ShRNA Piezo1通過VEGF/FGF-2抑制ApoE(-/-)小鼠動脈粥樣硬化形成

王秀玲，王正忠

動脈粥樣硬化（AS）是臨床上常見的疾病之 一，具有發(fā)病率高，危害大等特點(diǎn)[1,2]。AS的發(fā)病始于心血管的內(nèi)膜，先后合并有多種病變，包括局部脂質(zhì)及復(fù)合糖類積聚、纖維組織增生以及鈣質(zhì)沉著而導(dǎo)致斑塊形成，并漸發(fā)生動脈中層退變，其繼發(fā)性病變尚有斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂以及局部血栓形成。病變常常累及大、中肌性動脈，進(jìn)而阻塞動脈管腔，導(dǎo)致所受累動脈所供應(yīng)的組織或者器官的缺血或壞死[3,4]。目前針對AS的預(yù)防與治療尚未找到有效手段，利用基因工程原理，尋求AS形成和發(fā)展的關(guān)鍵基因分子，并通過siRNA干擾技術(shù)進(jìn)行基因沉默，從而特異性的阻斷AS的形成，是一種有效的可行的手段之一。本研究尋找AS發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵分子，利用基因干預(yù)技術(shù)，沉默基因表達(dá)，對于AS的預(yù)防和治療具有重要意義。

Piezo1蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的一種機(jī)械敏感性離子通道蛋白，與機(jī)械牽張應(yīng)力的傳導(dǎo)密切相連，且廣泛表達(dá)于真核細(xì)胞[5,6]。研究表明，機(jī)械敏感性離子通道Piezo1蛋白參與胚胎血管的形成，Piezo1的過度表達(dá)可以促進(jìn)心肌梗死動物中血管的新生，與血管內(nèi)血液的流體力學(xué)密切相關(guān)[7,8]。然而Piezo1蛋白在血管動脈硬化中的作用尚未見報(bào)道。本研究利用ApoE(-/-)小鼠AS模型，構(gòu)建Piezo1的基因沉默載體，小鼠腹腔注射shRNA-38A干擾載體，觀察shRNA-Piezo1對ApoE(-/-)小鼠AS形成的影響，以求為臨床上AS的治療提供新的思路，報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物ApoE基因敲除[ApoE(-/-)]雄性昆明小鼠30只，均購自山東濟(jì)南動物中心，均為SPF級動物，批號為魯05316253777，周齡6～8周，體重25～31 g；基因正常雄性昆明小鼠30只，均購自山東濟(jì)南動物中心，均為SPF級動物，批號：魯05316253001，周齡5～8周，體重24～33 g。

1.2 建立AS模型以ApoE(-/-)小鼠為研究對象，置于SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心，調(diào)節(jié)動物房溫度為（21.45±2.08）℃，濕度為（57.21±5.44）%。飼以高脂飼料，誘導(dǎo)構(gòu)建AS動物模型，模型成功率85%以上。

1.3 shRNA-Piezo1慢病毒載體的構(gòu)建和篩選根據(jù)siRNA干擾載體構(gòu)建的方法，構(gòu)建機(jī)械敏感性離子通道Piezo1蛋白編碼基因Piezo1的干擾載體，利用NCBI基因庫查詢鼠源性Piezo1蛋白的編碼基因Piezo1的序列，Gene ID是234839，位于第8號染色體，基因編碼為NC_000074.6；根據(jù)siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，構(gòu)建siRNA-Piezo1的干擾序列。設(shè)計(jì)3種干擾序列分別為：

shRNA-Piezo1-homo-3299：GCGTCATCATC GTGTGTAAGA；

shRNA-Piezo1-homo-5762：GCCTCAAGTAC TTCATCATCAACT；

shRNA-Piezo1-homo-1875：GCGTCTTCCTT AGCCATTACT；選取上海吉凱公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒載體作為酶切對象，加入shRNA-Piezo1干擾序列后，轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，進(jìn)行克隆測定，質(zhì)粒抽提，慢病毒的包裝備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，將?shí)驗(yàn)動物分成四組，每組10只。其中空白對照組是以健康雄性昆明小鼠為研究對象，給予普通飼料喂養(yǎng)8周，腹腔注射100 μg生理鹽水，1/周，12周后處死。ApoE(-/-)陰性對照組是以ApoE(-/-)小鼠為研究對象，余處理同空白對照組。ApoE(-/-)AS組：以ApoE(-/-)小鼠為研究對象，給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，其余處理同空白對照組。shRNA-Piezo1干預(yù)組是以ApoE(-/-)小鼠為研究對象，給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，造模成功后，腹腔注射100 μg shRNAPiezo1慢病毒載體，1/周，12周后處死。

