明HpALP是Cry8Ea3的潛在受體。研究結(jié)果為明確Cry8Ea3對(duì)暗黑鰓金龜作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。由于暗黑鰓金龜一年發(fā)生1代，人工養(yǎng)殖技術(shù)不成熟，尚未進(jìn)行活體相關(guān)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)還需利用RNAi技術(shù)對(duì)HpALP蛋白的功能進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。