郝建偉,薛春宜,曹永長
(1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系,山西 晉中 030600;2.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/有害生物控制與資源利用國家重點實驗室,廣東廣州 510006)
自2010年起,豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)變異毒株的蔓延對全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大影響,已有的疫苗及免疫策略已不能有效抵抗新型毒株的感染[1-3]。近年來,隨著PEDV疫苗研究的不斷深入,有效的疫苗結(jié)合不同免疫策略研究日益增多[4]。有研究顯示,弱毒疫苗免疫母豬被動保護(hù)仔豬,其仔豬成活率為66.7%~100%[4],其中口服免疫保護(hù)率最高為100%,而肌肉注射保護(hù)率為80%[5-6]。全病毒滅活疫苗免疫母豬,仔豬存活率為80%~100%。有研究表明,肌肉注射方式保護(hù)率(91.7%~100%)[7-8]略優(yōu)于滴鼻免疫(80.0%~86.7%)[9-10]。S蛋白是PEDV重要的保護(hù)性抗原,目前已鑒定的具有中和抗體誘導(dǎo)活性的抗原表位均分布于S蛋白的S1和S2亞基。已有研究采用S蛋白制備亞單位疫苗肌肉注射免疫仔豬,結(jié)果表明,免疫仔豬排毒量顯著降低,腹瀉癥狀明顯減輕,仔豬存活率可達(dá)100%[11-13]。但PEDV粒子纖突蛋白含量較低且易受溫度和p H等因素的影響[14-15]。前期試驗結(jié)果表明,超速離心濃縮病毒易引發(fā)冠狀病毒纖突脫落,降低病毒感染性滴度,而感染性滴度在疫苗免疫保護(hù)中起著重要作用[16]。因此,完整的具備真核生物修飾的S糖蛋白可能是PEDV防控的重要選擇。
PEDV S蛋白的分子量較大,其成功表達(dá)需兼顧蛋白修飾和產(chǎn)量;而原核表達(dá)系統(tǒng)及哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)因缺乏修飾或產(chǎn)量過低而難以有效進(jìn)行表達(dá)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已被證明可用于多種病原抗原肽段的表達(dá),目前,已有多個商業(yè)化產(chǎn)品被用于疫病防控。
由于昆蟲細(xì)胞與哺乳動物細(xì)胞可識別的信號肽種類存在差異,而信號肽又會影響蛋白的表達(dá)效率[17-18]。因此,本研究利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)了PEDV全長S蛋白,并替換了蜂素信號肽的S蛋白,對比了替換信號肽對表達(dá)S蛋白的作用,采用表達(dá)蛋白免疫小鼠分析其免疫效果,旨在為PEDV新型疫苗的研制提供理論依據(jù)。
豬流行性腹瀉病毒變異毒株GDS01[19]由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院有害生物控制與資源利用實驗室分離保存(GenBank登錄號:KM 089829)。小鼠免疫及測定試驗采用6周齡無特定病原菌(Specific pathogens free,SPF)Balb/c小鼠6只,購自中山大學(xué)試驗動物中心(在中山大學(xué)試驗動物中心飼養(yǎng))。
大容量低速冷凍離心機(jī)和超速冷凍離心機(jī)(Beckman公司),H-I微型混合器(上海青浦徐新生化儀器廠),移液器和冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司),電子天平(Sartorius公司),高壓鍋(Hirayama公司),Milli-Q超純水儀(Millipore公司),超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司),梯度PCR儀、電泳儀(Bio-Rad公司),凝膠成像系統(tǒng)和分光光度儀(Syngene公司),脫色搖床(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠),漩渦振蕩器(杭州儀表電機(jī)廠),制冰機(jī)和-20℃冷凍冰柜(日本SANYO公司),電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司),4℃冷藏冰箱(海爾公司,青島),-80℃超低溫冰箱、生物安全超凈工作臺和細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司),顯微鏡(Olympus公司),超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(南京新辰生物科技有限公司),酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司),分散機(jī)(IKA公司)。
TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DL 2000 Marker(Takara公司),Sf 9細(xì)胞培養(yǎng)基、Sf 9無血清培養(yǎng)基SF900II介質(zhì)、DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶和0.25%EDTA胰蛋白酶(GIBCO公司),轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Reagent和Trizol(Invitrogen公司),PVDF膜(Millipore公司),高純度質(zhì)粒純化提取試劑盒(Tiangen公司),瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Axygen公司),蛋白質(zhì)Marker、限制性內(nèi)切酶和連接酶(Fermentas公司),Western-blot無蛋白封閉液(Kem-En-Tec公司),小鼠抗PEDV多抗和HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(實驗室自制),弗氏完全/不完全佐劑(Thermo公司)。其他各種化學(xué)試劑均為Sigma公司產(chǎn)品或國產(chǎn)化學(xué)分析純。
GDS01毒株由中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點實驗室保存,利用Trizol試劑參考說明書提取RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書獲得cDNA模板。Vero細(xì)胞培養(yǎng)按照文獻(xiàn)[9]所述方法操作。利用Signal 4.0軟件預(yù)測S蛋白的信號肽。
設(shè)計PCR引物分別用于擴(kuò)增完整的S序列,去信號肽S基因片段和蜂素信號肽基因引物序列如 表1所示。
表1 引物信息Tab.1 Primer information
將1μg經(jīng)測序驗證的質(zhì)粒加入100μL的DH 10Bac感受態(tài)細(xì)胞,冰浴30 min,42℃熱擊45 s,冰上冷卻3 min,加入900μL SOC液體培養(yǎng)基,37℃220 r/min培養(yǎng)4 h。取出菌液進(jìn)行梯度稀釋,稀釋倍數(shù)分別為10、100、1 000,分別取100μL稀釋后的菌液涂布于含有三抗的LB平板,放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)48 h。挑取平板上的白色菌落,在新的含有慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素3種抗生素LB平板上劃線,于37℃避光培養(yǎng)48 h后挑取單個白色菌落至含有上述3種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃220 r/min培養(yǎng)6 h,取1μL菌液作為模板進(jìn)行PCR檢測。重組Bacmid DNA的提取步驟參考Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus System說明書中推薦方法進(jìn)行。
Sf9昆蟲細(xì)胞生長于Sf9培養(yǎng)基中,在28℃條件下培養(yǎng)。用Cellfectin試劑轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,轉(zhuǎn)染72 h后從細(xì)胞上清液中收取病毒作為第1代重組病毒(P1);轉(zhuǎn)染后收獲的重組病毒經(jīng)過2次傳代后得到第3代重組病毒(P3),用蝕斑法對重組桿狀病毒進(jìn)行純化。
將收集到的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次,反復(fù)凍融3次,后用超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎。超聲破碎后4℃,12 000×g下離心10 min,收集上清液,加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液,沸水煮5 min,上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。陰性對照為經(jīng)相同處理的感染空載體桿狀病毒的Sf9細(xì)胞,通過Western-blot鑒定含蜂素信號肽S重組蛋白。隨后進(jìn)行蛋白的膠內(nèi)酶解。手工切取經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠目的條帶,加入脫色液100μL(50%乙腈,50%mmol/L NH4HCO3)浸 泡,振 蕩20 min,棄 去 脫 色液,重復(fù)脫色1~2次至脫色液透明。加入50μL(10 mmol/L)DTT還原液,56℃作用30 min,棄去還原液,加入100μL乙腈脫水5~10 min,加入50μL(55 mmol/L)碘乙酰胺溶液烷基化,避光作用30 min,棄烷基化液,加入100μL脫色液,洗5~10 min,棄脫色液,凍干膠粒。