1.5 RT-PCR檢測成纖維細(xì)胞生長因子-2（FGF-2）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的mRNA表達(dá)水平四組小鼠處死后，解剖小鼠主動脈組織5 mg，加入1 ml的Trizol RNA iso試劑，電動研磨棒進(jìn)行研磨，萃取小鼠主動脈組織的總RNA，TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒處理RNA，將總RNA轉(zhuǎn)成cRNA，4℃保存，TAKARA熒光定量PCR試劑盒。采用FS2000系統(tǒng)對PCR進(jìn)行分析，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；然后95℃ 5 s，60℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溶解曲線：95℃ 5 s；60℃ 1 min。降溫：50℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因GAPDH、FGF-2和VEGF引物由上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)。采用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量（表1）。

表1 目的基因的引物序列

1.6 Western-blot檢測四組小鼠處死后，解剖小鼠主動脈組織5 mg，電動研磨棒進(jìn)行研磨，加入1 ml RIPA細(xì)胞裂解液，各組細(xì)胞在冰上裂解30 min，收集入1.5 ml的離心管中，在預(yù)冷4℃的離心機(jī)中離心，預(yù)設(shè)：5000 r/min，5 min后提取上清，經(jīng)95℃煮沸后，收集蛋白備用。按照說明書制備濃縮膠10 ml，分離膠20 ml。上樣后電泳分離，轉(zhuǎn)膜后在4℃冰箱避光孵育過夜（＞12 h）。經(jīng)一抗稀釋液（Piezo1，F(xiàn)GF-2和VEGF）1:10000稀釋后加入樣本離子膜。第2 d用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，加用山羊抗小鼠IgG二抗經(jīng)二抗稀釋液1:1000稀釋后孵育二抗1.5 h，用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，而后用DAB顯影液處理樣本。Image J軟件可以用來分析蛋白條帶。

1.7 主動脈冰凍切片油紅O染色四組小鼠處死后，解剖小鼠主動脈組織，甲醛-鈣液混合物（40%甲醛和0.1 g氯化鈣組成）固定30 min，PBS沖洗3遍，每次5 min，利用石臘機(jī)制備主動脈石蠟，切片機(jī)切片后，利用40%酒精浸潤30 min，PBS沖洗3遍，每次5 min，60%異丙醇浸潤10 min，PBS沖洗3遍，每次5 min，置于油紅O染液2 min，PBS沖洗3遍，每次5 min，甘油明膠封片，顯微鏡下觀察主動脈血管脂肪部分。

1.8 主動脈冰凍切片蘇木精-伊紅（HE）染色四組小鼠處死后，解剖小鼠主動脈組織，制備石臘，切片機(jī)切片后，利用40%酒精浸潤30 min，PBS沖洗3遍，每次5 min，60%異丙醇浸潤10 min，PBS沖洗3遍，每次5 min，蘇木素染色液染色 5 min，PBS沖洗3遍，每次5 min，伊紅染色液染色90 s，PBS沖洗3遍，每次5 min，中性樹脂封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察斑塊面積及形態(tài)。

1.9 免疫組化染色四組小鼠處死后，解剖小鼠主動脈組織，制備石臘，切片機(jī)切片后，利用40%酒精浸潤30 min，PBS沖洗3遍，每次5 min，60%異丙醇浸潤10 min，PBS沖洗3遍，每次5 min。加入一抗（FGF-2，VEGF）經(jīng)1:500稀釋后，濕盒避光4℃孵育過夜，TBS沖洗3遍，每次5 min，TBS漂洗后加入生物素辣根酶（HPR）標(biāo)記二抗，常溫避光孵育20 min，TBS沖洗3遍，每次5 min，DAB試劑盒孵育5 min，TBS沖洗3遍，每次5 min。光學(xué)顯微下觀察，對VEGF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件19.0版本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?？瞻讓φ战M，ApoE(-/-)陰性對照組，ApoE(-/-)AS組和shRNA-Piezo1干預(yù)組四組的組間比較采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)），組間比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA-Piezo1慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果結(jié)果顯示，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的3種序列siRNA-Piezo1-homo-3299，siRNA-Piezo1-homo-5762和siRNAPiezo1-homo-1875。以293T細(xì)胞為靶細(xì)胞，分別采用10-1，10-2，10-3，10-4μl病毒量進(jìn)行轉(zhuǎn)染，從而選擇最優(yōu)的病毒滴度。結(jié)果顯示，10-1μl慢病毒量轉(zhuǎn)染率最高，病毒滴度為1×108TU/ml，圖1。

圖1 3種序列的基因測序和慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果

2.2 shRNA-Piezo1干擾載體的篩選RT-PCR檢測結(jié)果顯示，shRNA-Piezo1-homo-5762組的mRNA水平要明顯低于shRNA-Piezo1-homo-1875組和shRNA-Piezo1-3299組，比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；另外Western Blot檢測結(jié)果顯示shRNA-Piezo1-homo-5762組的Piezo1蛋白表達(dá)水平要明顯低于shRNA-Piezo1-homo-1875組和shRNA-Piezo1-3299組，比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。本研究選取shRNA-Piezo1-homo-5762作為干擾序列，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，圖2。

圖2 3種序列的shRNA-Piezo1干擾載體的篩選結(jié)果

2.3 各組蘇木精-伊紅（HE）染色結(jié)果主動脈HE染色結(jié)果顯示，空白對照組小鼠主動脈內(nèi)膜和中膜平滑，形態(tài)正常，未見脂肪細(xì)胞浸潤（圖3A）。ApoE(-/-)陰性對照組中小鼠主動脈脂肪細(xì)胞浸潤主動脈內(nèi)膜（如黑色箭頭所示），尚未侵及中膜（圖3B）；ApoE(-/-)AS模型組小鼠主動脈壁內(nèi)膜有粥樣斑塊形成，可見炎性細(xì)胞和泡沫細(xì)胞浸潤（圖3C）；shRNA-Piezo1干預(yù)組小鼠主動脈壁平滑，未見明顯炎性細(xì)胞和泡沫細(xì)胞浸潤（圖3D）；四組小鼠主動脈粥樣硬化斑塊體積所占總體積的百分比見表2，其中，shRNAPiezo1干預(yù)組中主動脈粥樣硬化斑塊體積所占總體積的百分比與ApoE(-/-)AS模型組相比明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖3 蘇木精-伊紅（HE）染色（400×）

表2 各組HE染色主動脈粥樣硬化斑塊面積百分比

2.4 各組主動脈冰凍切片油紅O染色結(jié)果主動脈油紅O染色結(jié)果顯示，空白對照組小鼠主動脈動脈壁內(nèi)膜、中膜形態(tài)正常，未見動脈粥樣斑塊（圖4A）。ApoE(-/-)陰性對照組中小鼠主動脈動脈壁中膜毛糙和斷裂（圖4B）；ApoE(-/-)AS模型組小鼠主動脈壁中膜粗糙，可見大量泡沫細(xì)胞浸潤（圖4C）；shRNA-Piezo1干預(yù)組小鼠主動脈有少許泡沫細(xì)胞浸潤（圖4D）；4組小鼠主動脈粥樣硬化斑塊體積所占總體積的百分比見表3，其中，shRNA-Piezo1干預(yù)組中主動脈粥樣硬化斑塊體積所占總體積的百分比與ApoE(-/-)AS模型組相比明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表3 各組油紅染色主動脈粥樣硬化斑塊面積百分比

圖4 冰凍切片油紅O染色結(jié)果（400×）

2.5 RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果PT-PCR和Western blot結(jié)果顯示： ApoE(-/-)AS模型組中FGF-2的mRNA相對表達(dá)量明顯大于空白對照組（P＜0.05）ApoE(-/-)陰性對照組中主動脈FGF-2的mRNA相對表達(dá)量與空白對照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）； shRNA-Piezo1干預(yù)組中主動脈FGF-2的mRNA相對表達(dá)量與ApoE(-/-) AS模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。ApoE(-/-)AS模型組中VEGF的mRNA相對表達(dá)量明顯大于空白對照組（P＜0.05）；ApoE(-/-)陰性對照組中主動脈VEGF的mRNA相對表達(dá)量與空白對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；shRNA-Piezo1干預(yù)組中主動脈VEGF的mRNA相對表達(dá)量與 ApoE(-/-)AS模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。ApoE(-/-)AS模型組中FGF-2和VEGF蛋白的表達(dá)量明顯大于空白對照組（P＜0.05）；ApoE(-/-)陰性對照組中主動脈FGF-2和VEGF蛋白的表達(dá)量與空白對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；shRNA-Piezo1干預(yù)組中主動脈FGF-2和VEGF蛋白的表達(dá)量與ApoE(-/-)AS模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.6 FGF-2，VEGF的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果結(jié)果顯示，ApoE(-/-)AS模型組中FGF-2和VEGF蛋白的棕色染色較空白對照組明顯增加，shRNAPiezo1干預(yù)組中FGF-2和VEGF蛋白的棕色染色較空白對照組明顯減少（圖6～7）。