將經(jīng)胰酶消化的肽段用AB4800 Plus基質(zhì)輔助激光解析離子吸附-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDITOF-TOF)進(jìn)行分析,一級質(zhì)譜的質(zhì)量掃描范圍為800~3 500 ku,高豐度的母離子通過碰撞誘導(dǎo)解離進(jìn)一步形成離子碎片,質(zhì)譜由標(biāo)準(zhǔn)肽混合物作為外標(biāo)校正,根據(jù)肽質(zhì)量指紋(PMF)和串聯(lián)質(zhì)譜的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白鑒定。
獲得的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用GPS Explore軟件進(jìn)行分析,分析后的每一個樣品的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)再整合成一個文件,使用MASCOT(Version 2.1,Matrix Science,U.K)搜索軟件對本地數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索,鑒定蛋白質(zhì)。
采用pH值為5.89的細(xì)胞裂解緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉,1.0 mmol/L EDTA,0.01%TritonX-100,5%丙三醇)裂解細(xì)胞,超聲破碎后離心去除細(xì)胞碎片,使用Milipore Ultra 100 ku超濾管對收獲液進(jìn)行超濾濃縮,步驟為5 000×g離心30 min。
利用倍比稀釋的BSA制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定S蛋白質(zhì)量,免疫劑量按照小鼠常用劑量確定為100μL/只。按照1∶1的比例將抗原與弗氏佐劑混合乳化完全,樣品存放于4℃保存?zhèn)溆?,弗氏佐劑配制疫苗用于免疫小鼠。小鼠免疫分組情況如表2所示。
表2 小鼠免疫分組及免疫程序Tab.2 Different mouse immunization groups and the program
采用中和試驗方法檢測試驗動物抗體水平[20]。小鼠細(xì)胞因子測定通過ELISPOT試驗檢測IL-4及IFN-γ細(xì)胞因子水平:第1天完成脾淋巴細(xì)胞分離及加入刺激物進(jìn)行培養(yǎng)試驗,按每孔3.0×105個細(xì)胞的細(xì)胞濃度將淋巴細(xì)胞加至活化的ELISPOT板中,每孔100μL。試驗組加入刺激物,設(shè)置正對照孔(加入佛波酯(PMA)2.5μg/mL)、負(fù)對照孔(只加細(xì)胞及培養(yǎng)基)和背景對照孔(不含細(xì)胞只加培養(yǎng)基和檢測試劑)。將ELISPOT板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。
次日檢測細(xì)胞裂解及斑點。傾倒板內(nèi)細(xì)胞及培養(yǎng)基,4℃下放置10 min裂解板內(nèi)細(xì)胞,洗滌5~7次后拍干。將稀釋好的生物素標(biāo)記抗體加入各孔,每孔加入100μL后置于37℃孵育1 h,洗滌5次;將稀釋好的酶標(biāo)親和素工作液按100μL/孔加入后37℃孵育1 h,按上述洗滌方法洗滌5次后各孔加入AEC顯色工作液100μL/孔,37℃避光靜置15 min后傾倒孔內(nèi)液體,打開ELISPOT板底座,用去離子水反復(fù)沖洗正反面終止顯色,將其放置在室溫陰涼處晾干,后用ELISPOT讀板儀進(jìn)行斑點計數(shù)。
利用Signal 4.0軟件對S蛋白信號肽進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1所示。
從圖1可以看出,S蛋白前20個氨基酸為蛋白信號肽,信號肽氨基酸序列為MKSLTYFWLFLP VLSTLSLP。
應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)Bac-to-Bac表達(dá)S蛋白和替換信號肽S蛋白,將S基因和替換信號肽S基因分別插入p FastBacDual質(zhì)粒p H啟動子下,獲得重組質(zhì)粒p FastBacDual-Sph和p FastBacDual-MelSph,利用雙酶切鑒定質(zhì)粒,結(jié)果如圖2-A所示,酶切后載體片段長約5 238 bp,S為4 158 bp,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。送酶切成功的質(zhì)粒至公司測序。質(zhì)粒p FastBacDual-MelSph測序結(jié)果正確,轉(zhuǎn)化DH 10 Bac感受態(tài)細(xì)胞,通過藍(lán)白斑篩選試驗成功獲得含重組質(zhì)粒細(xì)胞,PCR鑒定結(jié)果為陽性質(zhì)粒(圖2-B)。