圖6 FGF-2的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（DAB染色，400×）

3 討論

圖5 FGF-2和VEGF的mRNA相對表達(dá)量和蛋白灰度值

動脈粥樣硬化（AS）是個(gè)逐漸變化的過程，始于內(nèi)皮細(xì)胞的病變，然后伴隨脂質(zhì)沉積、炎癥細(xì)胞浸潤等密切相關(guān)[9,10]。AS的初始階段是由血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷所引起，在血管血流的刺激下，損傷內(nèi)皮細(xì)胞釋放各種激酶，例如絲裂原活化蛋白激酶，整合素家族分子，受體酪氨酸激酶以及G蛋白等，從而加劇AS的進(jìn)展[11-13]。既往研究表明，血管血流剪切應(yīng)力在AS的進(jìn)展中具有明顯的促進(jìn)作用[14]。因此，尋找力學(xué)信號傳導(dǎo)在AS進(jìn)展中的作用具有重要意義。

圖7 VEGF的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（DAB染色，400×）

機(jī)械敏感性離子通道Piezo1蛋白可以廣泛表達(dá)于真核細(xì)胞，比如軟骨細(xì)胞，髓核細(xì)胞，膀胱上皮細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞等[15-17]。而且，Piezo1對于血管生長發(fā)育具有重要作用，將小鼠敲除Piezo1后，會引起胚胎的死亡，而且在血管發(fā)育中，Piezo1蛋白也具有重要作用，Piezo1蛋白的突變會引起紅細(xì)胞的發(fā)育異常，與鐮狀細(xì)胞綜合癥的發(fā)生密切相關(guān)[18]。另外，在血液流體力學(xué)的刺激下，Piezo1蛋白參與血管的重構(gòu)，且在血管內(nèi)皮細(xì)胞中敲除Piezo1，會引起血管的發(fā)育異常[19]。與之前研究相同，我們發(fā)現(xiàn)在血管動脈粥樣硬化的小鼠模型中，Piezo1蛋白的表達(dá)明顯增加，為探究Piezo1蛋白在AS進(jìn)展中的作用，通過siRNA的干擾載體構(gòu)建原理，構(gòu)建shRNA-Piezo1的干擾載體，沉默Piezo1蛋白的表達(dá)，結(jié)果說明，Piezo1蛋白的表達(dá)與動脈粥樣硬化之間存在一定關(guān)系，表明研究shRNA-Piezo1對動脈粥樣硬化的潛在治療意義。

本研究利用慢病毒作為轉(zhuǎn)染方法，以人胚腎293T細(xì)胞為靶細(xì)胞，篩選有效干擾序列，結(jié)果表明，shRNA-Piezo1-homo-5762組的mRNA水平要明顯低于shRNA-Piezo1-homo-1875組和shRNA-Piezo1-3299組，比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說明，shRNA-Piezo1-homo-5762是有效的干擾序列。另外，shRNA相較于siRNA干擾載體，可以對Piezo1蛋白的表達(dá)持續(xù)抑制，通過腹腔注射AS小鼠模型的方法，探究shRNA-Piezo1對AS小鼠模型的作用。利用HE染色，油紅染色和免疫組織化學(xué)染色方法檢測shRNA-Piezo1對AS的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，shRNA-Piezo1能有效抑制AS，與ApoE(-/-)AS組相比，可明顯抑制動脈中膜斷裂和泡沫細(xì)胞浸潤。說明shRNA-Piezo1對AS具有一定保護(hù)作用。

既往研究表明，生長因子血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF-2）與AS密切相關(guān)，可促進(jìn)血管的新生[20,21]。另外，在AS的進(jìn)展過程中，VEGF首先集聚粥樣斑塊的基底部和中央位置，因?yàn)樵撎幘奘杉?xì)胞較多[22]。而FGF-2與內(nèi)皮細(xì)胞增殖密切相關(guān)。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，F(xiàn)GF-2表達(dá)量增多，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，參與血管的重建，但由于無序的增生，導(dǎo)致血管構(gòu)型的改變，從而進(jìn)一步加重血管壁的狹窄，促進(jìn)動脈中膜的斷裂[23]。本研究推測Piezo1蛋白介導(dǎo)的流體力學(xué)信號可以通過生長因子VEGF和FGF-2的改變，促進(jìn)AS的進(jìn)展，利用RT-PCR，Western Blot和免疫組織化學(xué)染色等方法，檢測VEGF和FGF-2的表達(dá)，結(jié)果顯示相較于空白對照組，ApoE(-/-)AS組中VEGF和FGF-2的表達(dá)明顯增加，而shRNA-Piezo1可明顯抑制VEGF和FGF-2的表達(dá)。我們認(rèn)為，VEGF和FGF-2可能作為機(jī)械敏感性離子通道蛋白Piezo1的下游信號因子存在，介導(dǎo)機(jī)械信號。而利用shRNA基因干擾技術(shù)沉默Piezo1的編碼基因Piezo1后，可抑制VEGF和FGF-2的表達(dá)，從而抑制AS的進(jìn)展。

綜上所述，shRNA-Piezo1可通過抑制VEGF和FGF-2的表達(dá)，抑制AS進(jìn)展，從而起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。