提取重組質(zhì)粒并計算濃度后,轉(zhuǎn)染單層Sf9細(xì)胞,48 h后顯微鏡觀察細(xì)胞,細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時收獲P1病毒并命名為rB-PEDV S,P1病毒經(jīng)3次噬斑克隆純化后,感染Sf9細(xì)胞,72 h后收集細(xì)胞,用Western-blot法檢測S重組蛋白的表達(dá)(圖3),常規(guī)S蛋白表達(dá)步驟同上。SDS-PAGE膠內(nèi)酶解蛋白分離結(jié)果顯示,成功獲得重組蛋白(圖4),利用MALDI-TOF-TOF分析確認(rèn)S蛋白及替換信號肽S蛋白表達(dá)(表3)。
表3 分離蛋白MALDI-TOF-TOF鑒定結(jié)果Tab.3 MALDI-TOF-TOF identification results of separated protein
用PBS稀釋BSA,得到0.01、0.02、0.04μg/μL共3個質(zhì)量濃度定量溶液;利用SDS-PAGE半定量方法繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線(由于SDS-PAGE分辨率有限,因此該方法僅可用于替換信號肽S重組蛋白的定量)。將替換信號肽S蛋白PAGE數(shù)值代入BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線中,可知S質(zhì)量濃度為0.008 608μg/μL,小鼠每次免疫劑量為0.86μg/只。
免疫后采集血清測定中和抗體效價,結(jié)果顯示,替換信號肽S蛋白免疫組與PBS組并無明顯差異;2種細(xì)胞因子測定結(jié)果顯示,替換信號肽S蛋白免疫組小鼠IFN水平略高于PBS組,與未濃縮病毒免疫組相似,而免疫S蛋白小鼠IL-4水平則高于PBS免疫組(圖5)。
纖突蛋白是冠狀病毒主要的抗原蛋白,新型疫苗往往以該蛋白作為目標(biāo)抗原進(jìn)行深入研究。PEDV作為冠狀病毒家族成員之一,其成功預(yù)防同樣依賴S蛋白的參與。S蛋白是保持病毒感染性及良好抗原性的關(guān)鍵因素,但由于其占病毒蛋白含量比例較低且易脫落,常導(dǎo)致疫苗質(zhì)量難以得到很好控制;同時,PEDV培養(yǎng)困難,病毒滴度難以提升更加減少了有效抗原含量。PEDV S蛋白分子質(zhì)量約為180 ku,巨大的分子質(zhì)量常常導(dǎo)致其難以表達(dá)。本研究在采用昆蟲桿狀表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)完整S蛋白的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析利用易被昆蟲細(xì)胞識別的蜂素信號肽替換原有信號肽,結(jié)果表明,替換信號肽后S蛋白表達(dá)量上升。
S蛋白具有跨膜區(qū),表達(dá)后會錨定在細(xì)胞膜上。本研究通過收集感染重組病毒的病變細(xì)胞,使用細(xì)胞裂解液破碎細(xì)胞釋放表達(dá)蛋白,進(jìn)一步超聲破碎后離心去除細(xì)胞碎片,結(jié)果顯示,蛋白純度雖有較大提升,但是由于中間步驟過多等原因未達(dá)到濃縮蛋白的目的。
利用S蛋白制備疫苗免疫小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),S蛋白可激發(fā)小鼠產(chǎn)生IL-4,其他免疫指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)差異,其原因可能主要有2個方面:一方面,蛋白分子量過大導(dǎo)致難以高效表達(dá),導(dǎo)致疫苗免疫劑量不足。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)啟動子均為極晚期啟動子,目的蛋白的表達(dá)時間段為細(xì)胞病變明顯時,此時細(xì)胞已呈現(xiàn)病理狀態(tài),多種輔助蛋白翻譯因子的缺失會影響目的蛋白的表達(dá)。有文獻(xiàn)報道,真核起始因子4e(eIF4e)與目的蛋白共表達(dá)會提升蛋白產(chǎn)量[18]。本研究也嘗試在p FastBacDual質(zhì)粒的p10啟動子中連入eIF4e,結(jié)果顯示,目的蛋白表達(dá)量并未提升。此外,有研究提到優(yōu)化起始密碼子周圍序列有助于蛋白表達(dá)[21],本研究利用重疊PCR將Kozak序列克隆至目的序列的5′端,結(jié)果顯示,蛋白表達(dá)量無明顯提升,僅當(dāng)S信號肽替換為可被昆蟲細(xì)胞識別的蜂素信號肽時蛋白表達(dá)有所提升。另一方面,SARS及IBV等病毒的免疫研究顯示,冠狀病毒的免疫保護(hù)易受多種因素影響。要成功地預(yù)防控制就需依賴成熟的病毒粒子,單獨的S蛋白可能難以有效激發(fā)產(chǎn)生良好的保護(hù)[22]。此外,蛋白的純化過程中殘留的雜蛋白也可能會對免疫效果產(chǎn)生影響。
綜上所述,本研究聚焦于提高PEDV S蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示,當(dāng)采用蜂素信號肽替換原有信號肽時,可提升蛋白表達(dá)量。小鼠細(xì)胞因子測定結(jié)果表明,在以0.86μg/只劑量免疫時可有效激發(fā)小鼠體內(nèi)IL-4產(chǎn)生。后續(xù)應(yīng)以桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的S蛋白免疫仔豬進(jìn)行進(jìn)一步的研究。